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中华微生物学和免疫学杂志 2004年第8期24卷 591-594页

作者：柯金山赵平张景熙秦照玲于嘉屏戚中田第二军医大学附属长征医院实验诊断科上海200003 第二军医大学微生物学教研室上海200433 第二军医大学长海医院呼吸科

目的　了解SARS冠状病毒 (SARS CoV)核衣壳蛋白 (N蛋白 )的抗原性及其基因疫苗的免疫原性。方法　用大肠杆菌表达SARS CoV的N蛋白 ,用SARS患者恢复期血清对其进行抗原性鉴定。再构建N蛋白基因疫苗 ,肌肉注射接种小鼠 ,检测小鼠血清中的... 详细信息

目的　了解SARS冠状病毒 (SARS CoV)核衣壳蛋白 (N蛋白 )的抗原性及其基因疫苗的免疫原性。方法　用大肠杆菌表达SARS CoV的N蛋白 ,用SARS患者恢复期血清对其进行抗原性鉴定。再构建N蛋白基因疫苗 ,肌肉注射接种小鼠 ,检测小鼠血清中的抗N蛋白IgG抗体、脾细胞增殖和迟发型超敏反应。结果　大肠杆菌重组表达的SARS CoVN蛋白具有强抗原性 ,其基因疫苗能在小鼠有效诱导N蛋白特异性抗体和CD4 + 、CD8+ T淋巴细胞免疫应答。结论　SARS CoV的N蛋白可作为重要的SARS血清学诊断抗原 ,并对于SARS的特异性预防和治疗有潜在的应用价值。

关键词： SARS-CoV核衣壳蛋白抗原性基因免疫基因疫苗 SARS冠状病毒

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Ad-VEGI_(151)对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

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第二军医大学学报 2005年第9期26卷 1006-1008页

作者：刘银萍柳林潘欣徐琪潘东艳第二军医大学长海医院眼科上海200433 第二军医大学微生物学教研室上海200433

目的:研究以复制缺陷型重组腺病毒为载体的血管内皮细胞生长抑制因子基因(VEGI151)对静脉内皮细胞的增殖抑制作用。方法:利用腺病毒载体pCA13构建携带VEGI151基因的质粒,经293A细胞包装、扩增,Western印迹法检测病变细胞内基因的蛋白质... 详细信息

目的:研究以复制缺陷型重组腺病毒为载体的血管内皮细胞生长抑制因子基因(VEGI151)对静脉内皮细胞的增殖抑制作用。方法:利用腺病毒载体pCA13构建携带VEGI151基因的质粒,经293A细胞包装、扩增,Western印迹法检测病变细胞内基因的蛋白质表达。X-gal染色测定重组腺病毒载体系统的基因转移效率,结晶紫染色法检测细胞D570/630值,观察Ad-VEGI151对ECV304细胞增殖抑制作用的效果,免疫组织化学检测ECV304细胞内VEGI151基因的蛋白质表达。结果:应用细胞内质粒DNA同源重组法,将脂质体介导质粒pCA13-VEGI151与pJM17共转染293A细胞制备重组腺病毒,所获病毒滴度高,是一种制备重组腺病毒切实可行的方法。Ad-VEGI151在病变细胞内能成功表达蛋白,具有较高的基因转移效率,对静脉内皮细胞的增殖具有强烈的抑制作用,并能在靶细胞内表达有生物学活性的蛋白质。结论:以复制缺陷型重组腺病毒为载体的VEGI151基因能在靶细胞内表达具有生物学活性的蛋白质,抑制体外静脉内皮细胞的增殖,这为进一步肿瘤及新生血管性疾病的基因治疗提供了新的方法。

关键词：血管内皮细胞生长抑制因子基因治疗腺病毒载体

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新型血管生成抑制人内皮细胞抑制素血管内皮细胞生长抑制因子_(151)治疗胃癌的实验研究

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中华实验外科杂志 2005年第2期22卷 230-234,F003页

作者：李喆方国恩闻兆章华积德曹贵松毕建威戚中田潘卫第二军医大学附属长海医院普通外科上海200433 第二军医大学微生物学教研室

目的　研究重组腺病毒表达的人内皮细胞抑制素血管内皮细胞生长抑制因子151(hENDO VEGI151)融合蛋白对胃癌的抑制作用。方法　构建携带hENDO VEGI151融合基因的重组腺病毒载体 ,脂质体介导法包装重组腺病毒AdIL 3 /hENDO VEGI151。体... 详细信息

