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真核表达载体pEGFP-C2-miR-126-sponge的构建及其表达活性研究

第三军医大学学报 2014年第1期36卷 33-37页

作者：胡燕廖珍媛李永菊陈超朱顺飞熊思东徐林遵义医学院免疫学教研室贵州遵义563000 苏州大学医学部基础医学与生物科学学院江苏苏州215000

目的构建靶向miR-126的真核表达载体pEGFP-C2-miR-126-海绵体(sponge),并探讨其下调miR-126的表达对肝癌HepG2细胞体外生长的影响,为后续深入研究miR-126在肝癌发生中的作用提供前期实验基础。方法合成miR-126-sponge,构建pEGFP-C2-miR-... 详细信息

目的构建靶向miR-126的真核表达载体pEGFP-C2-miR-126-海绵体(sponge),并探讨其下调miR-126的表达对肝癌HepG2细胞体外生长的影响,为后续深入研究miR-126在肝癌发生中的作用提供前期实验基础。方法合成miR-126-sponge,构建pEGFP-C2-miR-126-sponge真核表达载体,体外瞬时转染肝癌细胞HepG2,荧光显微镜下观察EGFP的表达情况;Real-time PCR检测细胞中miR-126的表达水平;MTT法和克隆形成实验检测细胞的增殖变化;划痕实验观察细胞的体外迁移能力改变。结果成功构建pEGFP-C2-miR-126-sponge真核表达载体(命名为p-miR-126-sp);Real-time PCR结果显示,与对照组(p-Cont)相比,p-miR-126-sp组中miR-126表达水平显著降低(P<0.05);MTT检测发现,p-miR-126-sp组中细胞增殖数目明显减少(P<0.05);此外,p-miR-126-sp组的克隆形成数和细胞迁移数均明显减少(P<0.05)。结论 miR-126-sponge可显著下调miR-126的表达水平进而抑制肝癌细胞HepG2的体外增殖及迁移能力。

关键词： miR-126-sponge 肝癌 HepG2细胞细胞增殖

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人羊水干细胞分化为汗腺样细胞的研究

人羊水干细胞分化为汗腺样细胞的研究

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第十四届全国肿瘤生物治疗大会

作者：梁含思孙青李芳甄允方许云云刘尧秦明德张学光江苏省干细胞与生物医用材料重点实验室苏州大学基础医学与生物科学学院人体解剖与组织胚胎学教研室苏州大学附属儿童医院小儿骨科诊断与治疗中心苏州大学附属儿童医院儿科研究所苏州大学附属第一医院临床免疫研究所

研究背景:大面积皮肤严重烧伤的救治是目前亟待解决的医学和社会问题。严重烧伤获救的病人由于无汗腺功能的疤痕组织取代皮肤使其终生丧失正常皮肤功能,严重影响病人的生活质量。干细胞可以定向分化为具有汗腺细胞表型的汗腺样细胞,但... 详细信息

研究背景:大面积皮肤严重烧伤的救治是目前亟待解决的医学和社会问题。严重烧伤获救的病人由于无汗腺功能的疤痕组织取代皮肤使其终生丧失正常皮肤功能,严重影响病人的生活质量。干细胞可以定向分化为具有汗腺细胞表型的汗腺样细胞,但是对于汗腺组织的功能性重建还未见报道,且干细胞分化为汗腺样细胞的具体机制尚待探讨。人羊水干细胞是介于成体干细胞和胚胎干细胞之间的一类干细胞,其作为汗腺细胞再生的种子细胞具有独特的优势。目的:利用条件培养基诱导的方法将人羊水干细胞诱导为汗腺样细胞,为其他类型干细胞分化为汗腺样细胞提供理论基础,使汗腺的功能性重建和功能性皮肤修复成为可能,具有研究的创新性和潜在的应用价值。方法:收集培养过人汗腺细胞的KGM2培养基,用0.22μm的滤器过滤,收集到的培养基为CM;取稳定培养的人羊水干细胞,以5×104个/孔的密度接种于6孔板中,待细胞贴壁后,添加汗腺细胞诱导培养基(SGDM,汗腺细胞培养基:CM=1:1,额外添加50 ng/ml EGF);诱导分化21 d后得到汗腺样细胞;光学显微镜观察其细胞形态;Real-time PCR分析其基因表达情况;流式细胞仪检测汗腺相关蛋白表达;免疫荧光染色检测汗腺相关蛋白表达;电镜技术观察细胞内部结构;3D组织培养方法检测分化后的汗腺样细胞形成汗腺样结构的能力,并对形成的汗腺样结构进行免疫荧光染色检测。结果:分化过程中,由人羊水干细胞诱导分化得到的汗腺样细胞与体外培养的人汗腺细胞形态相似;诱导后的分化比例约为30%;Real-time PCR和免疫荧光结果显示,诱导后的细胞表达汗腺细胞相关指标EDA、EDAR、K8和CEA;透射电镜结果显示诱导后的细胞可以观察到与汗腺细胞相似的结构-微绒毛;3D组织培养结果显示诱导后的K8+细胞可以在胶中形成汗腺样结构,使汗腺样细胞分化更加完善。结论:利用条件培养基可以将人羊水干细胞诱导成为汗腺样细胞,并能在胶中形成汗腺样结构。

