检索结果-内蒙古大学图书馆

Zoological Research 2012年第3期33卷 276-282页

作者：朱娜贾洪响刘晓坤赵晓娥魏强马保华西北农林科技大学动物医学院农业部动物生物技术重点实验室陕西杨凌712100

该文探讨了小鼠发情周期中阴门状态、阴道脱落细胞类型变化规律、卵泡发育规律及其相互关系,并比较了发情周期不同阶段的超排效果。结果表明,采用阴门状态观察法和阴道脱落细胞涂片法,能有效判断小鼠发情周期阶段。卵巢组织切片观察结... 详细信息

该文探讨了小鼠发情周期中阴门状态、阴道脱落细胞类型变化规律、卵泡发育规律及其相互关系,并比较了发情周期不同阶段的超排效果。结果表明,采用阴门状态观察法和阴道脱落细胞涂片法,能有效判断小鼠发情周期阶段。卵巢组织切片观察结果表明,在发情周期不同阶段,小鼠的卵泡发育和黄体的生成与消退存在明显的规律性变化;小鼠发情周期中,其阴门状态、阴道脱落细胞种类及卵泡发育动态之间存在相关关系;发情周期不同阶段开始超排的小鼠,其配种见栓率和回收胚胎平均数均存在明显差异,发情前期显著优于发情后期与间情期(P<0.05),并高于发情期,但差异不显著(P>0.05),即阴门状态观察法与阴道脱落细胞涂片法均可用于小鼠发情周期阶段的判断,发情前期为最适宜的小鼠超排时期。

关键词：发情周期阴道脱落细胞卵泡发育超数排卵小鼠

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电穿孔介导小干扰RNA高效转染小鼠附植前胚胎

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生物工程学报 2012年第5期28卷 613-622页

作者：常博皞彭辉田进海苏建民张亨德白学尧张涌西北农林科技大学动物医学院农业部生物技术重点实验室陕西杨凌712100

使用Cy3标记的阴性对照小干扰RNA(siRNA)转染小鼠附植前胚胎,建立向小鼠附植前胚胎导入siRNA的电穿孔方法。通过控制透明带弱化程度、电压、脉冲时间和脉冲次数等条件,采用不同参数组合并结合使用不同介质作为电转缓冲液将Cy3标记的阴... 详细信息

使用Cy3标记的阴性对照小干扰RNA(siRNA)转染小鼠附植前胚胎,建立向小鼠附植前胚胎导入siRNA的电穿孔方法。通过控制透明带弱化程度、电压、脉冲时间和脉冲次数等条件,采用不同参数组合并结合使用不同介质作为电转缓冲液将Cy3标记的阴性对照siRNA转染小鼠附植前胚胎。在荧光倒置显微镜下,观察胚胎的存活率、siRNA转染率以及阳性转染存活胚胎的囊胚发育率。结果显示小鼠附植前胚胎在使用台氏液消化胚胎透明带10 s后,以opti-MEM作为电转缓冲液,电穿孔参数设置为30 V,1 ms,3次的条件下取得最佳转染效果。总之,电穿孔方法可实现siRNA简便、高效地转染小鼠附植前胚胎。

关键词：小干扰RNA 电穿孔透明带 RNA干扰

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N端融合TAT穿膜肽的piggyBac转座酶的原核表达及其在HEK 293细胞中的功能验证

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农业生物技术学报 2014年第4期22卷 406-414页

作者：胡广东高元鹏王静郑丽明张涌西北农林科技大学动物医学院西北农林科技大学农业部动物生物技术重点实验室

为了增加piggyBac(PB)转座系统在转基因操作中安全性和减少PB转座系统的辅助质粒带来的副作用,本研究利用N端融合人免疫缺陷病毒反式激活因子(Human immunodeficiency virus transactivator,TAT)穿膜肽的原核表达PB转座酶替代辅助质粒... 详细信息

为了增加piggyBac(PB)转座系统在转基因操作中安全性和减少PB转座系统的辅助质粒带来的副作用,本研究利用N端融合人免疫缺陷病毒反式激活因子(Human immunodeficiency virus transactivator,TAT)穿膜肽的原核表达PB转座酶替代辅助质粒在人肾胚细胞(HEK293细胞)介导PB转座的发生,同时建立一种由TAT介导的外源功能蛋白进入真核细胞的方法。构建了N端和C端分别融合TAT的PB转座酶原核表达载体(pET28A-Pbase 1,pET28A-Pbase 2)。利用pET28A-Pbase1载体在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中成功表达出N端含有TAT的PBase重组蛋白,纯化并对其进行蛋白定量,然后以100mg/mL的浓度加入细胞培养液中,转导进入HEK 293细胞,利用免疫荧光技术观察该酶能否进入HEK293细胞核,利用热不对称PCR(Tail-PCR)进行整合位点侧翼DNA序列检测,亚甲蓝进行阳性细胞克隆染色并利用非配对t检验统计细胞克隆数。聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot鉴定结果表明PBase在大肠杆菌中成功表达,经分析发现其主要以可溶蛋白形式存在。免疫荧光结果表明,N端融合TAT穿膜肽的PBase定位于细胞核,但是整合位点检测和转座效率统计结果表明,原核表达的PBase蛋白在HEK 293细胞中无法介导转座事件的发生。该转座系统能否在其他真核细胞中正常发挥作用,还需要进一步的研究。然而,本研究为由TAT穿膜肽介导的外源蛋白在真核细胞中的跨膜转运提供了一种可靠的方法。

