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第八届全国创伤修复(愈合)与组织再生学术交流会

作者：刘晓玉庞希宁教育部医学细胞生物学重点实验室卫生部细胞生物学重点实验室中国医科大学干细胞与再生医学研究室辽宁沈阳110001

目的：比较入骨髓间充质干细胞(hBMSC)、羊膜间充质干细胞(hAMSC)和脂肪间充质干细胞(hADSC)皮下移植对小鼠皮肤损伤模型愈合的促进作用,为临床皮肤损伤后功能性修复提供更有效的治疗方法.方法：体外培养扩增hBMSC,hAMSC,hADSC,取36只... 详细信息

目的：比较入骨髓间充质干细胞(hBMSC)、羊膜间充质干细胞(hAMSC)和脂肪间充质干细胞(hADSC)皮下移植对小鼠皮肤损伤模型愈合的促进作用,为临床皮肤损伤后功能性修复提供更有效的治疗方法.方法：体外培养扩增hBMSC,hAMSC,hADSC,取36只小鼠制作皮肤损伤模型,并随机分为hBMSC移植组,hAMSC移植组,hADSC移植组,和盐水移植组.分别于伤后3,7,10,14天采用创面大体观察、组织学检查方法观察创面愈合情况.体外实验通过transwell小室将hBMSC,hAMSC,hADSC分别与人皮肤成纤维细胞(hFB)共培养,检测各组成纤维细胞的增殖,迁移,趋化,胶原合成,和生长因子VEGF,KGF,bFGF,TGF-β的分泌情况,探讨其促进创面愈合的机制.结果：创伤后3d开始,各组创面逐渐缩小,脂肪间充质干细胞治疗组最为明显,差异有显著性意义(P＜0.05),组织学检查显示,脂肪间充质干细胞治疗组重上皮化明显.体外实验,各组成纤维细胞增殖无显著性差异,脂肪间充质干细胞组迁移,趋化,胶原合成,生长因子分泌明显优于其它组,差异有显著性意义(P＜0.05).结论：脂肪间充质干细胞是治疗皮肤损伤更理想的种子细胞.

关键词：间充质干细胞表皮成纤维细胞皮肤损伤修复

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不同胎龄人皮肤角质形成细胞生物学特性的实验研究

不同胎龄人皮肤角质形成细胞生物学特性的实验研究

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第八届全国创伤修复(愈合)与组织再生学术交流会

作者：王哲施萍刘晓玉王喜良张殿宝庞希宁教育部医学细胞生物学重点实验室卫生部细胞生物学重点实验室中国医科大学干细胞与再生医学研究室辽宁沈阳110001 中国医科大学附属第一医院全科医学教研室辽宁沈阳110001

目的：比较不同胎龄人皮肤角质形成细胞的生物学特性，探讨胎儿无瘢痕愈合的机制。方法：收集中国医科大学附属盛京医院产科意外流产的不同胎龄的胎儿小腿皮肤标本和整形外科手术过程中作为供皮区的成人小腿的正常皮肤标本，患者均知情...

目的：比较不同胎龄人皮肤角质形成细胞的生物学特性，探讨胎儿无瘢痕愈合的机制。方法：收集中国医科大学附属盛京医院产科意外流产的不同胎龄的胎儿小腿皮肤标本和整形外科手术过程中作为供皮区的成人小腿的正常皮肤标本，患者均知情同意，医院伦理委员会批准。分别用两步消化法和组织块法分离培养胎儿皮肤角质形成细胞和成人真皮成纤维细胞。将角质形成细胞按胎龄分为小于28周组和大于28周。在倒置相差显微镜观察两种细胞形态，应用免疫荧光检测角蛋白和波形蛋白在细胞内的表达，划痕实验观察两组角质形成细胞的迁移能力及两组角质形成细胞作用下成纤维细胞迁移能力。

关键词：

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高密度接种对TGF-β1诱导HaCaT细胞上皮间充质转化的影响

高密度接种对TGF-β1诱导HaCaT细胞上皮间充质转化的影响

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第八届全国创伤修复(愈合)与组织再生学术交流会

作者：张殿宝施萍庞希宁教育部医学细胞生物学重点实验室卫生部细胞生物学重点实验室中国医科大学干细胞与再生医学研究室辽宁沈阳110001 中国医科大学附属第一医院全科医学教研室辽宁沈阳110001

背景：细胞密度是影响细胞分化与去分化状态的因素之一,对于细胞密度在TGF-beta1诱导HaCaT细胞上皮间充质转化中的作用尚缺乏深入研究。目的：观察细胞密度对TGF-β1诱导HaCaT细胞上皮间充质转化的影响。方法：将HaCaT细胞分别以103/cm2...

