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噬菌体展示HIV-1 Tat38-61碱性区51和55位随机突变体文库的构建

生物工程学报 2011年第5期27卷 755-763页

作者：葛宜兵杨旭芳杜哲明庞强曹洁陈秋莉王锦红张华群廖文婷祁培培刘超章萍萍邓松华潘卫安徽医科大学病理生理学教研室合肥230032 中国人民解放军第二军医大学微生物学教研室上海200433 武警江西总队医院外一科南昌330000

为了构建噬菌体展示Tat38-61(51N/55N)碱性区突变体文库,进一步研究HIV-1 Tat38-61表位的分子进化筛选,采用含随机核苷酸序列的引物,通过Overlap PCR的方法获得51和55位氨基酸随机突变的全长Tat编码序列,再以此为模板PCR扩增出两端含有X... 详细信息

为了构建噬菌体展示Tat38-61(51N/55N)碱性区突变体文库,进一步研究HIV-1 Tat38-61表位的分子进化筛选,采用含随机核苷酸序列的引物,通过Overlap PCR的方法获得51和55位氨基酸随机突变的全长Tat编码序列,再以此为模板PCR扩增出两端含有Xba I识别序列的Tat38-61突变体片段HIV-1 Tat38-61(51N/55N),克隆至噬菌体展示载体pCANTAB5S上,转化大肠杆菌TG1,经M13K07辅助噬菌体拯救,构建噬菌体展示Tat38-61(51N/55N)碱性区突变体文库。结果显示文库的库容量为5.0×106,滴度为2.65×1012 TU/mL,阳性克隆率为56.50%;序列分析显示文库中51、55位核苷酸与氨基酸均呈随机性分布,达到了对文库进行分子进化筛选的要求,为获得可用作疫苗候选物的新型Tat突变体奠定基础。

关键词： HIV-1 Tat 碱性区随机突变噬菌体展示

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新型甲型H1N1流感病毒HA基因DNA疫苗诱导小鼠产生中和抗体

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中华微生物学和免疫学杂志 2010年第12期30卷 1114-1117页

作者：邵圣文周洪昌徐伯赢刘小青方静王岳陈志辉湖州师范学院医学院微生物学教研室 313000 第二军医大学微生物学教研室中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所、分子病毒与遗传工程国家重点实验室第二军医大学长海医院感染科上海200433

目的探讨新型甲型流感病毒（2009H1N1）血凝素（HA）DNA疫苗诱导小鼠产生中和抗体特性.方法构建2009H1N1或1918甲型流感病毒（1918H1N1）HA蛋白表达质粒2009HA和1918HA,采用25μg或200μg剂量2009HA质粒免疫小鼠,以2009HA或1918HA蛋... 详细信息

目的探讨新型甲型流感病毒（2009H1N1）血凝素（HA）DNA疫苗诱导小鼠产生中和抗体特性.方法构建2009H1N1或1918甲型流感病毒（1918H1N1）HA蛋白表达质粒2009HA和1918HA,采用25μg或200μg剂量2009HA质粒免疫小鼠,以2009HA或1918HA蛋白为包被抗原,测定小鼠血清中2009HA抗体总量或交叉反应抗体含量,分别用2009H1N1和1918H1N1两种假病毒（pp）测定抗体中和活性.结果 25 μg或200μg的2009HA质粒加强免疫小鼠后,4～16周内两组小鼠血清中2009HA总抗体水平以及对2009H1N1pp的中和抗体滴度相似（P〉0.05）,都含有与1918HA蛋白交叉反应抗体,对1918H1N1pp的交叉中和抗体滴度相似（P〉0.05）.结论小剂量2009HA质粒DNA疫苗能够诱导小鼠产生持久的高水平中和抗体,对于预防新现流感病毒具有潜在应用价值.

