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中国免疫学会第九届全国免疫学学术大会

作者：王充李柏青蚌埠医学院免疫学教研室感染与免疫安徽省重点实验室蚌埠233030

研究背景:已知γδ T细胞识别多肽抗原不需要抗原递呈细胞,其识别方式类似于B细胞.本实验室最近应用噬菌体随机多肽库筛选技术证实γδ T细胞可被人工合成多肽表位激活.但γδ T细胞能否识别结核分枝杆菌(Mtb)抗原中的B细胞多肽表位尚... 详细信息

研究背景:已知γδ T细胞识别多肽抗原不需要抗原递呈细胞,其识别方式类似于B细胞.本实验室最近应用噬菌体随机多肽库筛选技术证实γδ T细胞可被人工合成多肽表位激活.但γδ T细胞能否识别结核分枝杆菌(Mtb)抗原中的B细胞多肽表位尚未见报道.目的:探讨Mtb抗原中B细胞多肽表位能否特异性刺激γδ T细胞的活化和增殖.方法:选择文献已经报道的Mtb抗原中B细胞识别的多肽表位(Bp)序列人工合成6条多肽(Bp-1～Bp-6)包被24孔细胞培养板,采集健康成年人外周血分离获取PBMC,经CFSE染色后放人分别包被Bp-1至Bp-6的培养板中刺激培养.以Mtb耐热抗原作为阳性对照,以IL-2作为阴性对照.每3天半量换液并加入IL-2 50 U/ml,培养12天后,收集扩增细胞,用流式细胞术检测γδ T细胞比例及增殖指数(PI).扩增的细胞用相同多肽再刺激培养16或20小时后测定γδ T细胞CD69和IFN-γ的表达.

关键词：结核分枝杆菌抗原 γδT细胞 B细胞表位

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活动性肺结核病人外周血中分泌IL-22和IL-17的γ δ T细胞亚群变化的探讨

活动性肺结核病人外周血中分泌IL-22和IL-17的γ δ T细胞亚群变...

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第一次全国中西医结合检验医学学术会议暨中国中西医结合学会检验医学专业委员会成立大会

作者：梁华杨军平李柏青江西中医药大学附属医院检验科蚌埠医学院免疫学教研室安徽省感染与免疫重点实验室

目的:检测结核病患者和健康人外周血中分泌IL-22和IL-17的γδT细胞亚群比例的变化,以探讨分泌不同细胞因子的γδT细胞亚群在抗结核感染免疫反应中的作用;方法:取肝素抗凝全血,加RPMI1640培养液等体积混匀,依次加入佛波醇酯和离子霉素... 详细信息

目的:检测结核病患者和健康人外周血中分泌IL-22和IL-17的γδT细胞亚群比例的变化,以探讨分泌不同细胞因子的γδT细胞亚群在抗结核感染免疫反应中的作用;方法:取肝素抗凝全血,加RPMI1640培养液等体积混匀,依次加入佛波醇酯和离子霉素,37℃,5%C02培养2h,再加入蛋白转运抑制剂莫能菌素继续培养4h,收集细胞后先加抗人CD3-APC,和TCR-γδ-TC荧光抗体进行表染,4℃避光反应20分钟,经溶血、洗涤、固定后,0.1%皂素透膜10分钟,最后加入抗人IL-22-PE和IL-17-FITC荧光抗体进行胞染,4℃30分钟,洗涤后2%PFA重悬细胞,应用流式细胞仪和CellQuest软件检测和分析结果,同时设置同型对照;结果:健康对照组(n=δ)分泌IL-22和IL-17的γδT细胞在所有γδT细胞中的比例分别为(1.50±0.56)%和(0.25±0.19)%,结核病患者组(n=15)分泌IL-22和IL-17的γδT细胞在所有γδT细胞中的比例分别为(3.09±1.74)%和(0.72±0.51)%,后者均明显高于前者(p<0.05);.而共分泌IL-22和IL-17的γδT细胞比例在健康对照组为(0.31±0.20)%,在结核病患者组为(0.44±0.33)%,二者比较差异无统计学意义(p>0.05);结论:γδT细胞中存在单独分泌IL-22、IL-17和共分泌IL-22和IL-17的不同细胞亚群,活动性肺结核病患者外周血中分泌IL-22的γδT细胞比例增高,其增高并非与分泌IL-17的γδT细胞比例增高引起有关。

