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人多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2)RNA干扰载体的构建及鉴定

江苏大学学报（医学版） 2007年第2期17卷 102-104,110页

作者：仇灏刘可人朱琍燕吴士良苏州大学医学院生化工程研究所基础医学系生物化学与分子生物学教研室江苏苏州215123

目的:构建稳定的转染人多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2)基因的RNA i载体。方法:遵循RNA干扰目标序列的选取原则,对ppGalNAc-T2基因mRNA序列设计五条可能的小干扰RNA(siRNA),PCR方法扩增得到siRNA内源表达系统,转染至人胃癌... 详细信息

目的:构建稳定的转染人多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2)基因的RNA i载体。方法:遵循RNA干扰目标序列的选取原则,对ppGalNAc-T2基因mRNA序列设计五条可能的小干扰RNA(siRNA),PCR方法扩增得到siRNA内源表达系统,转染至人胃癌细胞株SGC7901,运用RT-PCR方法检测筛选得到其中能高效引起ppGal-NAc-T2基因表达沉默的siRNA;化学合成带荧光标记的该段RNA O ligo,转染细胞并用荧光显微镜观察转染情况,进一步鉴定该siRNA对ppGalNAc-T2的抑制作用;构建ppGalNAc-T2的RNA干扰真核表达载体,酶切及测序鉴定后转染SGC7901细胞并经G418筛选得到稳定的ppGalNAc-T2基因敲减细胞株,RT-PCR方法检测该转染细胞株ppGalNAc-T2表达水平。结果:采用RNA i技术,将高表达ppGalNAc-T2的SGC7901细胞的T2表达水平明显降低。结论:成功构建稳定的ppGalNAc-T2基因敲减细胞株,为今后进一步深入研究ppGalNAc-T2的生物学功能奠定了基础。

关键词：多肽 N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2) RNAi SGC7901细胞

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β3GalT7基因的小干扰RNA筛选及其表达载体构建

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江苏大学学报（医学版） 2007年第2期17卷 93-96页

作者：朱琍燕仇灏岳爱环马珍妮吴艳胡鹤娟吴士良苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室生化工程研究所江苏苏州215123

目的:以β3GalT7(人β1,3-半乳糖基转移酶7)基因为研究对象,运用RNA干扰技术平台,筛选出该基因的有效小干扰siRNA并构建该基因的RNA干扰表达载体,建立其下调表达模型。方法:通过PCR方法筛选针对β3GalT7基因的有效小干扰siRNA,并合成带... 详细信息

目的:以β3GalT7(人β1,3-半乳糖基转移酶7)基因为研究对象,运用RNA干扰技术平台,筛选出该基因的有效小干扰siRNA并构建该基因的RNA干扰表达载体,建立其下调表达模型。方法:通过PCR方法筛选针对β3GalT7基因的有效小干扰siRNA,并合成带有荧光标记的RNA oligo进一步验证其有效性,进而构建该基因的RNA干扰表达载体建立其下调表达模型。结果:成功筛选到β3GalT7基因的有效小干扰siRNA,并进一步成功构建β3GalT7的RNA干扰真核表达载体。结论:成功构建β3GalT7的真核干扰表达载体,继而可以获得β3GalT7表达受抑制的人胃癌细胞SGC7901克隆,为研究该基因在肿瘤发生发展中的作用提供实验模型。

关键词：人β1,3-半乳糖基转移酶7基因小干扰RNA RNA干扰表达载体

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O-糖基化位点预测及糖基化酶催化特点

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生命的化学 2006年第1期26卷 25-27页

作者：刘可人金美芳吴士良苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室苏州大学生化工程研究所苏州215123

O-糖链维持所连接蛋白质部分的空间构象。O-糖基化作为生物体内重要的生物过程,其起始步骤具有复杂的高度选择性,迄今为止还未发现固定的模式。人们通过比较已知O-糖基化部位周围的氨基酸序列,推测出O-糖基化位点的一些规律及其酶的催... 详细信息