关键词：新型甲型流感病毒血凝素 DNA疫苗中和抗体假病毒

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IgA亲和体随机组合噬菌体文库的构建和体外分子进化

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第二军医大学学报 2010年第1期31卷 1-6页

作者：温宗梅曹洁陈秋莉贾建安蒋少华潘卫第二军医大学基础部微生物学教研室上海200433 同济大学医学院附属上海市肺科医院麻醉科上海200433

目的构建IgA亲和体随机组合文库并进行体外分子进化,研究IgA亲和体分子结构与功能的关系。方法基因合成两个IgA亲和体片段。3′端引入3个随机连接肽序列随机连接,克隆于噬菌粒展示载体pCANTAB5S,构建噬菌体展示随机组合分子文库。以人Ig... 详细信息

目的构建IgA亲和体随机组合文库并进行体外分子进化,研究IgA亲和体分子结构与功能的关系。方法基因合成两个IgA亲和体片段。3′端引入3个随机连接肽序列随机连接,克隆于噬菌粒展示载体pCANTAB5S,构建噬菌体展示随机组合分子文库。以人IgA为靶分子对该文库进行4轮亲和筛选。制备阳性筛选克隆的单克隆噬菌体,用ELISA鉴定IgA结合活性。结果成功构建噬菌体展示IgA亲和体随机组合分子文库,库容量为3.4×107,滴度为1.6×1012TU/L,阳性克隆占79%以上,序列分析IgA亲和体随机连接,随机连接肽序列呈随机分布。在人IgA分子诱导的分子进化过程中,展示多个IgA亲和体串联体的噬菌体比例明显增加,获得3种新型IgA亲和体组合分子结构形式:IgA亲和体二联体、三联体和四联体。ELISA结合实验表明IgA亲和体三联体和四联体的IgA结合能力远大于单体和二联体。结论通过构建IgA亲和体噬菌体展示随机组合文库和体外分子进化的方法,获得多种新型组合分子,其中IgA亲和体三联体和四联体的IgA结合能力明显增加,提示通过有效的分子进化成功地获得了高亲和力的IgA结合分子。

关键词：肽库免疫球蛋白A亲和体串联重复序列亲和力分子进化

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ELISA方法检测肝癌血清标志物的应用

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中国生物制品学杂志 2010年第3期23卷 307-309页

作者：王文王锦红缪晓辉 Mark A Feitelson 戚中田第二军医大学微生物学教研室上海市医学生物防护重点实验室上海200433 上海长征医院感染科上海200003 Department of Biology College of Science and TechnologyTemple University

目的对已建立的肝癌血清标志物ELISA检测方法进行扩大规模临床样本检测,进一步评价和优化该方法。方法利用本实验室建立的肝癌血清标志物ELISA检测方法,对407份肝病患者血清和95份正常献血员血清进行检测,并对检测结果进行分析。结果324... 详细信息

目的对已建立的肝癌血清标志物ELISA检测方法进行扩大规模临床样本检测,进一步评价和优化该方法。方法利用本实验室建立的肝癌血清标志物ELISA检测方法,对407份肝病患者血清和95份正常献血员血清进行检测,并对检测结果进行分析。结果324份HBV感染后的肝癌、肝硬化及肝炎患者血清样本中,2种或2种以上指标阳性比例分别为77.6%、76.1%和52.5%,肝癌患者3种或3种以上指标阳性比例较肝硬化和肝炎患者分别高39.9%和310%;在正常献血员、药物性肝炎、酒精性肝炎及其他类型的癌症患者中,87.5%～100%的患者肝癌血清标志物分子≤1种;URG7是最早出现的抗体阳性标志物分子,URG11和S15a抗体则在进展后期或已发展为肝癌的患者血清中呈优势比例出现。结论5种肝癌血清标志物分子与肝癌发生的风险呈正相关,已建立的肝癌血清标志物ELISA检测方法可用于肝癌高危人群的筛选及小肝癌的早期诊断,作为目前AFP和MRI诊断方法的有益补充。