关键词：人羊水干细胞干细胞分化汗腺细胞汗腺样结构

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人羊水干细胞作为汗腺重建种子细胞的研究

人羊水干细胞作为汗腺重建种子细胞的研究

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第十届全国免疫学学术大会

作者：梁含思孙青李芳甄允方许云云秦明德张学光苏州大学附属第一医院临床免疫研究所江苏省干细胞与生物医用材料重点实验室苏州大学基础医学与生物科学学院人体解剖与组织胚胎学教研室苏州大学附属儿童医院小儿骨科诊断与治疗中心苏州大学附属儿童医院儿科研究所

目的 :利用条件培养基诱导的方法将人羊水干细胞诱导为汗腺样细胞,研究人羊水干细胞重建汗腺的可能性,使汗腺的功能性重建和功能性皮肤修复成为可能,具有创新性和潜在的应用价值。方法 :取稳定培养的人羊水干细胞,以5×104个/孔的... 详细信息

目的 :利用条件培养基诱导的方法将人羊水干细胞诱导为汗腺样细胞,研究人羊水干细胞重建汗腺的可能性,使汗腺的功能性重建和功能性皮肤修复成为可能,具有创新性和潜在的应用价值。方法 :取稳定培养的人羊水干细胞,以5×104个/孔的密度接种于6孔板中,待细胞贴壁后,添加汗腺细胞诱导培养基(SGDM,汗腺细胞培养基:CM=1:1,额外添加50ng/ml EGF。CM为培养过人汗腺细胞的KGM2培养基,用0.22μm的滤器过滤,收集到的培养基),诱导分化21天后得到汗腺样细胞;光学显微镜观察其细胞形态;Realtime-PCR分析其基因表达情况;流式细胞仪检测汗腺相关蛋白表达;免疫荧光染色检测汗腺相关蛋白表达;电镜技术观察细胞内部结构;3D组织培养方法检测分化后的汗腺样细胞形成汗腺样结构的能力,并对形成的汗腺样结构进行免疫荧光染色检测;汗腺样细胞与T细胞共培养,CCK8检测其对活化T细胞增殖的抑制作用。结果 :人羊水干细胞分化后得到的汗腺样细胞与体外培养的人汗腺细胞形态相似;诱导分化比例约为30%;Realtime-PCR和免疫荧光结果显示,诱导后的汗腺样细胞表达汗腺细胞相关指标EDA、EDAR、K8和CEA;透射电镜结果显示诱导后的细胞可以观察到与汗腺细胞相似的结构-微绒毛;3D组织培养结果显示诱导后的K8+细胞可以在胶中形成汗腺样结构,使汗腺样细胞分化更加完善;T细胞增殖实验结果显示汗腺样细胞具有抑制T细胞增殖的能力。结论 :人羊水干细胞是介于成体干细胞和胚胎干细胞之间的一类干细胞,它具有较高的增殖能力和分化能力,以及低免疫源性,使其作为汗腺重建的种子细胞具有独特的优势。利用条件培养基可以将人羊水干细胞诱导成为汗腺样细胞,并能在胶中形成汗腺样结构。汗腺样细胞与人羊水干细胞相似具有低免疫源性,为汗腺的功能性重建提供了良好的种子细胞。

关键词：人羊水干细胞干细胞分化汗腺样结构低免疫源性汗腺重建

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腺病毒介导的ING4基因对人肺腺癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用及其分子机制

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中国肺癌杂志 2014年第2期17卷 142-147页

作者：黄锦宏杨吉成凌春华赵大国谢宇锋由振华常熟市第二人民医院呼吸内科常熟215500 苏州大学医学部基础医学与生物科学学院细胞与分子生物学教研室苏州215123 苏州大学附属第一医院呼吸内科苏州215006

