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中国生物化学与分子生物学报 2005年第4期21卷 476-481页

作者：金美芳丁向明仇灏吴士良周嘉梁郭向红潘浩苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室

多肽∶N乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAcT)是催化O糖基化的起始酶,在O聚糖的形成中起着关键的作用.为更好地研究该家族酶的结构与功能,采用PCR技术从pDONR201T2得到ppGalNAcT2全长编码序列,亚克隆至原核表达载体pGEX4T1,转化大肠杆菌BL21... 详细信息

多肽∶N乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAcT)是催化O糖基化的起始酶,在O聚糖的形成中起着关键的作用.为更好地研究该家族酶的结构与功能,采用PCR技术从pDONR201T2得到ppGalNAcT2全长编码序列,亚克隆至原核表达载体pGEX4T1,转化大肠杆菌BL21,获得相应表达产物,用谷胱甘肽S转移酶(GST)亲和层析柱进行纯化,并进行了Western印迹检测和初步的酶活测定.为进一步研究其功能还在结构研究上利用网络结构模拟SWISSMODEL服务器对ppGalNAcT2的蓖麻蛋白样结构域进行结构模拟.成功构建了原核表达载体pGEX4T1T2,获得有效表达和纯化,并初步鉴定了其活性,同时预测了其可能的三维结构和活性位点.

关键词：多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶融合表达谷胱甘肽S-转移酶亲和柱蛋白印迹蓖麻蛋白样结构域结构模拟

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人多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶2基因反义RNA表达质粒的构建及其功能的初步研究

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中国生物化学与分子生物学报 2006年第1期22卷 43-48页

作者：仇灏金美芳周迎会孙其昌刘可人沈宏杰吴士良苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室苏州215007

反义封闭人多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(pp-GalNAc-T2)的基因表达,对胃癌细胞SGC7901中转化生长因子-β1(TGF-β1)与基质金属蛋白酶2(MMP2)基因表达及细胞增殖有影响.在对几株肿瘤细胞的pp-GalNAc-T2基因表达水平进行分析后,以高表达pp... 详细信息

反义封闭人多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(pp-GalNAc-T2)的基因表达,对胃癌细胞SGC7901中转化生长因子-β1(TGF-β1)与基质金属蛋白酶2(MMP2)基因表达及细胞增殖有影响.在对几株肿瘤细胞的pp-GalNAc-T2基因表达水平进行分析后,以高表达pp-GalNAc-T2的人胃癌细胞株SGC7901的总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增两段不同长度pp-GalNAc-T2基因片段,构建反义表达载体转染胃癌细胞SGC7901,通过G418筛选,建立一系列旨在封闭胃癌细胞SGC7901ppGalNAc-T2基因表达的亚细胞克隆.通过流式细胞术、荧光显微镜、RT-PCR及Western印迹检测反义封闭pp-GalNAc-T2基因RNA表达后胃癌细胞SGC7901增殖以及TGF-β1、MMP2表达水平的变化.反义封闭pp-GalNAc-T2基因表达后,胃癌细胞SGC7901 pp-GalNAc-T2的表达水平明显降低,细胞分裂增殖减慢,表明反义封闭pp-GalNAc-T2基因表达对胃癌细胞SGC7901的生长增殖有影响.结果还显示,反义封闭pp-GalNAc-T2基因表达可使TGF-β1、MMP2基因在mRNA与蛋白质表达水平均增加,提示pp-GalNAc-T2基因表达可能对胃癌细胞SGC7901浸润转移产生影响.以上结果表明,pp-GalNAc-T2基因在肿瘤细胞中广泛表达,并可能与肿瘤的增殖及浸润转移相关.