O-糖链维持所连接蛋白质部分的空间构象。O-糖基化作为生物体内重要的生物过程,其起始步骤具有复杂的高度选择性,迄今为止还未发现固定的模式。人们通过比较已知O-糖基化部位周围的氨基酸序列,推测出O-糖基化位点的一些规律及其酶的催化特性。

关键词： O-糖基化黏蛋白脯氨酸串联重复 ppGaNTases

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人类β3-半乳糖基转移酶基因β3GALT7的克隆、表达及功能的初步研究

人类β3-半乳糖基转移酶基因β3GALT7的克隆、表达及功能的初步研...

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华东六省一市生物化学与分子生物学学会2006年学术交流会

作者：吴艳孙其昌周嘉良吴士良苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室苏州大学生化工程研究所苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室苏州大学生化工程研究所苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室苏州大学生化工程研究所苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室苏州大学生化工程研究所

β3GALT7(AY277592,EC2．4．1-)基因是我们实验室利用TBLASTN信息途径,以β3GALT1为信息探针进行同源帅选后从人肺cDNA文库中克隆到的人类β3-半乳糖基转移酶家族的一个新成员。 Northern杂交显示其在肺、喉和回肠组织中高表达而在舌、... 详细信息

β3GALT7(AY277592,EC2．4．1-)基因是我们实验室利用TBLASTN信息途径,以β3GALT1为信息探针进行同源帅选后从人肺cDNA文库中克隆到的人类β3-半乳糖基转移酶家族的一个新成员。 Northern杂交显示其在肺、喉和回肠组织中高表达而在舌、乳房、子宫等组织中表达较低。为了进一步认知该酶的功能,我们进行了一些探索性的研究。方法:通过原核表达系统表达β3GALT7蛋白,以纯化的β3GALT7蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并用Western Blot和免疫组化的方法分析其在多种组织和细胞中的表达情况;通过荧光免疫细胞化学的方法进行亚克隆定位;克隆β3GALT7编码区的基因并构建其真核正义和反义表达载体,并运用脂质体介导将此重组载体转染中度表达该基因的人 SGC7901细胞株,和较高表达β3GALT7的A549细胞株,并通过荧光显微镜,激光共聚焦显微镜,RTPCR, western印迹等方法对其进行了初步的功能研究。结果:获得了较纯的β3GALT7表达蛋白和高效价、高特异性的抗β3GALT7的多克隆抗体,免疫组化显示肿瘤细胞和组织中该酶有较高的表达,与正常组织比较具有一定的差异,亚克隆定位显示β3GALT7大部分位于核膜周围的胞浆。同时获得了β3GALT7的正义、反义的真核重组质粒及稳定转染了这些重组质粒的细胞株,发现转染了正义质粒的 SGC7901细胞其β3GALT7蛋白表达水平增加,MMP2、MMP14的蛋白表达水平随其亦有所上升,而转染了反义β3GALT7的A549细胞其MMP2和MMP14的蛋白表达量随着β3GALT7的被抑制而成正相关下降,提示β3GALT7可能与肿瘤的发生、发展和转移具有一定的相关性。

关键词：半乳糖基转移酶 β3GALT7 多克隆抗体免疫组化原核表达真核表达

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人类多肽 N-乙酰氨基半乳糖转移酶2抗原表位分析、抗体制备及亚细胞定位

人类多肽 N-乙酰氨基半乳糖转移酶2抗原表位分析、抗体制备及亚细...

