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一种致遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症的新突变（Ser250Phe）的鉴定与功能分析

中华医学遗传学杂志 2013年第2期30卷 152-156页

作者：江明华王兆钺余自强苏健曹丽娟张威浙江省温州医学院附属第二医院检验科 325027 苏州大学附属第一医院、江苏省血液研究所、卫生部血栓与止血重点实验室

目的探讨Ser250Phe突变致遗传性凝血因子Ⅶ（coagulation factorⅦ，FⅦ）缺陷的分子机制。方法用STA-R全自动血凝分析仪检测先证者及家系成员的凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶时间（activated partial thromb... 详细信息

目的探讨Ser250Phe突变致遗传性凝血因子Ⅶ（coagulation factorⅦ，FⅦ）缺陷的分子机制。方法用STA-R全自动血凝分析仪检测先证者及家系成员的凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶时间（activated partial thrombinoplastin time，APTT）、纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）及凝血酶时间（thrombin time，TT）；一步法及ELISA分别检测先证者及家系成员凝血因子Ⅶ活性及抗原；PCR扩增先证者及其家系成员因子7基因（factor 7 gene，F7）所有外显子及侧翼序列，直接测序分析；PCR介导质粒DNA定点诱变法构建F7Ser250Phe突变表达质粒，将表达质粒瞬时转染HEK293细胞，一步法测定培养上清FⅦ活性及ELISA及Western印迹测定培养上清及细胞裂解液FⅦ抗原；同时将F7表达质粒与高尔基体或内质网定位的荧光质粒共转染CHO细胞进行亚细胞定位分析。结果先证者及家系成员APTT、TT及FIB均正常，而先证者PT、FⅦ活性及抗原分别为36．5S、4．0％及130．2ng／mL；测序发现先证者F7基因存在g．15975G〉A（IVs6—1G〉A）与g．16750C〉T（Ser250Phe）双杂合突变，其父亲为g．16750C〉T杂合子，母亲为g．15975G〉A杂合子，妹妹不携带这两种突变；HEK293细胞上清中FⅦ250Phe活性为（4．12土0．61）％（以FⅦ250Ser载体转染细胞培养上清FⅦ活性作为100％），培养上清中FⅦ250Ser与FⅦ250Phe抗原水平分别为（37．77±2．30）ng／mL和（4．02±0．52）ng／mL；而细胞裂解液中FⅦ250Ser与FⅦ250Phe抗原水平分别为（172．45±2．25）ng／mL和（130．51±2．32）ng／mL；Western印迹分析示转染了FⅦ250Phe载体的HEK293细胞培养上清无可检测FⅦ抗原，而在细胞裂解液中检测到FⅦ抗原，与ELISA检测结果一致；在CHO细胞表达的重组FⅦ250Phe绿色荧光信号能与核周内质网红色荧光信号重合，而且也与高尔基体红色信号重合，与重组FⅦ250Ser一致。结论复合IVS6—1G〉A与Ser250Phe突变是导致患者遗传性凝血因子Ⅶ缺乏的原因；FⅦSer250Phe突变未见报道，其能正常合成，并转运至内质网及高尔基体，但不能有效分泌至细胞外，可能于细胞内部分降解或由于半衰期缩短而分泌后迅速降解。

关键词：凝血因子Ⅶ缺乏基因突变亚细胞定位

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地西他滨单药五天方案治疗复杂核型骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病疗效观察

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中华血液学杂志 2013年第6期34卷 542-543页

作者：高苏胡晓慧仇惠英徐杨金正明何广胜唐晓文韩悦陈苏宁孙爱宁吴德沛苏州大学附属第一医院血液科、江苏省血液研究所 215006 卫生部血栓与止血重点实验室江苏省临床医学中心

复杂核型异常是指三种或以上附加异常核型染色体。复杂核型急性髓系白血病（AML）属于预后不良组，临床上该组患者诱导缓解率低并容易复发。文献报道40％～70％骨髓增生异常综合征（MDS）患者有克隆性染色体异常。国际预后积分系统（IPS... 详细信息