关键词： γ δ T细胞 IL-22 IL-17 肺结核流式细胞术

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结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6的构建、鉴定及免疫效应评价

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南方医科大学学报 2013年第7期33卷 945-950页

作者：王雪梅王英薛玉芹陈勇陶志勇夏惠唐洁方强蚌埠医学院病原生物学教研室蚌埠医学院安徽省感染与免疫重点实验室安徽蚌埠233030 蚌埠医学院蚌埠医学院免疫学教研室安徽蚌埠233030

目的构建结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6并探讨其诱导的免疫效应。方法将扩增自结核杆菌基因组的ESAT-6基因装入pVAX1载体构建pVAX1/ESAT-6重组质粒;经酶切、测序鉴定后,利用阳离子聚合物介导将重组质粒pVAX1/ESAT-6转染Hela细胞,分别以RT-... 详细信息

目的构建结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6并探讨其诱导的免疫效应。方法将扩增自结核杆菌基因组的ESAT-6基因装入pVAX1载体构建pVAX1/ESAT-6重组质粒;经酶切、测序鉴定后,利用阳离子聚合物介导将重组质粒pVAX1/ESAT-6转染Hela细胞,分别以RT-PCR法检测ESAT-6 mRNA的表达、间接免疫荧光法检测ESAT-6蛋白表达。重组质粒经体内电转染免疫小鼠后,采用ELISA法测定小鼠血清中IFN-γ及抗ESAT-6特异性抗体IgG的水平;流式细胞术检测小鼠淋巴细胞增殖水平;ELISPOT检测产生IFN-γ的淋巴细胞频数。结果构建的重组质粒pVAX1/ESAT-6经双酶切于3000 bp和300 bp处各见1条带,测序结果显示插入序列与ESAT-6基因序列无差异。重组质粒转染Hela细胞后,RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳于约300 bp处见目的条带,间接免疫荧光检测显示特异性绿色荧光。重组质粒免疫小鼠后,血清中抗ESAT-6特异性抗体IgG水平较对照组(空质粒组和生理盐水对照组)明显升高;血清中IFN-γ水平、小鼠脾淋巴细胞增殖水平及产生IFN-γ的淋巴细胞数明显均高于对照组(空质粒组和生理盐水对照组)。结论成功构建了结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6,该疫苗可有效诱导小鼠产生特异性细胞免疫和体液免疫效应。

关键词：结核分枝杆菌 ESAT-6 DNA疫苗细胞免疫体液免疫

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结核分枝杆菌蛋白抗原刺激人γδT细胞的活性单位的计算方法

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免疫学杂志 2013年第4期29卷 341-345页

作者：孙悝陈勇徐志庆陈立李柏青蚌埠医学院免疫学教研室安徽省感染与免疫重点实验室 233030

目的以检测和计算结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)蛋白抗原激活人γδT细胞增殖的活性单位为指标,比较不同提取分离方法制备的Mtb抗原制剂激活人γδT细胞的活性效价。方法培养的Mtb-H37Ra菌株通过高温和超声方法处理,分... 详细信息

目的以检测和计算结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)蛋白抗原激活人γδT细胞增殖的活性单位为指标,比较不同提取分离方法制备的Mtb抗原制剂激活人γδT细胞的活性效价。方法培养的Mtb-H37Ra菌株通过高温和超声方法处理,分别获取Mtb耐热抗原(Mtb-HAg)和超声处理抗原(Mtb-SoAg),采用超滤离心管(3 K,10 K,30 K)和快速液相蛋白层析(FPLC)分组和分离,获取不同相对分子质量组分的抗原。采集健康成年人外周血分离获取PBMC,加入不同质量浓度梯度的Mtb蛋白抗原或其分离组分,并加IL-2培养12 d后荧光抗体染色,流式细胞仪检测和分析扩增T细胞中γδT细胞的比例,以扩增γδT细胞最高比例的50%(EC50)所对应的质量浓度计算为1个活性单位。结果用活性单位计算法分析发现,某批次的Mtb-HAg(591μg/ml)刺激γδT细胞扩增的EC50为1.4μg/ml,计算其活性单位为0.71 U/μg;某批次低分子Mtb-SoAg(3 K～10 K)(221μg/ml)的EC50为0.8μg/ml,其活性单位为1.25 U/μg。结论通过比较Mtb蛋白抗原不同批次及其不同组分在不同质量浓度下刺激γδT细胞扩增数量的活性,可以计算获得相应的活性单位,为检测Mtb蛋白抗原制剂刺激γδT细胞增殖活性建立了标准化的计算方法。