目的　研究重组腺病毒表达的人内皮细胞抑制素血管内皮细胞生长抑制因子151(hENDO VEGI151)融合蛋白对胃癌的抑制作用。方法　构建携带hENDO VEGI151融合基因的重组腺病毒载体 ,脂质体介导法包装重组腺病毒AdIL 3 /hENDO VEGI151。体外检测融合基因的表达及融合蛋白的生物学活性。应用鸡胚绒毛尿囊膜 (CAM )模型及荷人胃癌裸鼠模型 ,进一步观察融合蛋白对活体血管生成的影响和融合基因治疗活体胃癌的疗效。结果　用TCID50 法测定携带融合基因的重组腺病毒滴度为 4.2× 10 11TCID50 /ml;用聚合酶链反应 (PCR)、逆转录 (RT) PCR和免疫组织化学方法证实融合基因可被转导入SGC 790 1细胞内并稳定高效地转录和表达 ;Westernblot显示融合蛋白可被分泌到胞外发挥作用 ;融合蛋白可强烈抑制ECV 3 0 4细胞生长及鸡胚绒毛尿囊膜新生血管形成。AdIL 3 /hENDO VEGI151治疗可强烈抑制裸鼠体内种植瘤生长 ,明显下调肿瘤微血管密度 ,促进胃癌细胞凋亡。结论　hENDO VEGI151是一条新型强效的肿瘤血管生成抑制基因 ,其表达产物可能通过作用于肿瘤新生血管形成的不同环节强烈抑制新血管生成和肿瘤生长 ,值得进一步研究。

关键词：治疗融合基因胃癌人内皮细胞融合蛋白血管内皮细胞重组腺病毒 VEGI 生长抑制因子血管生成抑制

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携带HSV－tk基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体的构建

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第二军医大学学报 1996年第2期17卷 101-104页

作者：高军曹广文戚中田仇小芳吴宗娣杜平杨文国崔龙第二军医大学基础医学部微生物学教研室第二军医大学长海医院普通外科

构建携带单纯疱疹病毒ｔｋ基因（ＨＳＶ－ｔｋ）的人肝癌特异性逆转录病毒载体。方法和结果：切除逆转录病毒载体ｐＭＮＳＭ内部的ＳＶ４０启动子使之成为ｐＭＮＭ；从真核表达载体ｐＢＰＧＫ－ｔｋ质粒中游离带有磷酸甘油酸激酶基因（... 详细信息

构建携带单纯疱疹病毒ｔｋ基因（ＨＳＶ－ｔｋ）的人肝癌特异性逆转录病毒载体。方法和结果：切除逆转录病毒载体ｐＭＮＳＭ内部的ＳＶ４０启动子使之成为ｐＭＮＭ；从真核表达载体ｐＢＰＧＫ－ｔｋ质粒中游离带有磷酸甘油酸激酶基因（ｐｇｋ）启动子调控的ＨＳＶ－ｔｋ片段，克隆到ｐＭＮＭ的ＰＬ位点上，构建成普通型ＰＭＮｐ－ｔｋ逆转录病毒载体；从ｐＧＥＭ．７Ｚ－ＡＦＰｅ质粒中游离人甲胎蛋白基因增强子核心序列，克隆到ｐＭＮｐ－ｔｋ的ｐｇｋ启动子上游，构建成人肝癌特异型ｐＭＮＡＰ－ｔｋ逆转录病毒载体。结论：该载体对肝癌特异性前药转换基因治疗有重要意义。

关键词：肝肿瘤基因治疗逆转录病毒载体 HSV-tk

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人白细胞介素2、β干扰素基因逆转录病毒载体的构建和在人肾细胞癌及其TIL中的表达

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第二军医大学学报 1995年第3期16卷 206-211页

作者：曹广文侯建国李光辉杜平杨文国戚中田吴宗娣仇小芳廖国强夏广彬钱松溪郑家富马永江孔宪涛第二军医大学基础医学部微生物学教研室第二军医大学长海医院泌尿外科第二军医大学长征医院实验诊断科

从ｐｃＤ－５．１质粒和ｐＳＰＧＮＨＩＦＮＢ１０质粒分别切下人白细胞介素２（ＨｕＩＬ－２）ｃＤＮＡ和人β干扰素（ＨｕＩＦＮ－β）ｃＤＮＡ，分别克隆到ｐＮＭＳＭ逆转录病毒载体多克隆位点，经酶切鉴定确定正确插入方向。经ＰＡ... 详细信息