背景与目的肿瘤生长抑制因子4(inhibitor of growth 4,ING4)基因是一种重要的肿瘤抑制因子,研究发现ING4基因对多种肿瘤细胞具有抑癌作用。本研究旨在探讨ING4基因对人肺腺癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用及其潜在的作用机制。方法采用SPC-A... 详细信息

背景与目的肿瘤生长抑制因子4(inhibitor of growth 4,ING4)基因是一种重要的肿瘤抑制因子,研究发现ING4基因对多种肿瘤细胞具有抑癌作用。本研究旨在探讨ING4基因对人肺腺癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用及其潜在的作用机制。方法采用SPC-A1细胞株建立肺腺癌裸鼠移植瘤模型,15只荷瘤裸鼠随机等分为PBS组、腺病毒组(Ad-GFP组)、腺病毒介导的ING4组(Ad-ING4组),上述各组进行局部干预用药,动态测量肿瘤体积,治疗结束后摘取瘤体称重并计算瘤重抑瘤率;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测瘤体内细胞凋亡情况,免疫组织化学SP法检测天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、环氧化酶-2(COX-2)、Fas与FasL的表达。结果 Ad-ING4组的肿瘤体积、瘤重均呈现明显下降,与Ad-GFP组抑瘤率(1.31%±0.31%)比较,差异有统计学意义(P<0.05),其抑瘤率为(33.17%±5.24%);Ad-ING4组的凋亡指数为(69.23%±6.53%),与PBS组(17.04%±1.10%)、Ad-GFP组(18.81%±1.93%)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。SP法检测结果显示,Ad-ING4可明显上调Caspase-3、Fas与FasL表达,下调COX-2表达。结论 ING4具有抑制肺腺癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用,该作用机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关。

关键词：生长抑制因子4 肺肿瘤移植瘤

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人羊水干细胞作为汗腺重建种子细胞的研究

人羊水干细胞作为汗腺重建种子细胞的研究

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中国免疫学会第十届全国免疫学学术大会

作者：梁含思孙青李芳甄允方许云云秦明德张学光苏州大学附属第一医院临床免疫研究所江苏省干细胞与生物医用材料重点实验室苏州大学基础医学与生物科学学院人体解剖与组织胚胎学教研室苏州大学附属儿童医院小儿骨科诊断与治疗中心苏州大学附属儿童医院儿科研究所苏州大学附属第一医院临床免疫研究所江苏省干细胞与生物医用材料重点实验室

目的：利用条件培养基诱导的方法将人羊水干细胞诱导为汗腺样细胞,研究人羊水干细胞重建汗腺的可能性,使汗腺的功能性重建和功能性皮肤修复成为可能,具有创新性和潜在的应用价值.方法：取稳定培养的人羊水干细胞,以5×104个/孔的密... 详细信息

目的：利用条件培养基诱导的方法将人羊水干细胞诱导为汗腺样细胞,研究人羊水干细胞重建汗腺的可能性,使汗腺的功能性重建和功能性皮肤修复成为可能,具有创新性和潜在的应用价值.方法：取稳定培养的人羊水干细胞,以5×104个/孔的密度接种于6孔板中,待细胞贴壁后,添加汗腺细胞诱导培养基(SGDM,汗腺细胞培养基：CM=1∶1,额外添加50ng/ml EGF.

关键词：人羊水干细胞干细胞分化汗腺样结构低免疫源性汗腺重建

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人类多重剪接RNA结合蛋白类基因的克隆和分析

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江苏医药 2013年第6期39卷 624-628页

作者：张雅娟肖娟娟鲁德意王尉平苏州卫生职业技术学院检验药学系江苏省215009 苏州大学医学部基础医学与生物科学学院生物化学与分子生物学教研室

目的通过同源筛选的方法拼接并克隆人类多重剪接RNA结合蛋白2(RBPMS2)基因。方法采用同源筛选策略,以人RBPMS2基因作为信息探针,在GeneBank数据库中进行分析,将获得的高度同源的表达序列标签(EST)用VECTOR NTI软件拼接成重叠群。通过UCS... 详细信息