关键词：结核分枝杆菌 γδT细胞耐热抗原超声抗原活性单位

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谷跗线螨扫描电镜的形态学观察

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中国人兽共患病学报 2013年第3期29卷 248-252,261页

作者：赵学影赵振富孙新刘志刚深圳大学过敏反应与免疫学研究所深圳518060 蚌埠医学院病原生物学教研室感染与免疫安徽省重点实验室蚌埠233030

目的用扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察谷跗线螨(Tarsonemus granarius)的体表形态特征。方法从空调滤网灰尘中采集谷跗线螨,在连续变倍体视镜下清洗处理活螨后,用SEM观察其外部形态特征。结果用SEM观察谷跗线螨的体表... 详细信息

目的用扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察谷跗线螨(Tarsonemus granarius)的体表形态特征。方法从空调滤网灰尘中采集谷跗线螨,在连续变倍体视镜下清洗处理活螨后,用SEM观察其外部形态特征。结果用SEM观察谷跗线螨的体表形态结构,明确了谷跗线螨颚体、背板、基节板、表皮内突、刚毛等外部形态结构特点。结论用SEM清晰地观察到谷跗线螨的体表形态,对螨类鉴别及其变应原等的研究有重要的意义。

关键词：谷跗线螨跗线螨科扫描电镜形态学

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结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因的克隆与序列分析

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蚌埠医学院学报 2013年第11期38卷 1385-1388页

作者：薛玉芹王英陈勇李江艳李倩唐洁夏惠王雪梅方强蚌埠医学院病原生物学教研室安徽省感染与免疫重点实验室安徽蚌埠233030 蚌埠医学院免疫学教研室安徽蚌埠233030

目的:克隆结核分枝杆菌减毒株H37Ra培养滤液蛋白10(CFP10)基因,并对其进行序列分析。方法:自结核菌H37Ra株抽提基因组DNA为模板,以已知结核菌H37Ra株CFP10基因设计引物。通过聚合酶链反应(PCR)技术扩增出结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,... 详细信息

目的:克隆结核分枝杆菌减毒株H37Ra培养滤液蛋白10(CFP10)基因,并对其进行序列分析。方法:自结核菌H37Ra株抽提基因组DNA为模板,以已知结核菌H37Ra株CFP10基因设计引物。通过聚合酶链反应(PCR)技术扩增出结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,将其克隆至pTG19-T载体后,经PCR和双酶切鉴定后进行DNA序列测定,并以BLAST在线软件进行序列比对分析。结果:PCR产物电泳显示扩增片段约为300 bp,测序获得的片段开放编码框由303 bp组成,与H37Rv株CFP10基因同源性为100%,推导出编码氨基酸序列同源性为100%。结论:成功克隆结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,其基因序列与H37Rv株CFP10基因序列无差异。

关键词：结核分枝杆菌 H37Ra株培养滤液蛋白10基因克隆序列分析

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产单核细胞李斯特菌感染小鼠脾脏树突状细胞亚群和表型的变化

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蚌埠医学院学报 2013年第6期38卷 645-647,651页

作者：韦莉金齐力管俊昌孔晓明蚌埠医学院病原生物学教研室安徽蚌埠233030 蚌埠医学院感染与免疫安徽省重点实验室安徽蚌埠233030 蚌埠医学院第二附属医院检验科安徽蚌埠233040

目的:利用产单核细胞李斯特菌(LM)感染BALB/c小鼠模型,研究LM感染对小鼠脾脏树突状细胞(DC)亚群及表型变化的影响。方法:LM尾静脉感染BALB/c小鼠,感染后第3、5、7天取小鼠脾脏,平板稀释法进行脾脏细菌载量分析;流式细胞术检测脾脏DC亚群... 详细信息

