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丙型肝炎病毒(HCV)非结构区NS3-5B蛋白的真核表达载体构建及其在BHK-21细胞中的表达

科学技术与工程 2013年第36期21卷 10794-10797,10805页

作者：韩佩君雷迎峰吕欣杨敬姚敏乔卿华党品香尹文第四军医大学基础医学部微生物学与病原生物学教研室西安710032

通过PCR方法扩增出HCV NS3-5b全长基因序列,克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中,构建重组质粒pIRES2-EGFP-NS3-5b。利用脂质体将该质粒转染至BHK-21细胞,通过荧光成像和Western Blot检测NS3-5b基因的表达。结果显示成功构建了真核表达载体... 详细信息

通过PCR方法扩增出HCV NS3-5b全长基因序列,克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中,构建重组质粒pIRES2-EGFP-NS3-5b。利用脂质体将该质粒转染至BHK-21细胞,通过荧光成像和Western Blot检测NS3-5b基因的表达。结果显示成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-NS3-5b,并且NS3/4A蛋白和NS5B蛋白得到特异性表达,为下一步建立HCV RdRp活性的细胞评价系统和动物模型评价系统奠定了实验和理论基础。

关键词：丙型肝炎病毒(hepatitis e virus HCV) NS3-5B蛋白真核表达

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Tet-on和Cre/loxP系统双重调控表达丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶三转基因小鼠的建立

引用

生物技术通讯 2012年第3期23卷 342-346页

作者：兰海云孙梦宁马玉赵亚吕欣杨敬雷迎峰姚敏黄小军张建敏康健尹文第四军医大学基础医学部医学微生物学与病原生物学教研室陕西西安710032 第四军医大学基础医学部中心实验室陕西西安710032

目的:建立Tet-On调控系统和Cre/loxP基因剔除系统双重调控表达丙型肝炎病毒(HCV)NS3/4A丝氨酸蛋白酶三转基因小鼠。方法:选择适龄并经鉴定的在Tet-on系统调控下肝脏特异性表达Cre重组酶的双转基因小鼠Lap/LC-1与在Tet-on系统调控下肝脏... 详细信息

目的:建立Tet-On调控系统和Cre/loxP基因剔除系统双重调控表达丙型肝炎病毒(HCV)NS3/4A丝氨酸蛋白酶三转基因小鼠。方法:选择适龄并经鉴定的在Tet-on系统调控下肝脏特异性表达Cre重组酶的双转基因小鼠Lap/LC-1与在Tet-on系统调控下肝脏特异性表达萤光素酶(Luc)的双转基因小鼠Lap/NS3/4A交配,子代小鼠经PCR检测、筛选基因组中NS3/4A、Lap、LC-1等3个转基因片段均阳性的小鼠。三阳性的NS3/4A/Lap/LC-1小鼠经多西环素(Dox)诱导1周后,以在体生物发光成像系统(BLI)检测报告基因Luc的表达,免疫组化检测小鼠体内Cre重组酶、HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的表达状况。结果:NS3/4A/Lap/LC-1小鼠经Dox诱导后,BLI结果显示仅在小鼠肝脏部位有强烈的发光信号,表明这些小鼠肝细胞内报告基因Luc特异高效表达;免疫组化结果证实Cre重组酶、NS3/4A蛋白酶仅在经诱导后的小鼠肝细胞中特异性表达。结论:建立了Tet-On调控系统和Cre/loxP基因剔除系统双重调控下表达HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的三转基因小鼠模型,为进一步研究HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶在HCV感染后与宿主相互作用的机制,以及抗NS3/4A丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂的筛选奠定了基础。

关键词：丙型肝炎病毒 NS3/4A丝氨酸蛋白酶三转基因小鼠

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双重调控表达HCVNS3/4A丝氨酸蛋白酶三转基因小鼠的建立

双重调控表达HCVNS3/4A丝氨酸蛋白酶三转基因小鼠的建立

引用

中国微生物学会2012感染与免疫学术研讨会

作者：兰海云孙梦宁马玉赵亚吕欣杨敬雷迎峰尹文第四军医大学基础医学部医学微生物学教研室陕西西安710032 第四军医大学基础医学部中心实验室陕西西安710032

目的建立Tet-On调控系统和Cre/LoxP基因剔除系统双重调控表达HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶三转基因小鼠。方法选择适龄并经鉴定的由Tet-on系统调控下肝脏特异性表达Cre重组酶的双转基因小鼠Lap/LC-1与由Tet-on系统调控下肝脏特异性表达荧... 详细信息

目的建立Tet-On调控系统和Cre/LoxP基因剔除系统双重调控表达HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶三转基因小鼠。方法选择适龄并经鉴定的由Tet-on系统调控下肝脏特异性表达Cre重组酶的双转基因小鼠Lap/LC-1与由Tet-on系统调控下肝脏特异性表达荧光素酶(Luc)的双转基因小鼠Lap/NS3/4A交配,子代小鼠经PCR法检测、筛选基因组中NS3/4A、Lap、LC-1三个转基因片段均阳性的小鼠。三阳性的NS3/4A/Lap/LC-I小鼠经盐酸强力霉素(Doxycycline,Dox)诱导一周后,以在体生物发光成像系统(In vivo bioluminescent imaging,BLI)检测报告基因荧光素酶的的表达。免疫组化检测小鼠体内Cre重组酶、NS3/4A丝氨酸蛋白酶的表达状况。结果 NS3/4A/Lap/LC-1小鼠经Dox诱导后,BLI结果显示,仅在小鼠肝脏部位检测到强烈的发光信号,表明这些小鼠肝细胞内报告基因Luc特异高效表达。免疫组化结果证实Cre重组酶、NS3/4A蛋白酶仅在经诱导后后的小鼠肝细胞特异性表达。结论建立了Tet-On调控系统和Cre/LoxP基因剔除系统双重调控下表达HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的三转基因小鼠模型,为进一步研究HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶在HCV感染后与宿主相互作用的机制及抗NS3/4A丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂的筛选奠定基础。

关键词： HCV NS3/4A蛋白酶三转基因小鼠

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在体生物发光成像技术在生物医学中的应用

引用

生物技术通讯 2011年第2期22卷 286-291页

作者：兰海云汪爱勤尹文第四军医大学基础医学部微生物学与病原生物学教研室陕西西安710032 第四军医大学基础医学部中心实验室陕西西安710032

在体生物发光成像技术采用萤光素酶基因标记细胞及DNA,利用灵敏的光学检测仪器,实时直观地监测活体小动物体内感染性疾病的发生发展、肿瘤的生长及转移及引发的免疫反应、特定基因的表达等诸多生物过程。通过对同一组实验对象在不同时... 详细信息

在体生物发光成像技术采用萤光素酶基因标记细胞及DNA,利用灵敏的光学检测仪器,实时直观地监测活体小动物体内感染性疾病的发生发展、肿瘤的生长及转移及引发的免疫反应、特定基因的表达等诸多生物过程。通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录,跟踪同一观察目标(标记细胞、病原微生物或基因)的移动及变化,与传统的动物实验方法相比,在体生物发光成像得到的数据具有更高的可信度。近年来因其灵敏度较高、不涉及放射性物质、所得结果直观等优势,该技术已普遍应用于生物医学、药物开发等研究领域。

关键词：在体生物发光成像萤光素酶萤光素

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