目的通过同源筛选的方法拼接并克隆人类多重剪接RNA结合蛋白2(RBPMS2)基因。方法采用同源筛选策略,以人RBPMS2基因作为信息探针,在GeneBank数据库中进行分析,将获得的高度同源的表达序列标签(EST)用VECTOR NTI软件拼接成重叠群。通过UCSCGenome Blat Server分析,确定RBPMS2基因的染色体定位,SMART网上分析工具进行结构域预测,Unigene数据库进行表达谱分析。结果电子克隆到人类RBPMS2新基因cDNA序列,含完整的开放阅读框(ORF)。RBPMS2基因编码的多肽由209个氨基酸组成,分子量22.5KDa,等电点8.63。SMART分析显示RBPMS2蛋白包含1个RNA识别模体(RRM)结构域。RBPMS2基因位于第15号染色体,定位在15q22.31,由7个外显子和6个内含子组成。电子表达谱分析显示RBPMS2在卵细胞、受精卵、囊胚、不同发育阶段的胚胎、膀胱、肾脏等组织中高表达。结论分析并克隆到了一个新的人类RBPMS2基因。

关键词：多重剪接RNA结合蛋白克隆

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B7-H4实时荧光定量PCR检测方法的建立及其在人胃癌组织中的初步应用

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中国医药生物技术 2013年第2期8卷 81-87页

作者：王琦蒋敬庭魏文祥苏州大学医学部基础医学与生物科学学院细胞与分子生物学教研室 215123 苏州大学附属第三医院肿瘤生物诊疗中心常州213003

目的建立实时荧光定量PCR检测B7-H4的方法并初步应用于人胃癌组织。方法将B7-H4和内参GAPDH的PCR扩增产物经测序鉴定正确后克隆入载体pMD19－T，构建重组质粒标准品，并纯化、定量及梯度稀释，分别建立B7．H4和GAPDH的标准曲线，应用实... 详细信息

目的建立实时荧光定量PCR检测B7-H4的方法并初步应用于人胃癌组织。方法将B7-H4和内参GAPDH的PCR扩增产物经测序鉴定正确后克隆入载体pMD19－T，构建重组质粒标准品，并纯化、定量及梯度稀释，分别建立B7．H4和GAPDH的标准曲线，应用实时荧光定量PCR检测8例人胃癌组织中的B7一H4相对于GAPDH的表达情况。结果B7．H4的最低检测拷贝数为5．27拷贝，线性范围5．27×10^1～5．27×10^7拷贝，标准曲线方程Y=-3．1395X＋41．805，直线回归相关系数r=0．994904，批间变异系数范围2.39％～3．59％，扩增效率108．2％；GAPDH的最低检测拷贝数为38．6拷贝，线性范围3．86×10^2～3．86×10^7拷贝，标准曲线方程Y=-3．2436x＋41．083，直线回归相关系数r=0．998913，批间变异系数范围2．26％～3．86％，扩增效率103．4％。8例人胃癌组织的B7．H4相对于GAPDHmRNA表达水平在0．044～0．888之间。结论荧光定量PCR检测B7．H4的方法具备较高的敏感性和特异性，且系统有良好的重复性和线性范围。

关键词：胃肿瘤实时荧光定量PCR B7-H4

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腺病毒载体介导IL-24基因对肺癌细胞的化疗增敏效应

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苏州大学学报（医学版） 2012年第3期32卷 322-325页

作者：李畅赵军李印梁光辉盛伟华杨吉成苏州大学附属第一医院心胸外科江苏苏州215006 河南省肿瘤医院胸外科河南郑州450052 苏州大学医学部基础医学与生物科学学院细胞与分子生物学教研室江苏苏州215123

目的研究携带人IL-24基因腺病毒载体(Ad-IL-24)联用顺铂(DDP)对人非小细胞肺癌NCI-H460细胞生长和凋亡的影响。方法取对数生长期的NCI-H460细胞,MTT比色法检测Ad-IL-24联合DDP对细胞生长的影响,流式细胞仪分析细胞周期及检测细胞凋亡率... 详细信息

目的研究携带人IL-24基因腺病毒载体(Ad-IL-24)联用顺铂(DDP)对人非小细胞肺癌NCI-H460细胞生长和凋亡的影响。方法取对数生长期的NCI-H460细胞,MTT比色法检测Ad-IL-24联合DDP对细胞生长的影响,流式细胞仪分析细胞周期及检测细胞凋亡率。结果 Ad-IL-24联合DDP对NCI-H460细胞的生长抑制作用和诱导凋亡效应均明显优于单用Ad-IL-24和单用化疗药物DDP,且G2/M期细胞比例显著增加(P<0.05或<0.01)。结论 Ad-IL-24能提高NCI-H460肺癌细胞对化疗药物DDP的敏感性。