关键词：多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶基质金属蛋白酶转化生长因子-β1 SGC7901细胞

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人类新型β3半乳糖基转移酶基因β3GalT7的克隆和鉴定

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生物化学与生物物理进展 2005年第2期32卷 140-146页

作者：周嘉梁黄超群吴士良孙其昌雷伟金美芳姜智沈宏杰苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室苏州215007 苏州大学生化工程研究所苏州215007

从人肺cDNA文库中克隆到人类β3-半乳糖基转移酶家族中的一个新成员β3GalT7(AY277592,EC2.4.1.-),并对其进行了鉴定. 该基因定位在人类染色体19q13.2. 它包含一个1 191 bp的开放阅读框(ORF). 编码的蛋白质包括一个信号肽和一个半乳糖... 详细信息

从人肺cDNA文库中克隆到人类β3-半乳糖基转移酶家族中的一个新成员β3GalT7(AY277592,EC2.4.1.-),并对其进行了鉴定. 该基因定位在人类染色体19q13.2. 它包含一个1 191 bp的开放阅读框(ORF). 编码的蛋白质包括一个信号肽和一个半乳糖基转移酶结构域,分子质量和等电点分别为43.3 ku和8.37. 从原核表达中获得的融合蛋白的分子质量和预测相符. RNA印迹杂交显示β3GalT7在肺、喉和回肠组织中高表达,而在舌、乳房、子宫、睾丸等组织中表达较低. 此外半定量RT-PCR显示β3GalT7在人类不同的肿瘤细胞中转录水平有明显差异.

关键词： β3GalT7 克隆 RNA印迹肿瘤细胞株

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O-糖基化位点预测及糖基化酶催化特点

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生命的化学 2006年第1期26卷 25-27页

作者：刘可人金美芳吴士良苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室苏州大学生化工程研究所苏州215123

O-糖链维持所连接蛋白质部分的空间构象。O-糖基化作为生物体内重要的生物过程,其起始步骤具有复杂的高度选择性,迄今为止还未发现固定的模式。人们通过比较已知O-糖基化部位周围的氨基酸序列,推测出O-糖基化位点的一些规律及其酶的催... 详细信息

O-糖链维持所连接蛋白质部分的空间构象。O-糖基化作为生物体内重要的生物过程,其起始步骤具有复杂的高度选择性,迄今为止还未发现固定的模式。人们通过比较已知O-糖基化部位周围的氨基酸序列,推测出O-糖基化位点的一些规律及其酶的催化特性。

关键词： O-糖基化黏蛋白脯氨酸串联重复 ppGaNTases

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慢性ITP患者血浆胸腺肽α1检测的临床意义

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江苏医药 2005年第4期31卷 307-308页

作者：汪家敏王兆钺苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室215006 苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所

胸腺肽α1(Tα1)是哺乳动物的重要生物活性物质,对调节免疫功能、维持免疫系统的动态平衡具有重要作用[1].我们运用ELISA法[2]检测了慢性特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者血浆Tα1水平,并与非免疫性血小板减少患者进行比较,以进一步探讨... 详细信息

胸腺肽α1(Tα1)是哺乳动物的重要生物活性物质,对调节免疫功能、维持免疫系统的动态平衡具有重要作用[1].我们运用ELISA法[2]检测了慢性特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者血浆Tα1水平,并与非免疫性血小板减少患者进行比较,以进一步探讨ITP的发病机制.

关键词：患者血浆特发性血小板减少性紫癜(ITP) 胸腺肽α1 慢性ITP 临床意义 ELISA法检测免疫性血小板减少生物活性物质调节免疫功能哺乳动物动态平衡免疫系统发病机制 Tα1

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多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2真核表达载体的构建及在SHG-44细胞的表达

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江苏大学学报（医学版） 2004年第4期14卷 277-279,281页

作者：金美芳潘浩郭向红仇灏吴士良苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室

目的 :为探讨O 糖基化在肿瘤发生发展及转移中的作用和功能 ,构建pcDNA3/ppGalNAc T2真核表达质粒并转染人神经胶质瘤细胞SHG 4 4。方法 :采用PCR技术从pDONR2 0 1 T2得到ppGalNAc T2全长编码序列 ,亚克隆至真核表达载体pcDNA 3 1,脂质... 详细信息

目的 :为探讨O 糖基化在肿瘤发生发展及转移中的作用和功能 ,构建pcDNA3/ppGalNAc T2真核表达质粒并转染人神经胶质瘤细胞SHG 4 4。方法 :采用PCR技术从pDONR2 0 1 T2得到ppGalNAc T2全长编码序列 ,亚克隆至真核表达载体pcDNA 3 1,脂质体介导基因转染人神经胶质瘤细胞SHG 4 4细胞 ,采用RT PCR法检测重组质粒的表达。结果 :酶切图谱分析和基因测序证实pcDNA3 1 T2真核表达质粒构建成功。RT PCR显示转染细胞有T2的表达。结论 :成功构建了真核表达载体pcDNA3 1 T2 ,并成功转染入SHG 4 4细胞 ,为进一步研究ppGalNAcT2的功能奠定了基础。

关键词：多肽 N-乙酰氨基半乳糖转移酶2 神经胶质瘤细胞 O-糖基化真核表达载体肿瘤发展肿瘤转移

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人多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2):RNA干扰载体的构建及其功能的初步研究

人多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2):RNA干扰载体的构...