复杂核型异常是指三种或以上附加异常核型染色体。复杂核型急性髓系白血病（AML）属于预后不良组，临床上该组患者诱导缓解率低并容易复发。文献报道40％～70％骨髓增生异常综合征（MDS）患者有克隆性染色体异常。国际预后积分系统（IPSS）根据核型异常将MDS分为3种不同预后类型，其中复杂核型属于高危组，该组患者中位生存期仅0．4年，转化为急性白血病概率高。近年来我们尝试采用地西他滨单药或者联合化疗治疗伴有复杂核型异常的MDS或AML，对其临床疗效和不良反应进行了初步观察，现将结果报告如下。

关键词：骨髓增生异常综合征急性髓系白血病异常核型地西他滨疗效观察治疗单药复杂核型异常

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1例儿童先天性粒细胞减少症的基因诊断

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临床儿科杂志 2013年第1期31卷 44-47页

作者：王波卢俊乔曼严文华薛胜利苏州大学附属儿童医院江苏苏州215003 苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所卫生部血栓与止血重点实验室江苏苏州215006

目的应用基因诊断方法进一步提高对儿童先天性粒细胞减少症(CN)的认识和诊断水平。方法以1例儿童CN患者为研究对象,收集其临床资料、实验室检查结果,按序检测ELA2、GFI1、HAX1及WASp致病基因突变情况。依上述步骤对患儿分别进行疾病的... 详细信息

目的应用基因诊断方法进一步提高对儿童先天性粒细胞减少症(CN)的认识和诊断水平。方法以1例儿童CN患者为研究对象,收集其临床资料、实验室检查结果,按序检测ELA2、GFI1、HAX1及WASp致病基因突变情况。依上述步骤对患儿分别进行疾病的临床及基因诊断并随访。结果参照诊断标准该患儿诊断为无遗传背景的散发性非综合征性CN;基因检测显示其携带已经报道的ELA2基因突变:c.164G>A;此外患儿中性粒细胞表面G-CSFR表达正常,G-CSFR胞内段未发现获得性截短性突变。结论基因突变检测证实1例儿童CN为ELA2基因突变所致,为该患儿未来的分组临床研究及基因治疗提供依据。

关键词：先天性粒细胞减少症基因诊断 ELA2基因

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血友病A患者血浆抗因子Ⅷ同种抗体的检测及其与因子ⅧC区的关系

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中国实验血液学杂志 2013年第5期21卷 1211-1214页

作者：张露璐余自强万楚成张威章正华阮长耿湖北医药学院附属太和医院血液内科湖北十堰442000 苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所卫生部血栓与止血重点实验室江苏苏州215006

本研究应用快速而敏感的ELISA法检测血友病A患者血浆抗因子Ⅷ同种抗体,并探讨其与因子ⅧC区的关系。收集140例血友病A患者样本,其中重型(FⅧ∶C5%)22例;患者均已经过因子Ⅷ替代治疗。正常对照样本80例。以本室制备的抗因子Ⅷ单克隆抗体... 详细信息

本研究应用快速而敏感的ELISA法检测血友病A患者血浆抗因子Ⅷ同种抗体,并探讨其与因子ⅧC区的关系。收集140例血友病A患者样本,其中重型(FⅧ∶C<1%)84例,中型(FⅧ∶C 1-5%)34例,轻型(FⅧ∶C>5%)22例;患者均已经过因子Ⅷ替代治疗。正常对照样本80例。以本室制备的抗因子Ⅷ单克隆抗体包被酶标板,封闭后加入重组人凝血因子Ⅷ,洗涤后加入待测稀释血浆,再次洗涤后加入HRP标记的羊抗人IgG,OPD显色,记录A490,以正常人血浆为对照,样本A490大于正常人对照3 SD定义为因子Ⅷ抗体阳性。以抗His抗体包被酶标板,封闭后加入本室制备的rFⅧ-C1C2区蛋白,洗涤后加入待测稀释血浆,再次洗涤后加入HRP标记的羊抗人IgG,OPD显色,记录A490,以正常人血浆为对照,样本A490大于正常人对照3 SD定义阳性。结果表明,通过ELISA法检测,56例(40%)血友病A患者血浆抗因子Ⅷ同种抗体阳性,其中46例(82.1%)因子Ⅷ同种抗体阳性的血浆样本中存在与因子ⅧC1C2结合的同种抗体。结论:因子ⅧC功能区是中国血友病A患者因子Ⅷ同种抗体的主要结合部位之一。