从ｐｃＤ－５．１质粒和ｐＳＰＧＮＨＩＦＮＢ１０质粒分别切下人白细胞介素２（ＨｕＩＬ－２）ｃＤＮＡ和人β干扰素（ＨｕＩＦＮ－β）ｃＤＮＡ，分别克隆到ｐＮＭＳＭ逆转录病毒载体多克隆位点，经酶切鉴定确定正确插入方向。经ＰＡ３１７包装细胞包装成重组病毒，测转染效率。用ＮＩＨ／３Ｔ３细胞测重组病毒感染效率。在８μｇ／ｍｌ鱼精蛋白存在的条件下分别感染人新鲜肾透明细胞癌体外建株细胞以及人肾细胞癌肿瘤浸润性淋巴细胞（ＴＩＬ）。经Ｇ４１８选择阳性克隆后测上清表达ＨｕＩＬ－２及ＨｕＩＦＮ－β活性。结果ＨｕＩＬ－２和ＨｕＩＦＮ分别在转ＨｕＩＬ－２基因和ＨｕＩＦＮ－β基因肾细胞癌细胞的表达量达２５０Ｕ／１０６细胞·ｄ－１和６４００Ｕ／１０６细胞·ｄ－１，在经目的基因转染ＴＩＬ细胞中的表达量分别比未经目的基因转染的ＴＩＬ高２～３倍和４～８倍。ＴＩＬ生长状况未有明显改变，抗肿瘤活性未见明显增强。

关键词：白细胞介素 β干扰素转基因肾肿瘤基因表达

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人肾细胞癌细胞的原代培养及癌基因表达初步分析

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第二军医大学学报 1999年第5期20卷 280-282页

作者：张晓琴曹广文侯建国戚中田第二军医大学基础医学部微生物学教研室第二军医大学长海医院泌尿外科

目的：研究人肾细胞癌（ＲＣＣ）原代细胞生物学特性及其癌基因的表达情况。方法：应用改良的原代肿瘤细胞分离法分离培养７例人ＲＣＣ原代细胞。应用染色体核型分析和免疫组化方法，分析原代细胞核型以及癌基因与抑癌基因的表达。结果... 详细信息

目的：研究人肾细胞癌（ＲＣＣ）原代细胞生物学特性及其癌基因的表达情况。方法：应用改良的原代肿瘤细胞分离法分离培养７例人ＲＣＣ原代细胞。应用染色体核型分析和免疫组化方法，分析原代细胞核型以及癌基因与抑癌基因的表达。结果：用本法培养的原代细胞比其他常规方法所得细胞既多且纯。所培养的人ＲＣＣ原代细胞的癌基因表达分析发现ｂｃｌ－２，ｃ－ｅｒｂＢ－２，ｃ－ｍｅｔ，表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）有轻度至中度表达，而ｐ５３没有表达。结论：人ＲＣＣ原代培养及其癌基因表达检测，为应用原代ＲＣＣ所开展ｅｘｖｉｖｏ的ＲＣＣ基因治疗打下了初步的基础。

关键词：肾肿瘤原代培养癌基因肾细胞癌

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原发性肝癌78例血清HCV　RNA和抗HCV的观察

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第二军医大学学报 1995年第2期16卷 130-131页

作者：崔晓红宋艳斌潘卫印慨陈汉钱光相戚中田吴孟超第二军医大学基础医学部微生物学教研室第二军医大学长海医院肝胆外科

用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）检测了７８例原发性肝癌（ＰＬＣ）患者血清丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ、抗ＨＣＶ和乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）免疫学标志物。结果，ＨＣＶＲＮＡ、抗ＨＣＶ和... 详细信息

用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）检测了７８例原发性肝癌（ＰＬＣ）患者血清丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ、抗ＨＣＶ和乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）免疫学标志物。结果，ＨＣＶＲＮＡ、抗ＨＣＶ和ＨＢｓＡｇ的检出率分别为２，６％（２／７８）、１１．５％（９／７８）和７４．４％（５８／７８）；抗ＨＣＶ在ＨＢｓＡｇ阳性组和ＨＢｓＡｇ阴性组中的检出率分别为３．５％（２／５８）和３５％（７／２０）。提示，在江浙地区，ＨＢＶ感染仍是ＰＬＣ发生的主要危险因素。

关键词：肝肿瘤丙型肝炎病毒血清聚合酶链反应 ELISA

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胃癌患者外周血单个核细胞白细胞介素2的诱生能力

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第二军医大学学报 1995年第2期16卷 149-151页

作者：李淑德许国铭郑杭民张洪富第二军医大学长海医院消化内科第二军医大学基础医学部微生物学教研室

应用［３Ｈ］－ＴｄＲ掺入法，测定３０例胃癌患者外周血单个核细胞白细胞介素２（ＩＬ－２）诱生能力。结果表明，胃癌患者ＩＬ－２诱生能力显著低于正常对照（Ｐ＜０．０１）及胃慢性良性病者（Ｐ＜０．０１）；随肿瘤进展，ＩＬ－２... 详细信息

