检索结果-内蒙古大学图书馆

目的:探讨结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染THP-1细胞后对细胞表面白细胞分化抗原14(CD14)表达的影响。方法:Mtb以10∶1感染佛波醇酯(PMA)分化的THP-1细胞,建立Mtb感染THP-1细胞的模型。采用流式细胞术检测THP-1细胞、... 详细信息

目的:探讨结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染THP-1细胞后对细胞表面白细胞分化抗原14(CD14)表达的影响。方法:Mtb以10∶1感染佛波醇酯(PMA)分化的THP-1细胞,建立Mtb感染THP-1细胞的模型。采用流式细胞术检测THP-1细胞、PMA分化的THP-1细胞及Mtb感染THP-1细胞CD14的表达。结果:THP-1细胞和PMA分化的THP-1细胞表面表达CD14的阳性率分别为5.5%和21.6%,对Mtb的吞噬率分别为7.7%和93.0%;Mtb感染的THP-1细胞表面表达CD14的阳性率为27.5%。结论:PMA分化后的THP-1细胞表面CD14的表达增加,Mtb感染后CD14的表达进一步增加,对Mtb的吞噬率增加。

关键词：结核分枝杆菌 THP-1细胞白细胞分化抗原14

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重组人单链IL-23的构建、表达及生物学活性的鉴定

重组人单链IL-23的构建、表达及生物学活性的鉴定

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第八届全国免疫学学术大会

作者：张英齐文娟洛江坤陈勇方强蚌埠医学院免疫教研室安徽省感染与免疫重点实验室蚌埠医学院病原生物学教研室

研究背景:IL-23作为IL-12家族的重要成员,在激活和调节针对抗原特异性T细胞免疫的反应作用较IL-12更有效、且不会诱导淋巴细胞产生过多的IFN-γ,从而减少了毒性,有作为疫苗佐剂提高免疫保护效果的潜力。由于IL-23结构复杂,只有两个亚基... 详细信息

研究背景:IL-23作为IL-12家族的重要成员,在激活和调节针对抗原特异性T细胞免疫的反应作用较IL-12更有效、且不会诱导淋巴细胞产生过多的IFN-γ,从而减少了毒性,有作为疫苗佐剂提高免疫保护效果的潜力。由于IL-23结构复杂,只有两个亚基呈异二聚体表达时才具备生物学功能,通过15个氨基酸多肽连接p40和p19两个亚基,体外构建重组人单链IL-23融合基因,并真核表达具有生物学活性的重组人单链IL-23(hsc IL-23),可为探讨hsc IL-23作为疫苗佐剂的研究及后期应用奠定基础。目的:构建hsc IL-23融合基因,真核表达hsc IL-23重组蛋白并鉴定其生物学活性。方法:应用重叠延伸PCR技术通过一柔性接头(linker)(Gly4Ser)3串联IL-23 p40和p19亚基基因,构建hsc IL-23融合基因,经测序鉴定后装载入真核表达质粒pc DNA3.1(+),并进行酶切、测序鉴定;pc DNA3.1(+)-hsc IL-23质粒转染He La细胞,同时设转染pc DNA3.1(+)质粒组和未转染质粒组,转染48h后分别收集细胞及细胞培养上清。以人IL-23 ELISA试剂盒鉴定各组细胞培养上清中hsc IL-23融合蛋白的含量,通过与标准品比对,测定各组细胞培养上清中hsc IL-23的表达水平。分离人PBMCs,加入收集的各组细胞培养上清及PHA-P共培养72 h,MTT法检测各组人淋巴细胞的增殖水平。结果:构建的pc DNA3.1(+)-hsc IL-23表达质粒经测序鉴定,插入片段序列与预期完全一致。转染各组质粒的He La细胞中,ELISA检测He La细胞在转染质粒48h后培养上清液中hsc IL-23蛋白的含量,其中未转染组细胞培养上清为9.11±11.78pg/ml,转染pc DNA3.1(+)组的含量为10.47±9.04pg/ml,而转染pc DNA3.1(+)-psc IL-12组为254.34±2.77 pg/ml,显著高于前两组(P<0.01)。通过MTT法检测各组细胞培养上清刺激人淋巴细胞的增殖结果,未转染质粒组在570nm处的吸光度为0.553±0.038,PHA-P刺激组(阳性对照组)为1.968±0.018,转染pc DNA3.1(+)组为0.595±0.289,转染pc DNA3.1(+)-hsc IL-23组为1.135±0.048,显著高于未转染质粒组和转染pc DNA3.1(+)组(P<0.01)。结论:成功构建了hsc IL-23融合基因,并真核表达了具有生物学活性的hsc IL-23重组蛋白。

关键词：重组人单链IL-23 融合基因真核表达生物学活性

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密码子优化的结核分枝杆菌CFP-10真核表达载体构建及在Hela细胞中的表达

密码子优化的结核分枝杆菌CFP-10真核表达载体构建及在Hela细胞中...