关键词：肝癌血清标志物 ELISA

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改良碘量法快速测定地震灾区饮水消毒中的有效氯含量

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中国卫生检验杂志 2010年第3期20卷 531-532,569页

作者：阮芳铭左晋桐沈志雷周利梅俞镔炯朱时应曹广文张迁常文军第二军医大学海军医学系军队卫生学教研室上海200433 空军青岛航空医学鉴定训练中心山东青岛266071 第二军医大学基础部微生物学教研室上海200433 第二军医大学基础部流行病学教研室上海200433 第二军医大学长海医院感染科上海200433

目的：研究与验证改良碘量法快速测定地震灾区饮水消毒中有效氯含量的效果。方法：取漂白粉精片、二氯异氰尿酸钠和三氯异氰尿酸消毒液各3个样品,每一样品的有效氯含量按本法各测定5次,以此进行精密度试验;另各取10份同一漂白粉精片和... 详细信息

目的：研究与验证改良碘量法快速测定地震灾区饮水消毒中有效氯含量的效果。方法：取漂白粉精片、二氯异氰尿酸钠和三氯异氰尿酸消毒液各3个样品,每一样品的有效氯含量按本法各测定5次,以此进行精密度试验;另各取10份同一漂白粉精片和二氯异氰尿酸钠消毒液,分别用本法和国标碘量法测定其有效氯含量,比较两种方法的测定结果。结果：精密度平行对照实验显示,测定3种不同含氯消毒剂有效氯含量（%）,其标准差（SD）和相对标准偏差（RSD）分别为：SD=±0.27～0.42,RSD=0.73%～1.12%（漂白粉精片）、SD=±0.35～0.57,RSD=0.86%～1.40%（二氯异氰尿酸钠）和SD=±0.42～0.65,RSD=0.80%～1.25%（三氯异氰尿酸）;本法与国标碘量法比较,两者测定结果的均值经t检验无显著性差异（P0.05）。结论：本法测定结果的精确度与国标碘量法基本一致,适用于平时及野外特殊条件下饮水消毒中有效氯含量的测定。

关键词：有效氯含量测定结果碘量法地震二氯异氰尿酸钠三氯异氰尿酸含氯消毒剂漂白粉饮水消毒两种方法

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丙型肝炎疫苗的研究进展与挑战

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国际生物制品学杂志 2010年第4期33卷 180-186页

作者：刘文宇(综述) 戚中田(综述) 第二军医大学附属长征医院学员队上海200003 第二军医大学微生物学教研室上海市医学生物防护重点实验室上海200433

丙型肝炎病毒（hepatitis C vires,HCV）是具有高度基因变异性的RNA病毒,恢复期患者或黑猩猩再次暴露于不同型（株）病毒时可发生再感染.因此,研发HCV疫苗存在着巨大的挑战.HCV预防性疫苗黑猩猩体内研究证实,诱导并保持针对多个病毒表... 详细信息

丙型肝炎病毒（hepatitis C vires,HCV）是具有高度基因变异性的RNA病毒,恢复期患者或黑猩猩再次暴露于不同型（株）病毒时可发生再感染.因此,研发HCV疫苗存在着巨大的挑战.HCV预防性疫苗黑猩猩体内研究证实,诱导并保持针对多个病毒表位的辅助T细胞和细胞毒性T细胞（cytotoxic T-lymphocyte,CTL）的免疫应答,是清除病毒和防止慢性感染的必要环节.多特异性B细胞应答可快速诱导产生交叉中和抗体,这些抗体有助于细胞免疫应答.此文总结候选HCV疫苗在分子病毒学和抗病毒免疫应答中的研究进展,并就疫苗在黑猩猩和HCV感染者的体内试验研究进行综述.