关键词：腺病毒人白细胞介素-24 肺癌基因治疗顺铂

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Ad-LIF-OSM双基因转染饲养细胞对脐血造血细胞体外增殖和分化的影响

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中华微生物学和免疫学杂志 2011年第10期31卷 865-869页

作者：包婉蓉郁心盛伟华张凤娟王家融杨吉成缪竞诚苏州大学医学部基础医学与生物科学学院细胞与分子生物学教研室 215123

目的构建表达人白血病抑制因子（LIF）和抑瘤素M（OSM）双基因的WI-38人胚肺成纤维细胞，并以此细胞作为饲养层细胞观察其对CD34造血干／祖细胞体外增殖和分化的影响。方法以双启动子转移载体pAdTrack-CMV-LIF-polyA＋promoter。为基础... 详细信息

目的构建表达人白血病抑制因子（LIF）和抑瘤素M（OSM）双基因的WI-38人胚肺成纤维细胞，并以此细胞作为饲养层细胞观察其对CD34造血干／祖细胞体外增殖和分化的影响。方法以双启动子转移载体pAdTrack-CMV-LIF-polyA＋promoter。为基础，将OSM基因片段酶切后插入，构建出转移质粒pAdTrack-CMV-LIF-polyA＋promoter。OSM。将构建正确的转移质粒与腺病毒骨架质粒共转化，获得重组腺病毒载体pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-LIF-polyA＋promoter。OSM，通过包装，收获重组腺病毒（Ad-LIF-OSM）。将重组腺病毒感染饲养层细胞，经***、ELISA法检测外源基因在细胞中的表达；体外与CD34造血干／祖细胞共培养后，通过Transwell法和细胞计数检测，比较各实验组干／祖细胞体外扩增与分化情况。结果测序结果显示重组载体中的LIF和OSM基因序列正确；转基因饲养层细胞中能检测到外源LIF和OSM基因的转录和表达；外源LIF和OSM基因在造血干／祖细胞体外培养中能够发挥作用。结论成功构建携带人LIF和OSM的双基因重组腺病毒载体（Ad-LIF-OSM），***在造血干／祖细胞体外培养的过程中能够有效地扩增CD34造血干／祖细胞，并延缓其分化。

关键词：腺病毒白血病抑制因子抑瘤素M 共表达载体造血干/祖细胞

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RMP在肝癌细胞基因组稳定性和凋亡中的作用

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中国生物工程杂志 2011年第4期31卷 12-17页

作者：王晓婷李敏连晓宁杨慧翠曹锴郭云兰仲蕾魏文祥苏州大学基础医学与生物科学学院细胞与分子生物学教研室苏州215123

目的:研究RPB5调节蛋白(RMP)在正常肝细胞及肝癌细胞基因组稳定性中的作用,并探讨其与细胞凋亡的相关性。方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从mRNA水平检测正常细胞系及多种肿瘤细胞系中RMP的表达。不同剂量60Coγ射线照射肝癌细胞S... 详细信息

目的:研究RPB5调节蛋白(RMP)在正常肝细胞及肝癌细胞基因组稳定性中的作用,并探讨其与细胞凋亡的相关性。方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从mRNA水平检测正常细胞系及多种肿瘤细胞系中RMP的表达。不同剂量60Coγ射线照射肝癌细胞SMMC-7721细胞和正常肝细胞HL-7702细胞,RT-PCR法检测RMP的表达,流式细胞技术检测照射肝癌细胞周期变化及细胞凋亡。应用RNA干扰技术研究RMP在肝癌细胞基因组稳定性中的作用。结果:正常细胞系及多种肿瘤细胞系中RMP基因均有不同程度的表达。经60Coγ射线诱导的肝癌细胞及正常肝细胞RMP表达水平明显升高,且有一定剂量依赖性。随着照射剂量增加细胞凋亡明显增多,细胞周期G1期增高,而S期明显降低。RMP被干扰后,电子显微镜观察细胞形态发生明显改变,p21基因表达减弱。结论:RMP具有维持细胞基因组稳定性的潜在作用。RMP的表达与p53、p21等具有一定相关性,可能与后者协同调节细胞凋亡过程。

关键词：肝癌细胞 RNA干扰 RMP基因放疗基因组稳定性

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