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第八届全国免疫学学术大会

作者：薛玉芹王英陈勇唐洁王雪梅方强蚌埠医学院病原生物学教研室安徽省感染与免疫重点实验室蚌埠医学院免疫教研室

研究背景:CFP10抗原是结核分枝杆菌 RD1区编码的低分子量分泌蛋白,仅存在于致病性分枝杆菌中,存在多个T细胞抗原决定簇,可强烈诱导结核病患者PBMC的增殖,产生大量的IFN-γ,具有良好的抗原性和免疫保护性,是结核病重要的诊断抗原和疫苗... 详细信息

研究背景:CFP10抗原是结核分枝杆菌 RD1区编码的低分子量分泌蛋白,仅存在于致病性分枝杆菌中,存在多个T细胞抗原决定簇,可强烈诱导结核病患者PBMC的增殖,产生大量的IFN-γ,具有良好的抗原性和免疫保护性,是结核病重要的诊断抗原和疫苗候选分子。鉴于病原体与感染宿主在密码子使用方面的差异,拟对CFP-10编码基因进行密码子优化改造,以提高真核表达系统的表达效率,提供更好的免疫保护力,为结核病核酸疫苗的研制等奠定基础。目的:构建结核密码子优化的分枝杆菌CFP-10基因及其真核表达质粒,并观察其在Hela细胞中的表达。方法:在不改变氨基酸序列的前提下,根据密码子偏嗜性和GC含量等因素,设计优化CFP-10基因密码子并全基因合成,PCR扩增密码子优化的CFP-10基因,将其插入真核表达载体PVAX1,构建优化PVAX1/CFP-10重组质粒,经PCR、酶切、测序鉴定后,经梭华-SofastTM脂质体介导转染体外培养的Hela细胞,通过 RT-PCR、间接免疫荧光检测融合基因在真核细胞中的表达。结果:共优化60个密码子,PCR扩增出的目的片段长约300 bp,构建的重组质粒经PCR、酶切、测序验证,和预期设计的基因序列一致。重组质粒转染Hela细胞后, RT-PCR检测有明显mRNA的表达,间接免疫荧光检测细胞爬片可见明显的特异性绿色荧光。结论:成功构建了PVAX1/CFP-10密码子优化基因的真核表达质粒,初步验证了优化PVAX1/CFP-10在体外真核细胞中的明显表达,为进一步的研究和应用打下了一定的基础。

关键词：结核分枝杆菌 CFP-10 密码子优化重组质粒 Hela细胞

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结核杆菌ESAT6蛋白的原核表达与纯化

结核杆菌ESAT6蛋白的原核表达与纯化

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第八届全国免疫学学术大会

作者：王英薛玉芹陈勇唐洁王雪梅方强蚌埠医学院病原生物学教研室安徽省感染与免疫重点实验室蚌埠医学院免疫教研室

研究背景:结核病是由结核分支杆菌引起的一种人兽共患传染病,随着流动人口剧增、结核菌与艾滋病毒双重感染和多重耐药结核菌病的挑战均增加了结核病防治工作的难度,使严重的结核病疫情更加复杂。卡介苗对儿童的保护力很好,而对成人的保... 详细信息

研究背景:结核病是由结核分支杆菌引起的一种人兽共患传染病,随着流动人口剧增、结核菌与艾滋病毒双重感染和多重耐药结核菌病的挑战均增加了结核病防治工作的难度,使严重的结核病疫情更加复杂。卡介苗对儿童的保护力很好,而对成人的保护效率则存在很大差异。因此,发展安全、高效的新型疫苗迫在眉睫。ESAT6蛋白是从结核分枝杆菌短期培养滤液中纯化的一种分泌性蛋白,能刺激机体产生保护性免疫反应,仅存在于致病性分支杆菌而卡介苗等非致病分支杆菌缺乏。许多研究表明,ESAT6蛋白可作为亚单位疫苗的组分以及成为DNA疫苗的候选抗原,而达到长期、有效的预防结核病的目的。目的:原核表达并纯化结核分枝杆菌ESAT6重组蛋白。方法:从结核杆菌H37 Ra菌株中提取DNA,以此为模板PCR扩增ESAT6基因,双酶切后克隆入表达载体p ET42a(+)中,构建原核重组质粒PET42a(+)-ESAT6,将其转化入大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆,用含卡那霉素的培养液过夜增菌,收集宿主菌并提取质粒,用双酶切和DNA测序鉴定。之后再转入大肠杆菌BL21(DE3),同法筛选阳性菌。阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析ESAT6蛋白的表达;之后用GST和Ni-NTA柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE和Western-blotting对目的蛋白进行分析和鉴定。结果:PCR扩增出目的片段近300bp;重组质粒经PCR、双酶切验证与预期结果一致,测序与Gen Bank中结核杆菌ESAT6基因序列一致。经37℃、1mmol/l IPTG诱导6h,SDS-PAGE分析显示p ET42a(+)-ESAT6表达出3KDa左右的重组蛋白且以可溶性和包涵体的形式存在,调整诱导条件;30℃、0.4mmol/l IPTG诱导7h显示可溶性蛋白有所提高占总菌体蛋白的23%,经GST和Ni-NTA柱后获得纯化的重组蛋白。Western-blotting结果显示目的蛋白可被结核病人血清所识别。结论:成功构建了原核表达载体p ET42a(+)-ESAT6,并原核表达了重组ESAT6蛋白。