关键词：丙型肝炎病毒抗体疫苗模型,动物

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丙型肝炎病毒E2蛋白HVR1在体液免疫应答中的作用

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中华微生物学和免疫学杂志 2009年第8期29卷 714-715页

作者：乐爱平陈志辉童一民邵圣文南昌大学第一附属医院输血科 330006 第二军医大学长海医院感染科第二军医大学微生物学教研室湖州师范学院医学院创新实验室

丙型肝炎病毒（HCV）感染是肝硬化、肝癌的高危险因素，目前尚无HCV疫苗上市。HCV包膜E2蛋白能诱导机体产生中和抗体，是重要的候选疫苗成分。E2蛋白氨基末端由27个氨基酸残基组成的高变区1（hypervariable region1，HVR1）含有多个线... 详细信息

丙型肝炎病毒（HCV）感染是肝硬化、肝癌的高危险因素，目前尚无HCV疫苗上市。HCV包膜E2蛋白能诱导机体产生中和抗体，是重要的候选疫苗成分。E2蛋白氨基末端由27个氨基酸残基组成的高变区1（hypervariable region1，HVR1）含有多个线性中和抗体表位，变异频率极高，增加了HCV疫苗研制的难度。近年发现，除了HVR1含有中和抗体表位外，E2蛋白还存在其他的保守空间构象和线性中和抗体表位心。本研究构建了羧基端截短的含有HVR1和缺失HVR1的E2蛋白真核表达质粒，以之免疫小鼠，分析HVR1在E2蛋白诱导的小鼠体液免疫应答中的作用。

关键词：体液免疫应答丙型肝炎病毒 E2蛋白 HVR1 HCV疫苗氨基酸残基抗体表位真核表达质粒

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合成多肽抗原检测原发性肝癌血清标志物ELISA方法的建立及应用

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中国生物制品学杂志 2009年第4期22卷 399-401页

目的建立用合成多肽抗原检测原发性肝癌血清标志物的ELISA方法,并进行初步应用。方法利用筛选的5种与乙型肝炎病毒X抗原(HBx)诱导肝癌相关的细胞蛋白URG4、URG7、URG11、S15a和Sui1,作为原发性肝癌的筛查和早期诊断的血清标志物,根据上... 详细信息

目的建立用合成多肽抗原检测原发性肝癌血清标志物的ELISA方法,并进行初步应用。方法利用筛选的5种与乙型肝炎病毒X抗原(HBx)诱导肝癌相关的细胞蛋白URG4、URG7、URG11、S15a和Sui1,作为原发性肝癌的筛查和早期诊断的血清标志物,根据上述蛋白的序列合成多肽(L4A/L4B、L7B、L11-1/L11-3/L11-4、L12A/L12B和Sui1A/Sui1B),作为检测抗原,建立检测相应抗体的间接ELISA法,并进行敏感性、特异性、精密性评价及临床应用。结果所建立的间接ELISA法敏感性为93.8%,特异性为97.9%,试验内和试验间变异系数分别为3.8%～5.6%和7.4%～10.3%;检测161份肝癌、肝硬化及乙型肝炎患者血清样本中,1种指标以上阳性检出率分别为90.4%、92.6%和61.7%,2种指标以上阳性检出率分别为78.6%、70.6%和48.3%;39份正常献血员血清中,1种指标以上阳性检出率为12.2%,2种指标以上阳性检出率为6.3%。结论所建立的ELISA法可作为目前的AFP和核磁共振诊断方法的有益补充,用于原发性肝癌高危人群的筛选和小肝癌的早期诊断。

关键词：肝癌乙型肝炎病毒X抗原多肽血清标志物 ELISA

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丙型肝炎患者血清中HCV交叉中和抗体的检测

丙型肝炎患者血清中HCV交叉中和抗体的检测

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第十次全国生物制品学术会议

作者：陈志辉童一民赵平戚中田第二军医大学长海医院感染科，上海 200433 第二军医大学微生物学教研室，上海 200433

目的：分析HCV感染者血清中是否存在交叉反应性中和抗体。方法：以分泌表达HCV包膜E2蛋白真核表达质粒转染的293T细胞培养上清液中的HCV E2蛋白作为检测抗原，建立检测HCV E2抗体的ELISA方法，检测32份HCV抗体阳性的慢性丙肝患者血... 详细信息