关键词：血友病A 因子Ⅷ 同种抗体

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中华医学杂志 2013年第20期93卷 1529-1532页

作者：方宝枝岑建农朱明清何广胜苗瞄王秀丽吴倩刘真真路丛孙莺心吴德沛孙爱宁阮长耿苏州大学附属第一医院血液科江苏省血液研究所卫生部血栓与止血重点实验室方宝枝现在南京医科大学附属苏州医院苏州市立医院本部 215006

目的评价免疫相关性血细胞减少症（IRH）患者骨髓CD4＋T细胞亚群中转录因子的异常。方法收集2011年1月至2012年3月苏州大学附属第一医院血液科确诊的40例IRH患者的骨髓，采用流式细胞仪检测骨髓细胞的自身抗体。采用免疫磁珠分选IRH患... 详细信息

目的评价免疫相关性血细胞减少症（IRH）患者骨髓CD4＋T细胞亚群中转录因子的异常。方法收集2011年1月至2012年3月苏州大学附属第一医院血液科确诊的40例IRH患者的骨髓，采用流式细胞仪检测骨髓细胞的自身抗体。采用免疫磁珠分选IRH患者骨髓CD4＋T细胞，采用实时荧光定量PCR检测骨髓细胞转录因子B细胞淋巴瘤6（Bcl-6）、叉状头／翅膀状螺旋转录因子3（Foxp3）和维甲酸依赖性孤儿受体（RORγt）mRNA表达水平，以同期25例缺铁性贫血患者作为正常对照组，以同期38例再生障碍性贫血（AA）患者作为病例对照组，进行比较。结果IRH组在干／祖细胞（CD34＋细胞）、粒系（CDl5＋细胞）、红系（GlyA＋细胞）分别有67．5％（27／40）、65．0％（26／40）、75．0％（30／40）发现自身抗体，累及造血系统三系者为27．5％（11／40），两系者为52．5％（21／40），一系者为20．0％（8／40）。IRH组Bcl-6、Foxp3的mRNA水平均高于正常对照组[2．243（0．854～4．544）比1．211（0．131～2．816），0．124（0．073～0．198）比0．071（0．046～0．118），均P〈0．05]，Foxp3／Bcl-6比值与正常对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。IRH组与AA组Foxp3mRNA表达量差异无统计学意义（P〉0．05），但AA组RORs,tmRNA表达水平显著高于IRH组[0．290（0．138～0．480）比0．133（0．068～0．189），P〈0．01]，IRH组Foxp3／RORyt比值高于AA组[0．975（0．483～1．416）比0．500（0．240～0．795），P〈0．01]。结论IRH是由抗造血细胞自身抗体所致造血功能衰竭症，可能与Bcl-5高表达有关，IRH免疫学发病机制与AA不同。

关键词： CD4阳性T淋巴细胞转录因子免疫相关性血细胞减少症 Bcl-6 Foxp3 RORyt

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多供体造血干细胞移植术后的嵌合率定量检测

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中国实验血液学杂志 2013年第2期21卷 436-440页

作者：冯宇锋张翔陈广华徐杨龚斐然朱子玲戴丽君宋铁梅周佳子唐晓文常惠荣缪竞诚吴德沛苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所卫生部血栓与止血重点实验室江苏苏州215006 苏州大学医学部基础医学与生物科学学院江苏苏州215124

本研究旨在建立检测多供体造血干细胞移植术后供体细胞嵌合率(DD-CHM%)的计算模型并简化计算方法。以接受异基因造血干细胞移植的血液系统疾病患者为研究对象,采用STR-PCR结合毛细管电泳的方法,检测移植术后供体细胞嵌合率。结果表明:... 详细信息