目的:利用产单核细胞李斯特菌(LM)感染BALB/c小鼠模型,研究LM感染对小鼠脾脏树突状细胞(DC)亚群及表型变化的影响。方法:LM尾静脉感染BALB/c小鼠,感染后第3、5、7天取小鼠脾脏,平板稀释法进行脾脏细菌载量分析;流式细胞术检测脾脏DC亚群及DC相关表面分子CD80、CD86的表达情况。结果:感染小鼠脾脏细菌载量感染后第3天有高水平的菌落形成单位计数,随着时间的推移细菌的数量迅速降低,直到第7天基本被清除;CD11c+DC的数量在感染第5天高于对照组(P<0.05),CD4+DC的数量在感染后第5天和第7天均高于对照组(P<0.05),CD8α+DC的数量在感染后第3、5和7天及CD4-CD8α-DC的数量在感染后的第3和第5天亦均高于对照组(P<0.05～P<0.01);LM感染后,DC表面CD80和CD86的表达增加,均于感染后第3天和第5天显著高于对照组(P<0.01)。结论:LM感染早期,小鼠脾脏DC亚群出现的增殖和成熟表型特征性分子表达上调,决定了其在细胞免疫应答活化中的作用地位。

关键词：李斯特菌感染产单核细胞树突状细胞免疫应答小鼠

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流式细胞术检测人外周血产生IL-22的淋巴细胞亚群及其在结核病患者中的应用

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检验医学 2013年第1期28卷 61-66页

作者：梁华梁友宝贺文欣杨军平孙国宏杨小军李柏青江西中医学院附属医院检验科江西南昌330006 蚌埠市第一医院检验科安徽蚌埠233030 蚌埠医学院免疫学教研室安徽省感染与免疫重点实验室安徽蚌埠233030

目的建立用流式细胞术(FCM)检测人外周血产白细胞介素22(IL-22)的不同淋巴细胞亚群的方法,并探讨其在结核病(TB)患者中的应用,以了解产IL-22的淋巴细胞亚群在抗结核感染免疫中的作用。方法采集22例TB患者和18名健康对照者外周血,与相同... 详细信息

目的建立用流式细胞术(FCM)检测人外周血产白细胞介素22(IL-22)的不同淋巴细胞亚群的方法,并探讨其在结核病(TB)患者中的应用,以了解产IL-22的淋巴细胞亚群在抗结核感染免疫中的作用。方法采集22例TB患者和18名健康对照者外周血,与相同体积RPMI-1640培养液混匀,加入佛波醇酯(PMA)和钙离子霉素,混匀后于37℃5%CO2静置培养2 h,再加入莫能霉素后继续培养4 h,收集细胞,用荧光素标记进行细胞表面抗原和胞内细胞因子染色,用FCM检测表达IL-22、IL-17的不同淋巴细胞亚群比例。结果 PMA浓度为100 ng/mL,钙离子霉素浓度为1μg/mL,刺激培养2 h可最有效刺激IL-22的产生;TB患者外周血中产IL-22的γδT细胞比例(7.37%)明显高于正常人(1.81%,P<0.05),而在CD4+T、CD8+T、自然杀伤(NK)细胞和B细胞等其他细胞亚群中,产IL-22的阳性细胞比例在TB患者和健康对照者之间差异无统计学意义(P>0.05);Th22和Th17细胞比例在TB患者和健康对照者之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论建立了一套简便、完整、可靠的FCM检测产IL-22的淋巴细胞亚群的方法,产IL-22的γδT细胞在抗结核感染免疫中可能发挥免疫效应。

关键词：白细胞介素22 白细胞介素17 淋巴细胞结核病流式细胞术

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间日疟原虫醛缩酶的克隆、表达与初步鉴定

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蚌埠医学院学报 2013年第7期38卷 777-780页

作者：高迎陶志勇夏惠陈勇王雪梅方强蚌埠医学院病原生物学教研室安徽蚌埠233030 蚌埠医学院安徽省感染与免疫重点实验室安徽蚌埠233030 河南省南阳市中心医院检验科 473000

目的:克隆间日疟原虫醛缩酶(Plasmodium vivax aldolase,PvALD)基因,体外表达和鉴定重组PvALD蛋白。方法:PCR法从间日疟患者血液DNA样品中扩增PvALD基因,构建pET32c-PvALD重组表达质粒,转化大肠埃希菌(***)BL21(DE3+),诱导表达带有His... 详细信息