目的：分析HCV感染者血清中是否存在交叉反应性中和抗体。方法：以分泌表达HCV包膜E2蛋白真核表达质粒转染的293T细胞培养上清液中的HCV E2蛋白作为检测抗原，建立检测HCV E2抗体的ELISA方法，检测32份HCV抗体阳性的慢性丙肝患者血清，然后用免疫荧光分析血清与HCV全长包膜蛋白表达质粒转染的293T细胞的结合反应，再用5株HCV假病毒(HCVpp)及两株细胞培养产生的HCV(HCVcc)为模型分析血清的病毒中和活性。结果：32份HCV抗体阳性血清中，26份血清可检测出E2抗体，阳性率81.3％。其中HCV RNA阳性的12份血清均为E2抗体阳性，E2抗体水平与HCV RNA水平呈负相关。HCV E2抗体阳性血清对5株HCVpp以及两株HCVcc的感染性均有不同程度的中和作用，中和活性与E2抗体水平相平行。结论：HCV感染可诱导保护性体液免疫应答，丙肝患者血清中存在交叉中和抗体，提示开发能诱导广泛交叉中和抗体的丙肝疫苗具有可行性。

关键词：丙型肝炎病毒丙型肝炎中和抗体真核表达质粒转染

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丙型肝炎病毒包膜E2蛋白DNA疫苗主要诱导HVR1中和抗体

丙型肝炎病毒包膜E2蛋白DNA疫苗主要诱导HVR1中和抗体

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中国医师协会输血分会2009年第三届输血学术年会

作者：乐爱平陈志辉童一民邵圣文南昌大学第一附属医院输血科南昌330006 第二军医大学长海医院感染科上海200433 第二军医大学微生物学教研室上海200433 湖州师范学院医学院创新实验室湖州313000

目的：探讨HCV包膜E2蛋白DNA疫苗诱导小鼠产生中和抗体的可行性。方法：构建HCV包膜蛋白截除疏水性羧基末端的表达质粒pcDNA3-1-1b661以及同时截除疏水性羧基末端和高变区1(HVR1)的表达质粒pcDNA3.1-1b661△，转染293T细胞，以Weste... 详细信息

目的：探讨HCV包膜E2蛋白DNA疫苗诱导小鼠产生中和抗体的可行性。方法：构建HCV包膜蛋白截除疏水性羧基末端的表达质粒pcDNA3-1-1b661以及同时截除疏水性羧基末端和高变区1(HVR1)的表达质粒pcDNA3.1-1b661△，转染293T细胞，以Western blot和ELISA检测细胞内和培养上清中的HCVE2蛋白，将2种表达质粒以及空载体分别肌注免疫BALB/c小鼠，检测小鼠血清的E2及HVR1抗体，以HCV假病毒模型分析小鼠血清的中和活性。结果：2种E2表达质粒均能有效表达HCV E2蛋白，缺失HVR1不影响E2蛋白的表达和分泌。两种质粒免疫均可有效诱导小鼠的体液免疫应答，但pcDNA3.1-1b661免疫血清对HCV假病毒颗粒(HCVpp)的中和活性明显高于pcDNA3.1-1b661△免疫血清。pcDNA3.1-1b661免疫血清中的HVR1抗体量仅占总E2抗体的一小部分，却是中和抗体的重要成分。结论：表达E2蛋白的DNA疫苗能有效诱导HCV中和抗体的产生，HVR1不仅是重要的中和抗体表位，而且能增强E2蛋白其他抗原表位的抗体应答。

关键词：丙型肝炎病毒 HCV包膜E2蛋白 DNA疫苗中和抗体诱导表达

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