本研究旨在建立检测多供体造血干细胞移植术后供体细胞嵌合率(DD-CHM%)的计算模型并简化计算方法。以接受异基因造血干细胞移植的血液系统疾病患者为研究对象,采用STR-PCR结合毛细管电泳的方法,检测移植术后供体细胞嵌合率。结果表明:在混合嵌合状态下,同一个体来源的等位基因的双峰面积和高度是近似的,可以互相替代;对构建的计算模型中各等位基因的峰面积进行赋值,得到的嵌合率准确值和近似值在可接受的计量系统自身误差范围内(5%-20%)是基本没有差异的。结论:在混合嵌合状态下,来自于同一个体的等位基因在STR位点上的非共享峰是可以替代共享峰面积,此设想可以用作于计算多供体造血干细胞移植术后嵌合率的检测;在计算位点选择上,受体位点的选择比供体位点选择更为重要,能更加有效的简化计算步骤,并能更准确的得到供体细胞嵌合率的结果。

关键词：异基因造血干细胞移植多供体嵌合率共享峰

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IAG预激方案治疗复发、难治性急性髓系白血病临床分析

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中华血液学杂志 2013年第7期34卷 637-638页

作者：杨永计成阜张彦明刘立民何广胜金正明马骁薛胜利何雪峰吴德沛孙爱宁苏州大学附属第一医院、江苏省血液研究所、卫生部血栓与止血重点实验室 215006 江苏省阜宁县人民医院淮安市第二人民医院

复发、难治性急性髓系白血病（AML）总体预后较差，且目前仍缺乏统一的、标准的再诱导化疗方案。我们设计应用去甲氧柔红霉素（IDA）与小剂量阿糖胞苷（Ara-C）、G-CSF组成的IAG方案对复发、难治陛AML患者进行再诱导治疗，现报道如下。

关键词：难治性急性髓系白血病诱导治疗复发预激方案临床分析小剂量阿糖胞苷去甲氧柔红霉素 G-CSF

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脐带间充质干细胞治疗儿童异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病疗效观察

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中国实验血液学杂志 2013年第3期21卷 716-720页

作者：乔淑敏陈广华王易胡绍燕孙绪丁吴德沛苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所卫生部血栓与止血重点实验室江苏苏州215006 苏州大学附属儿童医院血液科江苏苏州215002 济宁市第一人民医院儿科山东济宁272000

本研究观察人脐带间充质干细胞(MSC)治疗儿童急性移植物抗宿主病的疗效和安全性。用胶原酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞,进行传代培养、扩增,培养至第3-5代用于临床治疗;5例急性白血病患儿经化疗达完全缓解。2例行亲缘HLA3/6位点... 详细信息

本研究观察人脐带间充质干细胞(MSC)治疗儿童急性移植物抗宿主病的疗效和安全性。用胶原酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞,进行传代培养、扩增,培养至第3-5代用于临床治疗;5例急性白血病患儿经化疗达完全缓解。2例行亲缘HLA3/6位点相合的骨髓造血干细胞移植,1例行同胞HLA全相合骨髓与外周血造血干细胞联合移植,1例行无血缘关系HLA4/6位点相合双份脐血造血干细胞移植,1例行无血缘关系HLA5/6位点相合单份脐血造血干细胞移植。患儿发生Ⅲ-Ⅳ度急性移植物抗宿主病(aGVHD),接受二线免疫抑制治疗无效后,行0.5×106/kg受者体重MSC治疗。结果表明,5例急性白血病患儿均获造血重建,并发生皮肤、肝脏和胃肠道Ⅲ-Ⅳ度aGVHD,经二线免疫抑制治疗无效,输注人脐带间充质干细胞治疗后,皮疹消退,肝功能恢复正常,胃肠道症状好转。患儿均未发生输注相关不良反应。目前患儿均无原发病的复发,均处于无病生存状态。结论:异基因造血干细胞移植是治疗儿童急性白血病的有效方法,脐带间充质干细胞治疗儿童急性移植物抗宿主病是安全有效的。