应用［３Ｈ］－ＴｄＲ掺入法，测定３０例胃癌患者外周血单个核细胞白细胞介素２（ＩＬ－２）诱生能力。结果表明，胃癌患者ＩＬ－２诱生能力显著低于正常对照（Ｐ＜０．０１）及胃慢性良性病者（Ｐ＜０．０１）；随肿瘤进展，ＩＬ－２诱生能力逐渐降低（Ｐ＜０．０１）；肿瘤分化越差，ＩＬ－２诱生能力则越低（Ｐ＜０．０１）；血清可溶性ＩＬ－２受体（ｓＩＬ－２Ｒ）与ＩＬ－２诱生能力呈负相关（γ＝－０．７６３１，Ｐ＜０．０１）；去除肿瘤负荷，可降低血清ｓＩＬ－２Ｒ和升高ＩＬ－２诱生水平。

关键词：白细胞介素白细胞胃肿瘤单个核细胞

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大肠癌组织CEA基因启动子序列克隆及与正常组织相应序列的比较

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第二军医大学学报 1997年第4期18卷 301-305页

作者：曹广文杜平崔龙高军潘欣戚中田第二军医大学基础医学部微生物学教研室第二军医大学长海医院普通外科

目的：研究人类不同组织细胞中癌胚抗原（ＣＥＡ）产生与其基因顺式作用序列改变的关系，评价该顺式作用序列在大肠癌组织特异性基因治疗中的应用价值。方法：采用套式ＰＣＲ方法分别从人新鲜大肠癌、相应癌旁粘膜组织、正常血细胞、正... 详细信息

目的：研究人类不同组织细胞中癌胚抗原（ＣＥＡ）产生与其基因顺式作用序列改变的关系，评价该顺式作用序列在大肠癌组织特异性基因治疗中的应用价值。方法：采用套式ＰＣＲ方法分别从人新鲜大肠癌、相应癌旁粘膜组织、正常血细胞、正常胎盘组织及建株癌基因组中扩增ＣＥＡ基因启动子核心序列，ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交法确定扩增序列可靠性。用ＰＣＲ－单链构象多态性（ＳＳＣＰ）和ＤＮＡ序列分析方法确定扩增序列突变情况。用Ｂａｎｄ－Ｓｈｉｆｔ分析法检验扩增序列的启动子功能。结果：不同组织细胞基因组中的ＣＥＡ基因转录起始位点上游－１３０ｂｐ～＋６９ｂｐ的ＣＥＡ基因启动子核心序列区段未发现明显序列差异。大肠癌组织中ＣＥＡ基因的转录与大肠癌基因组中ＣＥＡ基因启动子核心序列无明显的对应关系。从大肠癌组织和正常组织ＤＮＡ中扩增出来的ＣＥＡ启动子序列与ＣＥＡ阳性的ＬｏＶｏ大肠癌细胞核蛋白提取物的结合能力一致，但不能与ＣＥＡ阴性的ＲＣ９４０６人肾癌细胞结合。结论：ＣＥＡ基因在大肠癌细胞中的特异转录不是由于ＣＥＡ基因启动子序列的突变。来源于正常细胞或者大肠癌细胞基因组的ＣＥＡ基因启动子均适合大肠癌组织特异性基因治疗。

关键词：大肠肿瘤癌胚抗原基因启动子基因治疗

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逆转录病毒介导的人肝癌特异性HSV－tk／ACV的体外抗肝癌作用

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第二军医大学学报 1996年第6期17卷 505-508页

作者：高军曹广文戚中田吴宗娣杜平仇小芳崔龙杨文国第二军医大学基础医学部微生物学教研室第二军医大学长海医院普通外科

目的：建立肝癌特异性前药转换基因治疗的方法。方法和结果：构建携带单纯疮疹病毒胸苷激酶基因（ＨＳＶ－ｔｋ）的人肝癌特异性逆转录病毒载体，经过ＰＡ３１７细胞包装及病毒滴度测定后，感染肝癌ＨｅｐＧ２和ＳＭＭＣ７７２１细胞，... 详细信息

目的：建立肝癌特异性前药转换基因治疗的方法。方法和结果：构建携带单纯疮疹病毒胸苷激酶基因（ＨＳＶ－ｔｋ）的人肝癌特异性逆转录病毒载体，经过ＰＡ３１７细胞包装及病毒滴度测定后，感染肝癌ＨｅｐＧ２和ＳＭＭＣ７７２１细胞，用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交方法证明ＨＳＶ－ｔｋ基因在ＡＦＰ高分泌的ＨｅｐＧ２细胞中得到特异转录，以阿昔洛韦（ＡＣＶ）为前药攻击转基因的肝癌细胞显示对ＨｅｐＧ２有相对选择性杀伤作用。结论：该ＡＦＰｅ／ＨＳＶ－ｔｋ／前药转换疗法为肝癌特异性基因治疗提供了有价值的资料。

关键词：肝肿瘤胸苷激酶甲胎蛋白增强子基因治疗

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