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华东六省一市生物化学与分子生物学学会2006年学术交流会

作者：朱燕仇灏刘可人吴士良苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室

目的:人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAcT)催化O-聚糖合成的第一步反应,将 UDP-GalNAc中的GalNAc基转移至蛋白多肽链上特定序列中的Set或Thr,从而合成GalNAcα-O- Ser／Thr,初步研究提示该酶可能与肿瘤的生长和转移有关。ppGalN... 详细信息

目的:人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAcT)催化O-聚糖合成的第一步反应,将 UDP-GalNAc中的GalNAc基转移至蛋白多肽链上特定序列中的Set或Thr,从而合成GalNAcα-O- Ser／Thr,初步研究提示该酶可能与肿瘤的生长和转移有关。ppGalNAc-T2是该家族中组织分布及底物谱较广的成员,作为O-糖链合成的起始酶,很有可能是O-糖链合成的限速酶,有着重要的生物学意义。本文旨在探讨ppGalNAc-T2在肿瘤浸润转移及增殖中的作用。方法:RNA干扰技术是2001年首次应用于哺乳动物细胞的新的分子生物学技术,是研究转录后调控的有效工具,可用于功能基因组研究以及基因治疗等临床应用。遵循RNA干扰目标序列的选取原则,利用互联网资源,对ppGalNAc-T2基因 mRNA序列设计五条可能的小干扰RNA(siRNA),并且由PCR方法扩增得到带有RNA pol Ⅱ启动子的siRNA内源表达系统,脂质体介导转染至人胃癌细胞株SOC7901,运用RT-PCR方法检测转染后各细胞株ppGalNAc-T2 mRNA水平的表达变化,筛选出对ppGalNAc-T2 mRNA水平表达抑制效率最高的siRNA;化学合成带荧光标记的该段RNA Oligo,转染细胞并用荧光显微镜观察转染情况,RTPCR 方法检测转染后细胞ppGalNAc-T2的表达,进一步鉴定该siRNA对ppGalNAc-T2的抑制作用;将这段siRNA插入到RNA干扰真核表达载体pSilenCircle中,脂质体介导转染人胃癌细胞株 SGC7901,经G418筛选后,利用RT-PCR和Western blot方法检测MMP2、MMP14、TGF-β1等肿瘤浸润转移相关基因的表达变化,通过MTT法检测对细胞增殖的影响。结果:筛选得到能高效引起ppGalNAc -T2基因表达沉默的siRNA,成功构建了ppGalNAc-T2的RNA干扰真核表达载体并转染入细胞,得到稳定的ppGalNAc-T2基因敲减细胞株。转染了重组载体后的细胞,随着ppGalNAc-T2表达的下调,MMP2、MMP14、TGF-β1等基因在mRNA和蛋白质水平的表达不同程度地增高了,细胞增殖水平则较原细胞株有所降低。结论:稳定的ppGalNAc-T2基因敲减细胞株为今后进一步深入研究PPGalNAc -T2的生物学功能开辟了新道路。同时由于TGF-β1、MMP2、MMP14都是与肿瘤的浸润转移、增殖相关的指标,因此推测ppGalNAc-T2与肿瘤的浸润转移、增殖密切相关。

关键词： RNA 肿瘤浸润转移半乳糖转移酶 ppGalNAc-T2 乙酰氨基干扰载体初步研究

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编码蛋白激酶的人类新基因NEK8的电子克隆

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江苏大学学报（医学版） 2004年第5期14卷 389-393,396页