关键词：脐带间充质干细胞异基因造血干细胞移植急性移植物抗宿主病

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血小板内蛋白激酶C活化诱导血小板发生凋亡

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中国实验血液学杂志 2013年第5期21卷 1207-1210页

作者：赵丽丽陈梦醒张明逸戴克胜北京航空航天大学生物与医学工程学院血液与细胞生物学实验室北京100191 苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所卫生部血栓与止血重点实验室江苏苏州215006

蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)在血小板信号转导和粘附、聚集、释放等多种生理功能的发挥中均起到重要的作用。目前报道,PKC通过激活去整合素金属蛋白酶(ADAM)10或ADAM17诱导血小板膜表面糖蛋白受体发生酶切,对血小板活化后产生负调... 详细信息

蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)在血小板信号转导和粘附、聚集、释放等多种生理功能的发挥中均起到重要的作用。目前报道,PKC通过激活去整合素金属蛋白酶(ADAM)10或ADAM17诱导血小板膜表面糖蛋白受体发生酶切,对血小板活化后产生负调控作用。那么PKC活化是否可诱导血小板凋亡进而负调控血小板功能,目前还不清楚。本研究目的是探讨血小板内PKC活化对血小板凋亡的影响。取健康志愿者外周静脉血并分离血小板。选择PKC特异性激活剂和抑制剂,并设置不同的时间梯度和浓度梯度,与洗涤血小板共同孵育,应用流式细胞术和Western blot等技术,检测PKC激活剂和抑制剂对血小板线粒体膜电位(△ψm)、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)和磷脂酰丝氨酸(PS)的影响。实验结果表明,PKC激活剂呈时间依赖性诱导血小板发生△ψm去极化;PKC激活剂呈浓度依赖性地诱导血小板内caspase-3活化裂解,而PKC抑制剂则不能诱导血小板发生△ψm去极化和PS暴露的变化。结论:血小板内PKC活化后,可以通过影响线粒体功能和激活Caspase-3而诱导血小板凋亡,提示PKC可能参与调控活化血小板的凋亡过程,本研究结果对探明血小板活化的负调控功能及PKC活化相关疾病的发病机理具有意义。

关键词：血小板血小板凋亡蛋白激酶C

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阿司匹林对人脐血晚期内皮祖细胞功能的影响

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中国实验血液学杂志 2013年第4期21卷 1032-1037页

作者：刘珍珍李国强刘萌孙晟轩安广宇董宁征苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所江苏苏州215006 卫生部血栓与止血重点实验室江苏苏州215006 苏州大学附属第二医院骨外科江苏苏州215004 苏州大学唐仲英血液学研究中心江苏苏州215123 首都医科大学附属北京朝阳医院肿瘤科北京100020

本研究旨在观察阿司匹林对人脐血晚期内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)功能的影响。采用密度梯度离心法及免疫磁珠分选法从脐血获得CD34+的单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板上,培养2周后收集贴壁细胞,通... 详细信息

本研究旨在观察阿司匹林对人脐血晚期内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)功能的影响。采用密度梯度离心法及免疫磁珠分选法从脐血获得CD34+的单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板上,培养2周后收集贴壁细胞,通过流式细胞术、免疫荧光、RT-PCR、DiI-Ac-LDL的摄取及体外血管形成能力等方法对其进行鉴定。用不同浓度阿司匹林(终浓度分别为0.1,1,10,100,1 000,10 000μmol/L)处理EPC 24 h,然后分别采用CCK-8比色法、Transwell小室、黏附能力测定实验来观察EPC的增殖能力、迁移能力和黏附能力的变化。结果表明:低浓度的阿司匹林(0.1-1 000μmol/L)对脐血晚期EPC的增殖无明显影响,但可增强晚期EPC的黏附及迁移能力,而高浓度的阿司匹林(10 000μmol/L)显著抑制晚期EPC的增殖和迁移,但对其黏附能力无明显影响。结论:低浓度的阿司匹林可增强晚期EPC的黏附及迁移能力,而高浓度的阿司匹林抑制晚期EPC的增殖、黏附及迁移能力,从而抑制内皮细胞的生成。

关键词：阿司匹林内皮祖细胞脐血

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