背景：细胞密度是影响细胞分化与去分化状态的因素之一,对于细胞密度在TGF-beta1诱导HaCaT细胞上皮间充质转化中的作用尚缺乏深入研究。目的：观察细胞密度对TGF-β1诱导HaCaT细胞上皮间充质转化的影响。方法：将HaCaT细胞分别以103/cm2和105/cm2接种于六孔板,使用2ng/mL的TGF-β1作用48h,观察细胞形态变化,应用Realtime PCR和western blot分别检测E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin和ZO-1的转录水平和表达水平：免疫荧光检测E-Cadherin和Vimentin表达。结果：低密度组的HaCaT细胞在TGF-β1处理48h后细胞间隙变大,细胞形态由多角形变为长梭形,高密度组的细胞间隙变大,但形态变化不明显;Realtime PCR和westem blot显示两组上皮细胞标志物E-Cadherin和ZO-1的转录及表达均下调,但高密度组下调比例低于低密度组,间充质细胞标志物N-Cadherin和Vimentin的转录及表达均上调,上调比例无显著差异;免疫荧光结果发现,高密度组表达E-Cadherin的细胞比率明显高于低密度组,Vimentin的表达无显著差异。结论：高接种密度降低TGF-β1诱导HaCaT细胞上皮间充质转化的效率。

关键词：

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聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒标记人羊膜间充质干细胞和导入siRNA的研究

聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒标记人羊膜间充质干细胞...

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第八届全国创伤修复(愈合)与组织再生学术交流会

作者：王瑞施萍张殿宝刘晓玉庞希宁教育部医学细胞生物学重点实验室卫生部细胞生物学重点实验室中国医科大学干细胞与再生医学研究室辽宁沈阳110001 中国医科大学附属第一医院全科医学教研室辽宁沈阳110001

目的：聚乙烯亚胺(PEI)修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒是近来新发现的活体示踪剂和转染剂,本实验以人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)为靶点,探讨聚乙烯亚胺(PEI)修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒对人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的标记率和转染siRN... 详细信息

目的：聚乙烯亚胺(PEI)修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒是近来新发现的活体示踪剂和转染剂,本实验以人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)为靶点,探讨聚乙烯亚胺(PEI)修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒对人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的标记率和转染siRNA干扰目的基因.方法：1.颗粒来源：聚乙烯亚胺(PEI)修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒购买于东纳生物科技有限公司.2.实验方法：原代分离人羊膜间充质干细胞(hAMSCs),向人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)中加入10％胎牛血清,含20ug/L碱性成纤维生长因子(bFGF)的DMEM/F12培养基,置于37℃,体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱培养,待细胞达到80％-90％融合时用胰酶消化传代.取传至第三代的细胞放入含DMEM/F12培养基的六孔板中.设立2个实验组和1个对照组,分别向两个实验组培养基中加入终浓度为8ug/L的PEI-siGAPDH,对照组仅加入DMEM/F12培养基.3.实验评估：实验组于标记24h后,分别用普鲁士蓝染色和Western-blot方法检测PEI-siGAPDH进入细胞和siGAPDH干扰情况.结果：光镜下观察,发现终浓度为8ug/L的聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒普鲁士蓝染色几乎为100％.Western-blot方法检测,发现终浓度为8ug/L的PEI-siGAPDH干扰组较对照组GAPDH表达减低.结论：聚乙烯亚胺(PEI)修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒能标记人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)和导入小干扰RNA.为进一步应用人羊膜间充质干细胞移植治疗提供活体示踪方法奠定实验基础.