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华东六省一市生物化学与分子生物学学会2006年学术交流会

作者：杭赛宇胡鹤娟朱燕马震宇闫石吴士良苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室生化工程研究所苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室生化工程研究所苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室生化工程研究所苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室生化工程研究所苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室生化工程研究所苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室生化工程研究所

为了研究人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2)蛋白表达的亚细胞结构定位,制备特异性抗体。我们联合应用了多种方法对多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2的二级结构和表面特性进行了细致地分析,发现其优势抗原表位均位于蓖麻样结... 详细信息

为了研究人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2)蛋白表达的亚细胞结构定位,制备特异性抗体。我们联合应用了多种方法对多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2的二级结构和表面特性进行了细致地分析,发现其优势抗原表位均位于蓖麻样结构域中;进一步采用了RT-PCR方法克隆到蓖麻样结构域cDNA片段,将获得的蓖麻样结构域cDNA片段定向插入到表达载体PGEX-5X-3中,且导入大肠杆菌,诱导表达,获重组融合蛋白;将得到的重组融合蛋白免疫新西兰大白兔,我们获得了兔抗人ppGalNAc-T2的多克隆抗体,并进行ELISA法检测抗体效价,抗体滴度为1:3200,并进行了有效性检测;蛋白质印迹实验证实此多克隆抗体具有较好的反应性和特异性。通过荧光免疫细胞化学进行亚细胞定位,发现ppGalNAc-T2主要表达在细胞核旁的Golgi复合体,说明它们主要分布在Golgi复合体上,证实它们是在Golgi复合体参与蛋白质的糖链修饰。本文特异性扩增和表达蓖麻样结构域并制备了抗体,有利于进一步阐明RICIN结构域的功能,为研究多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2及其家族的结构和功能打下基础。

关键词：多肽 N-乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAc-T) 抗原表位抗体亚细胞定位

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多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族在不同发育阶段的小鼠脑中的mRNA表达差异

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族在不同发育阶段的小鼠脑中的mRN...

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华东六省一市生物化学与分子生物学学会2006年学术交流会

作者：胡鹤娟杨静杭赛宇吴士良苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室生化工程研究所苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室生化工程研究所苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室生化工程研究所苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室生化工程研究所

目的:为了观察三个不同发育阶段的小鼠脑中多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族(polypeptide: N-acetylgalactosaminytransferase,ppGalNAc-T)的表达差异,以探讨多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族在脑发育中的功能与作用;方法:取不同发育阶... 详细信息

目的:为了观察三个不同发育阶段的小鼠脑中多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族(polypeptide: N-acetylgalactosaminytransferase,ppGalNAc-T)的表达差异,以探讨多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族在脑发育中的功能与作用;方法:取不同发育阶段(即孕末期,新生期,4周龄)的小鼠各六只, 取脑组织后,我们采用半定量逆转录PCR方法从mRNA水平上粗略地研究了多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族在三个发育阶段的表达情况,以β-actin作为内对照,计算酶家族各成员的相对表达量,从而进行半定量分析;结果:我们发现三个不同发育阶段的小鼠脑中此酶家族的表达谱是不尽相同的。 T1、T2、T3、T4、T9、T10、T13、T14稳定表达,T3、T4、T9、T10在胎鼠中表达较高,在新生鼠和4周龄鼠中表达较低,且在新生鼠和4周龄鼠中的表达基本相同,T1、T2、T14等在各发育阶段鼠脑中表达基本无变化;结论:我们初步认为在小鼠脑的发育过程中多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族的表达有一定的变化,在今后的实验中,将在时间点及脑分区,即时空性表达方面,作更进一步地完善细致的研究, 进一步推动多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族在神经系统发育方面的研究工作,以探讨多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族在脑发育中的功能与作用

关键词： ppGalNAc-T 小鼠脑表达 RT-PCR

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人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族分子进化的初步研究

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江苏大学学报（医学版） 2006年第2期16卷 105-108页

作者：杭赛宇吴士良苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室江苏苏州215123 苏州大学生化工程研究所江苏苏州215123

目的:探讨人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族成员间的同源性,揭示其进化规律。方法:采用生物信息学软件和网上数据库对核酸蛋白质序列进行同源比较,结构域分析和进化树绘制。结果:人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族一级结构、二... 详细信息