作者：黄超群翟倩婷周嘉梁吴士良苏州大学医学院基础医学系生物化学和分子生物学教研室江苏苏州215007

目的 :克隆人类基因组中小鼠NEK8基因的同源物。方法 :用同源筛选策略 ,以小鼠NEK8基因作为信息探针 ,在GenBank数据库中进行TBLASTN分析 ,将获得的高度同源的EST用VECTORNTⅠ软件拼接成重叠群。利用BLAT分析确定NEK8基因的基因组结构... 详细信息

目的 :克隆人类基因组中小鼠NEK8基因的同源物。方法 :用同源筛选策略 ,以小鼠NEK8基因作为信息探针 ,在GenBank数据库中进行TBLASTN分析 ,将获得的高度同源的EST用VECTORNTⅠ软件拼接成重叠群。利用BLAT分析确定NEK8基因的基因组结构以及染色体定位。利用SMART网上分析工具进行结构域预测 ,利用Unigene数据库进行表达谱分析。结果 :电子克隆到人类NEK8新基因cDNA序列 ,长度为 2 85 8bp ,含完整的ORF ,编码一条 6 92个氨基酸的多肽 ,被预测的分子量为 74 8KDa ,等电点 8 0 4。定位在染色体 17q11 2 ,由 15个外显子和 14个内含子组成。其编码蛋白含有一个苏氨酸 /丝氨酸蛋白激酶结构域 ,与NEK家族成员有较高的同源性。电子表达谱分析显示NEK8基因在胎盘 ,胃 ,结肠 ,眼 ,胰腺 ,骨骼 ,肾 ,子宫等组织中表达。结论 :电子克隆到编码苏氨酸

关键词：新基因小鼠蛋白激酶编码蛋白人类表达谱结肠电子克隆结构域内含子

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结晶紫-杂多酸分光光度法测定地表水中痕量磷酸盐和硅酸盐

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江苏大学学报（医学版） 2005年第6期15卷 514-515页

作者：顾范博吴士良苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室江苏苏州215123

磷酸盐和硅酸盐的测定一般都用分光光度法中的钼黄法和钼蓝法.钼黄法相当稳定,但灵敏度低;钼蓝法的灵敏度虽有所提高,但这些有色配合物的摩尔吸光系数都未超过1 × 104.

关键词：结晶紫-杂多酸分光光度法磷酸盐硅酸盐

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人类多肽 N-乙酰氨基半乳糖转移酶2抗原表位分析、抗体制备及亚细胞定位

人类多肽 N-乙酰氨基半乳糖转移酶2抗原表位分析、抗体制备及亚细...

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华东六省一市生物化学与分子生物学学会2006年学术交流会

作者：杭赛宇胡鹤娟朱燕马震宇闫石吴士良苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室生化工程研究所苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室生化工程研究所苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室生化工程研究所苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室生化工程研究所苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室生化工程研究所苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室生化工程研究所

为了研究人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2)蛋白表达的亚细胞结构定位,制备特异性抗体。我们联合应用了多种方法对多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2的二级结构和表面特性进行了细致地分析,发现其优势抗原表位均位于蓖麻样结... 详细信息

为了研究人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2)蛋白表达的亚细胞结构定位,制备特异性抗体。我们联合应用了多种方法对多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2的二级结构和表面特性进行了细致地分析,发现其优势抗原表位均位于蓖麻样结构域中;进一步采用了RT-PCR方法克隆到蓖麻样结构域cDNA片段,将获得的蓖麻样结构域cDNA片段定向插入到表达载体PGEX-5X-3中,且导入大肠杆菌,诱导表达,获重组融合蛋白;将得到的重组融合蛋白免疫新西兰大白兔,我们获得了兔抗人ppGalNAc-T2的多克隆抗体,并进行ELISA法检测抗体效价,抗体滴度为1:3200,并进行了有效性检测;蛋白质印迹实验证实此多克隆抗体具有较好的反应性和特异性。通过荧光免疫细胞化学进行亚细胞定位,发现ppGalNAc-T2主要表达在细胞核旁的Golgi复合体,说明它们主要分布在Golgi复合体上,证实它们是在Golgi复合体参与蛋白质的糖链修饰。本文特异性扩增和表达蓖麻样结构域并制备了抗体,有利于进一步阐明RICIN结构域的功能,为研究多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2及其家族的结构和功能打下基础。

关键词：多肽 N-乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAc-T) 抗原表位抗体亚细胞定位

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