关键词：人羊膜间充质干细胞聚乙烯亚胺四氧化三铁磁性纳米颗粒标记转染

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EGF激活PAK1对人羊膜间充质干细胞体外迁移的重要作用

EGF激活PAK1对人羊膜间充质干细胞体外迁移的重要作用

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第八届全国创伤修复(愈合)与组织再生学术交流会

作者：李彩虹施萍庞希宁教育部医学细胞生物学重点实验室卫生部细胞生物学重点实验室中国医科大学干细胞与再生医学研究室辽宁沈阳110001 中国医科大学附属第一医院全科医学教研室辽宁沈阳110001

目的：研究表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)能否促进人羊膜间充质干细胞(human amnion mesenchymal stem cell,hAMSC)增殖和定向迁移及其机理.方法：酶消化法体外分离hAMSCs,37℃,5％的CO2培养箱中培养.免疫细胞化学方法检...

目的：研究表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)能否促进人羊膜间充质干细胞(human amnion mesenchymal stem cell,hAMSC)增殖和定向迁移及其机理.方法：酶消化法体外分离hAMSCs,37℃,5％的CO2培养箱中培养.免疫细胞化学方法检测干细胞表面标志波形蛋白、CD44、*** chamber法观察EGF浓度梯度对hAMSCs定向迁移的影响.Transwell小室测定EGF对hAMSCs迁移的作用,及EGFR抑制剂AG1478、PI3K抑制剂LY294002、ERK抑制剂U0126对EGF作用的影响.蛋白免疫印迹法检测EGF处理后EGFR、AKT、ERK的磷酸化水平的变化,分析其与细胞迁移的关系.结果：使用Dunn chemotaxis chamber对EGF刺激后的hAMSC进行超过两小时的细胞运动研究,发现经线性浓度梯度的EGF刺激hAMSC后,其表现为特异性的定向迁移,平均迁移率为6.45μm/h.同时EGF还能增加表皮生长因子受体(EGFR)、蛋白酶B(AKT)及细胞外信号调节激酶1/2(ERK)的磷酸化水平.EGF诱导的ERK活性能被EGFR阻滞剂AG1478和PI3K阻滞剂LY-294002所抑制.我们还发现EGF调节PAK1信号通路很可能与hAMSC的定向迁移相关.此外,AG1478、LY-294002、U0126(ERK阻滞剂)能够减弱EGF促进的hAMSC定向迁移.结论：我们的研究表明EGF诱导的hAMSC增殖和迁移受EGFR调控—EGFR激活下游PI3K/AKT和ERK信号通路,并且hAMSC的迁移与PAK1相关.

关键词：

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EGF作用人羊膜间充质干细胞创伤修复相关蛋白的Seq-RNA表达

EGF作用人羊膜间充质干细胞创伤修复相关蛋白的Seq-RNA表达

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第八届全国创伤修复(愈合)与组织再生学术交流会

作者：李彩虹施萍张殿宝刘晓玉张涛庞希宁教育部医学细胞生物学重点实验室卫生部细胞生物学重点实验室中国医科大学干细胞与再生医学研究室辽宁沈阳110001 中国医科大学附属第一医院全科医学教研室辽宁沈阳110001

目的检测人羊膜间充质干细胞(HAMSCs)伤口愈合相关蛋白白细胞介素6,8;转化因子1,β的表达水平.方法无菌条件下取孕期38～40周的人羊膜,胰酶胶原酶消化法分离人羊膜间充质干细胞,待细胞传至P1代后更换无血清培养液;取4-6代细胞用免疫...

目的检测人羊膜间充质干细胞(HAMSCs)伤口愈合相关蛋白白细胞介素6,8;转化因子1,β的表达水平.方法无菌条件下取孕期38～40周的人羊膜,胰酶胶原酶消化法分离人羊膜间充质干细胞,待细胞传至P1代后更换无血清培养液;取4-6代细胞用免疫细胞化学法和流式细胞术检测细胞表面抗原;用骨软骨脂肪表皮诱导分化培养基进行诱导分化.EGF100ng/ml作用hAMSC,分别提取hAMSC和EGF作用hAMSC总RNA,进行RNA-Seq分析.用qRT-PCR检测验证.结果培养的人羊膜间充质干细胞呈梭形,旋涡样生长.通过流式细胞术检测HAMSCs高表达间充质干细胞相关的细胞表面标志物CD44,CD90,CD105;免疫细胞化学法检测HAMSCs高表达间充质干细胞相关的细胞表面标志物CD90,CD73,***在骨,软骨,脂肪,表皮诱导分化培养基中可向成骨细胞、软骨和脂肪细胞及表皮细胞分化.Seq-RNA表达谱测序涉及创伤修复12个相关的表达基因,其中,上调基因9个(BMP2、CXCL3、IL1β、IL8、PLAT、PLAU、CCL2、CCL7、DCBLD2);下调基因3个(C3、NGF、OLR1).并经qRT-PCR检测验证得到证实.结论人羊膜间充质干细胞具有多向分化的潜能和干细胞的生物学特性,并能在一定诱导条件下分化为表皮细胞;表达伤口愈合相关蛋白BMP2、CXCL3、IL1β、IL8、PLAT、PLAU、CCL2、CCL7、DCBLD2.这一结果支持了人羊膜间充质干细胞在创伤修复中的应用.