目的:探讨人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族成员间的同源性,揭示其进化规律。方法:采用生物信息学软件和网上数据库对核酸蛋白质序列进行同源比较,结构域分析和进化树绘制。结果:人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族一级结构、二级结构均有较高的同源性,系统进化树显示各成员来源于同一祖先并在不同时期分野。结论:各成员来自于同一祖先的同一家族,其进化方式属于趋异性进化。

关键词：多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶序列比较结构域系统进化树

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人类新型β3半乳糖基转移酶基因β3GalT7的克隆和鉴定

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生物化学与生物物理进展 2005年第2期32卷 140-146页

作者：周嘉梁黄超群吴士良孙其昌雷伟金美芳姜智沈宏杰苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室苏州215007 苏州大学生化工程研究所苏州215007

从人肺cDNA文库中克隆到人类β3-半乳糖基转移酶家族中的一个新成员β3GalT7(AY277592,EC2.4.1.-),并对其进行了鉴定. 该基因定位在人类染色体19q13.2. 它包含一个1 191 bp的开放阅读框(ORF). 编码的蛋白质包括一个信号肽和一个半乳糖... 详细信息

从人肺cDNA文库中克隆到人类β3-半乳糖基转移酶家族中的一个新成员β3GalT7(AY277592,EC2.4.1.-),并对其进行了鉴定. 该基因定位在人类染色体19q13.2. 它包含一个1 191 bp的开放阅读框(ORF). 编码的蛋白质包括一个信号肽和一个半乳糖基转移酶结构域,分子质量和等电点分别为43.3 ku和8.37. 从原核表达中获得的融合蛋白的分子质量和预测相符. RNA印迹杂交显示β3GalT7在肺、喉和回肠组织中高表达,而在舌、乳房、子宫、睾丸等组织中表达较低. 此外半定量RT-PCR显示β3GalT7在人类不同的肿瘤细胞中转录水平有明显差异.

关键词： β3GalT7 克隆 RNA印迹肿瘤细胞株

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干扰素治疗病理性瘢痕的实验研究

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江苏大学学报（医学版） 2004年第4期14卷 282-284页

作者：孙其昌周嘉梁王秀珍周迎会吴士良苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室苏州大学医学院生化工程研究所江苏苏州215007

目的 :研究体外干扰素 (INF)对瘢痕组织成纤维细胞 (FB)中转化生长因子 β1(TGF β1)、血小板衍生生长因子BB(PDGF BB)、基质金属蛋白酶 (MMP 1)以及糖基转移酶 (ppGalNAc T2 )的mRNA表达的影响 ,以求阐明干扰素对病理性瘢痕的作用机理... 详细信息

目的 :研究体外干扰素 (INF)对瘢痕组织成纤维细胞 (FB)中转化生长因子 β1(TGF β1)、血小板衍生生长因子BB(PDGF BB)、基质金属蛋白酶 (MMP 1)以及糖基转移酶 (ppGalNAc T2 )的mRNA表达的影响 ,以求阐明干扰素对病理性瘢痕的作用机理。方法 :组织块法培养瘢痕组织FB ,传代后分成 3组①对照组 :生理盐水处理 ;②低浓度组 :10 0U/mlINF α2b处理 ;③高浓度组 :10 0 0 0U/mlINF α2b处理 ;RT PCR检测TGF β1、MMP 1、PDGF BB及ppGalNAc T2表达。结果 :体外培养瘢痕FB经 10 0U/ml及 10 0 0 0U/ml干扰素α 2b处理后 ,RT PCR检测TGF β1、PDGF BB及pp GalNAc T2表达降低 ,MMP 1表达升高 ,呈显著差异 ,且具有浓度依赖性。结论 :干扰素α2b对瘢痕FB具有抑制作用 ,其机理可能与多种细胞因子有关 ,如TGF β1、PDGF BB。

关键词：增生性瘢痕干扰素α2b TGF-β1 PDGF-BB MMP-1 ppGalNAcT2 治疗病理性瘢痕实验转化生长因子β1 血小板衍生生长因子BB 糖基转移酶基质金属蛋白酶

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