目的:克隆间日疟原虫醛缩酶(Plasmodium vivax aldolase,PvALD)基因,体外表达和鉴定重组PvALD蛋白。方法:PCR法从间日疟患者血液DNA样品中扩增PvALD基因,构建pET32c-PvALD重组表达质粒,转化大肠埃希菌(***)BL21(DE3+),诱导表达带有His标签的重组蛋白,并对PvALD在***中表达进行优化,观察诱导时间、诱导剂浓度、培养基种类对该蛋白原核表达的影响。采用镍柱亲和层析纯化重组蛋白,相应表达物分别采用SDS-PAGE电泳和Western blot进行分析鉴定。结果:PvALD的PCR产物分子量为1.1 kb,重组质粒pET32c-PvALD经测序验证,其插入片段序列与GenBank参考序列相似性为100%,转化***所表达的重组蛋白分子量约为60 kD。PvALD在LB中1 mmol/L IPTG诱导6 h条件下获得最佳的表达效果。亲和层析纯化后的PvALD经SDS-PAGE电泳检测,呈现单一条带,Western blot分析结果显示,该重组蛋白只能被间日疟患者血清特异性识别,而不能被恶性疟患者血清识别。结论:成功克隆了PvALD基因,表达了重组PvALD蛋白,为以PvALD作为靶标的间日疟快速诊断方法提供了基础。

关键词：间日疟原虫醛缩酶原核表达纯化亲和层析

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活动性肺结核病人外周血中分泌IL-22和IL-17的γδT细胞亚群变化

活动性肺结核病人外周血中分泌IL-22和IL-17的γδT细胞亚群变化

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江西省医学检验第十六次学术交流会议暨王棠海教授百岁华诞学术研讨会

作者：梁华杨军平李柏青江西中医药大学附属医院检验科江西南昌330006 蚌埠医学院免疫学教研室安徽省感染与免疫重点实验室安徽蚌埠233030

目的:检测结核病患者和健康人外周血中分泌IL-22和IL-17的γδT细胞亚群比例的变化，以探讨分泌不同细胞因子的γδT细胞亚群在抗结核感染免疫反应中的作用。方法:取肝素抗凝全血，加培养液等体积混匀，依次加入佛波醇酯和离子霉素... 详细信息

目的:检测结核病患者和健康人外周血中分泌IL-22和IL-17的γδT细胞亚群比例的变化，以探讨分泌不同细胞因子的γδT细胞亚群在抗结核感染免疫反应中的作用。方法:取肝素抗凝全血，加培养液等体积混匀，依次加入佛波醇酯和离子霉素，37℃,5％CO2培养2h，再加入蛋白转运抑制剂莫能菌素继续培养4h，收集细胞后先加抗入CD3-APC，和TCR-γδTC,4℃避光反应20min，经溶血、洗涤、固定后，0.1%皂素透膜10分钟，最后加入抗人IL-22-PE和IL-17-FITC抗体，4℃ 30分钟，洗涤后2%PFA重悬细胞，应用流式细胞仪和CellQuest软件检测和分析结果，同时设置同型对照。结果:健康对照组(n=8)分泌IL-22和IL-17的γδT细胞在所有γδT细胞中的比例分别为(1.50±0.56)%和(0.25±0.19)%，结核病患者组(n=15)分泌IL-22和IL-17的γδT细胞在所有γδT细胞中的比例分别为(3.09±1.74)%和(0.72±0.51)%，后者均明显高于前者(p<0.05);而共分泌IL-22和IL-17的γδT细胞比例在健康对照组为(0.31±0.20)%，在结核病患者组为(0.44±0.33)%，二者比较差异无统计学意义(p>0.05)。结论:γδT细胞中存在单独分泌IL-22、IL-17和共分泌IL-22和IL-17的不同细胞亚群，活动性肺结核病患者外周血中分泌IL-22的γδT细胞比例增高，其增高并非与分泌IL-17的γδT细胞比例增高引起有关。

关键词：肺结核外周血白细胞介素-22 白细胞介素-17 γδT细胞亚群免疫反应

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