关键词：

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EGF干预人羊膜间充质干细胞差异表达基因及基因功能富集分析

EGF干预人羊膜间充质干细胞差异表达基因及基因功能富集分析

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第八届全国创伤修复(愈合)与组织再生学术交流会

作者：施萍李彩虹张殿宝刘晓玉张涛庞希宁中国医科大学附属第一医院全科医学教研室辽宁沈阳110001 教育部医学细胞生物学重点实验室卫生部细胞生物学重点实验室中国医科大学干细胞与再生医学研究室辽宁沈阳110001

目的研究EGF干预人羊膜间充质干细胞前后的基因表达差异,在基因水平上探讨EGF作用的分子生物学机制.方法无菌条件下取孕期38～40周的人羊膜,胰酶胶原酶消化法分离人羊膜间充质干细胞,待细胞传至P1代后更换无血清培养液;取4-6代细胞提...

目的研究EGF干预人羊膜间充质干细胞前后的基因表达差异,在基因水平上探讨EGF作用的分子生物学机制.方法无菌条件下取孕期38～40周的人羊膜,胰酶胶原酶消化法分离人羊膜间充质干细胞,待细胞传至P1代后更换无血清培养液;取4-6代细胞提取总RNA,用高通量Illumina测序RNA-Seq表达谱分析技术,对体外培养的用EGF干预人羊膜间充质干细胞,对干预前后mRNA进行测序,筛选差异表达基因并进行数字基因表达谱分析、聚类分析、Gene Ontology功能显著性富集分析、Pathway显著性富集分析和蛋白互作网络分析;采用qRT-PCR检测对上述结果进行验证.结果与人类基因组数据库(Hg18)进行比对,比较人羊膜间充质干细胞和EGF干预人羊膜间充质干细胞差异表达,发现差异表达基因104个,其中上调已知基因56个;下调已知基因48个.RNA-Seq的KEGG pathways的显著性富集分析,细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路为差异表达基因中显著富集的pathways(q≤0.05).该通路共涉及9个差异表达基因,其中上调差异表达基因7个(BMP2,CXCL3,IL1B,IL8,TNFRSF9,CCL2,CCL7),下调差异表达基因2个(INHBE,IFNE).经qRT-PCR检测验证获得证实.结论 EGF干预人羊膜间充质干细胞前后存在多组基因表达差异.细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路在启动人在羊膜间充质干细胞增殖和迁移过程中起着调节作用,有望成为促进羊膜间充质干细胞增殖和迁移的靶通路,对其应用于促进创面愈合具有指导意义.

关键词：

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细胞重编程:调节关键基因获得需要细胞

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中国医学科学院学报 2011年第6期33卷 689-695页

作者：庞希宁中国医科大学细胞生物学卫生部重点实验室干细胞与再生医学研究室沈阳110001

细胞重编程是在一定条件下成体细胞的记忆被擦除,重新程序化产生新的表型和功能,导致细胞命运发生改变,主要发生在不涉及基因组DNA序列改变的基因表达水平,即通过改变细胞基因表达程序(时空和差异),对其进行重新编程而改变细胞的分化方... 详细信息

细胞重编程是在一定条件下成体细胞的记忆被擦除,重新程序化产生新的表型和功能,导致细胞命运发生改变,主要发生在不涉及基因组DNA序列改变的基因表达水平,即通过改变细胞基因表达程序(时空和差异),对其进行重新编程而改变细胞的分化方向,获得所需要的细胞。对于细胞重编程的深入研究有助于掌握机体细胞的发生发育机制,为解决再生医学种子细胞来源问题提供理论基础。人类未来将从许多分化的细胞获得更多所需要的另外一些分化细胞,这对细胞分化机制和疾病的细胞替代治疗研究具有划时代的意义,本文总结了细胞重编程的分类、影响因素、方法及最新进展。