关键词：结核分枝杆菌 ESAT6基因原核表达

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结核分枝杆菌CFP-10的克隆与高效可溶性原核表达

结核分枝杆菌CFP-10的克隆与高效可溶性原核表达

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第八届全国免疫学学术大会

作者：薛玉芹王英陈勇唐洁王雪梅方强蚌埠医学院病原生物学教研室安徽省感染与免疫重点实验室蚌埠医学院免疫教研室

研究背景:培养滤液蛋白CFP10,是结核分枝杆菌 RD1区编码的核心抗原之一,仅存在于致病性和一些非典型的分枝杆菌中,而不存在BCG和非致病分枝杆菌中,可强烈诱导T细胞的增殖和IFN-γ的产生,使得CFP10蛋白成为结核病重要的诊断性抗原和热点... 详细信息

研究背景:培养滤液蛋白CFP10,是结核分枝杆菌 RD1区编码的核心抗原之一,仅存在于致病性和一些非典型的分枝杆菌中,而不存在BCG和非致病分枝杆菌中,可强烈诱导T细胞的增殖和IFN-γ的产生,使得CFP10蛋白成为结核病重要的诊断性抗原和热点疫苗候选分子,而高效可溶性表达CFP-10蛋白是其应用的重要前提。目的:克隆、原核表达、纯化结核分枝杆菌CFP-10,并对重组蛋白进行抗原性鉴定。方法:用PCR方法从结核分枝杆菌H37 Ra基因组中扩增CFP10基因,将其克隆至带有GST和HIS标签的原核表达载体PET-42a(+),经酶切、测序鉴定后将其转入宿主菌*** BL21(DE3)中,通过IPTG诱导表达并优化诱导表达条件,经GST和HIS亲和层析柱纯化表达的融合蛋白。以SDSPAGE电泳和Western-blotting对目的蛋白进行分析和鉴定。结果:经PCR扩增出的目的片段长约300bp,构建的重组表达质粒经PCR、酶切验证,和预期的结果一致,测序鉴定显示插入片段与Genbank中CFP-10基因完全吻合。转化有重组质粒的*** BL21(DE3)经过0.1 mmol/L IPTG 37℃诱导6 h,高效表达了占菌体蛋白总量39.7%的相对分子质量约为37KD的可溶性融合蛋白,经亲和层析柱纯化后的获得高纯度的CFP10重组蛋白。Westernblotting结果显示目的蛋白能被结核病患者的阳性血清所识别,而不被正常人血清所识别。结论:成功克隆并高效可溶性原核表达和纯化了结核分枝杆菌CFP-10蛋白,为结核病的诊断、疫苗研究奠定了一定的基础。

关键词：结核分枝杆菌CFP-10 克隆可溶性原核表达

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猪带绦虫六钩蚴TSO45-4B抗原FNⅢ结构域线性B细胞表位预测及鉴定

猪带绦虫六钩蚴TSO45-4B抗原FNⅢ结构域线性B细胞表位预测及鉴定

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第八届全国免疫学学术大会

作者：王媛媛王小莉常雪莲陶志勇夏惠方强蚌埠医学院病原生物学教研室安徽省感染与免疫重点实验室

研究背景:猪囊尾蚴病是由猪带绦虫幼虫囊尾蚴引起的一种严重危害畜牧业生产和人类健康的人兽共患寄生虫病,疫苗是最有前景的防治囊虫病的手段之一。TSO45W-4B是研究较多的囊尾蚴病疫苗候选分子,与其他具有良好保护潜力的羊带绦虫TO45W... 详细信息

研究背景:猪囊尾蚴病是由猪带绦虫幼虫囊尾蚴引起的一种严重危害畜牧业生产和人类健康的人兽共患寄生虫病,疫苗是最有前景的防治囊虫病的手段之一。TSO45W-4B是研究较多的囊尾蚴病疫苗候选分子,与其他具有良好保护潜力的羊带绦虫TO45W、牛绦虫TSA9和猪带绦虫TSOL18、TSOL16基因等疫苗候选分子类似,其编码蛋白含有一个由66个氨基酸构成的纤连蛋白Ⅲ型(Fn Ⅲ)结构域。但至今TSO45W蛋白Fn Ⅲ结构域的免疫学特性的认识尚不清楚。预测并鉴定猪带绦虫六钩

关键词：猪带绦虫六钩蚴细胞表位 TSO45-4B 结构域

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