关键词：细胞重编程基因表达去分化转分化

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表皮生长因子干预人羊膜间充质干细胞的增殖和迁移

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中国组织工程研究与临床康复 2011年第23期15卷 4312-4315页

作者：李彩虹施萍庞希宁中国医科大学细胞生物学卫生部重点实验室干细胞与再生医学研究室辽宁省沈阳市110001

背景:人羊膜间充质干细胞移植可促进皮肤创伤的愈合。目的:观察表皮生长因子对体外培养人羊膜间充质干细胞增殖和迁移的影响。方法:人羊膜间充质干细胞经分离、鉴定并培养至第3代。细胞经过不同浓度的表皮生长因子处理后,用MTT法测量吸... 详细信息

背景:人羊膜间充质干细胞移植可促进皮肤创伤的愈合。目的:观察表皮生长因子对体外培养人羊膜间充质干细胞增殖和迁移的影响。方法:人羊膜间充质干细胞经分离、鉴定并培养至第3代。细胞经过不同浓度的表皮生长因子处理后,用MTT法测量吸光度值从而计算出细胞存活率,通过计数穿过Transwell小室的细胞数测定表皮生长因子对细胞迁移能力的影响;并用表皮生长因子受体的抑制剂AG1478及PI3K的抑制剂LY294002检测其对细胞迁移能力的影响。结果与结论:表皮生长因子处理后细胞的吸光度值升高1.55倍,穿过膜的数量增高1.5倍;AG1478、LY294002对表皮生长因子引起的迁移有抑制作用。提示表皮生长因子处理后细胞增殖和迁移能力均增强,迁移与EGFR-PI3K信号通路有关。

关键词：人羊膜间充质干细胞表皮生长因子增殖迁移信号通路

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人羊膜负载人羊膜间充质干细胞对SD大鼠皮肤创面愈合的影响

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中国医学科学院学报 2011年第6期33卷 611-614,I0005-I0009页

作者：霍双枝施萍庞希宁中国医科大学细胞生物学卫生部重点实验室干细胞与再生医学研究室沈阳110001 中国医科大学附属第一医院全科医学教研室沈阳110001

目的观察人羊膜(HAM)负载人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)对SD大鼠皮肤创面愈合的影响。方法采用胰酶消化HAM的上皮细胞,将hAMSCs接种于HAM上培养,然后贴覆于大鼠创面,观察创面大体变化,采用HE染色和免疫组织化学染色法检测创面愈合情况,并... 详细信息

目的观察人羊膜(HAM)负载人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)对SD大鼠皮肤创面愈合的影响。方法采用胰酶消化HAM的上皮细胞,将hAMSCs接种于HAM上培养,然后贴覆于大鼠创面,观察创面大体变化,采用HE染色和免疫组织化学染色法检测创面愈合情况,并与单纯羊膜组和对照组进行比较。结果 HAM负载hAMSCs组大鼠创面的平均愈合时间为(18.3±0.9)d,明显快于对照组的(26.4±0.7)d(P<0.01)和单纯羊膜组的(21.5±1.2)d(P<0.05);术后11 d和14 d,HAM负载hAMSCs组大鼠的创面愈合率分别为(81.5±7.2)%和(94.3±3.6)%,明显高于对照组的(48.5±3.2)%和(74.3±4.3)%及单纯羊膜组的(68.5±4.5)%和(86.8±4.8)%(P均<0.01)。皮肤切片HE染色结果证实,HAM负载hAMSCs组大鼠的伤口愈合质量明显优于单纯羊膜组和对照组。免疫组织化学染色结果显示,术后14 d,HAM负载hAMSCs组大鼠皮肤CK19阳性表皮干细胞数为48.2±3.2,明显高于单纯羊膜组的37.7±3.1(P<0.05)和对照组的29.6±2.4(P<0.01);血管内皮生长因子阳性颗粒表达数为64.5±4.5,也明显高于单纯羊膜组的52.6±3.8(P<0.05)和对照组的40.7±3.1(P<0.01)。结论 HAM负载hAMSCs可能是通过促进表皮干细胞和毛细血管再生,促进皮肤损伤修复。

关键词：人羊膜人羊膜间充质干细胞创伤修复角蛋白19 血管内皮生长因子

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