关键词： piggyBac(PB)转座子转座酶原核表达人免疫缺陷病毒反式激活因子(TAT)穿膜肽 HEK 293细胞

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基因编辑技术在哺乳动物上的研究应用进展

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内蒙古大学学报（自然科学版） 2019年第5期50卷 531-543页

作者：韦永可袁梦珂张涌西北农林科技大学农业部动物生物技术重点实验室

基因编辑技术是近几年兴起的对目标基因组进行高效、定点、精准编辑的技术,主要通过人工核酸内切酶在基因组特定位点进行双链断裂,从而引入DNA片段插入或缺失,实现靶位点的基因敲除、基因定点突变和基因修复等.基因编辑技术被广泛运用... 详细信息

基因编辑技术是近几年兴起的对目标基因组进行高效、定点、精准编辑的技术,主要通过人工核酸内切酶在基因组特定位点进行双链断裂,从而引入DNA片段插入或缺失,实现靶位点的基因敲除、基因定点突变和基因修复等.基因编辑技术被广泛运用在多种动物上,取得了重要成果,前景广阔.文章对基因编辑的发展历程以及在多种哺乳动物上的研究现状和进展进行综述,并对技术瓶颈进行讨论.

关键词：基因组编辑 CRISPR/Cas9系统哺乳动物

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不同起始时间超数排卵处理的昆白小鼠排卵、受精和胚胎发育时程研究

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农业生物技术学报 2014年第9期22卷 1097-1105页

作者：刘晓坤张骏鸿魏强朱娜赵晓娥马保华西北农林科技大学动物医学院/农业部动物生物技术重点实验室

超数排卵技术是获得大量卵母细胞、受精卵或不同发育阶段胚胎的主要手段之一。本研究选择发情前期昆白系小鼠(Mus musculus),分别在超排当天的12:00、16:00、20:00和24:00,腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG),48 h后腹腔注射人绒毛膜促... 详细信息

超数排卵技术是获得大量卵母细胞、受精卵或不同发育阶段胚胎的主要手段之一。本研究选择发情前期昆白系小鼠(Mus musculus),分别在超排当天的12:00、16:00、20:00和24:00,腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG),48 h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG),随即以1∶1的比例与单笼饲养的公鼠合笼过夜,并于次日清晨检查配种情况。超排小鼠卵母细胞、受精卵和胚胎回收结果表明,在12:00、16:00、20:00和24:00注射PMSG开始超排的小鼠,获取输卵管卵母细胞的适宜时间分别为注射hCG后16.23、14.02、15.93和12.98 h;获取受精卵的适宜时间分别为24.62、23.60、26.53和20.03 h;获取卵裂胚胎的适宜时间分别为42.76、42.39、41.85和40.47 h;获取4-细胞胚胎的适宜时间分别为56.87、57.84、57.31和56.92 h;获取8-细胞胚胎的适宜时间分别为66.89、67.39、66.20和66.07 h;获取桑椹胚的适宜时间分别为76.31、76.21、76.29和75.11 h;获取囊胚的适宜时间分别为100.65、97.14、93.91和96.86 h;获取孵化囊胚的适宜时间分别为114.57、112.34、112.11和110.28 h。在本研究选择的不同时间注射PMSG进行小鼠超排时,超排小鼠的排卵、受精和早期胚胎发育时程基本一致;通过调整超排处理开始时间,可调整超排小鼠卵母细胞、受精卵和不同发育阶段胚胎的回收时间;可以根据不同研究对小鼠卵母细胞、受精卵或不同发育阶段胚胎的需要,合理安排小鼠超排起始时间。本研究为以小鼠卵母细胞、受精卵或不同发育阶段胚胎为研究材料的相关研究提供了技术支撑。

关键词：时程卵母细胞胚胎超数排卵小鼠

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CRISPR/Cas9体系的多元化发展和应用

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农业生物技术学报 2017年第6期25卷 939-953页

作者：葛陆星康健董翔宸张涌权富生西北农林科技大学动物医学学院/农业部动物生物技术重点实验室

CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR associated)系统是细菌和古细菌抵御外源病毒、外源质粒入侵的适应性免疫防御系统。CRISPR/Cas9技术是继锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease,ZFN)和转录激活样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)后出现的第3代基因定点编辑技术,具有高特异性、高效性、易操作和低成本等优点,受到国内外研究工作者的青睐。本文对CRISPR/Cas系统的分类和结构以及作用机制进行了概括,总结了CRISPR/Cas系统的多元化发展,新型CRISPR体系的探索研究,近年来研究者为了使该技术特异性提高、脱靶效率降低、打靶范围扩大而开展的PAM(protospacer adjacent motif)识别区扩展、gRNA优化设计、Cas9蛋白质结构加工等一系列工作,展现了现有CRISPR/Cas9技术的改造性应用以及在动物建模、人类基因治疗、全基因组筛选和动物育种材料研制等多个科研领域的广泛性应用,并对该项技术的应用前景和研究方向进行了展望。本综述详尽描述了该技术的基本情况,为相关科研工作者对该技术的进一步研究和应用提供参考。

关键词： CRISPR/Cas9 基因编辑脱靶效率技术应用改进发展

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犬BMSCs干细胞的分离培养及成骨诱导分化

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农业生物技术学报 2016年第1期24卷 68-75页

作者：赵晓娥魏强李伟何成军张通明马保华西北农林科技大学动物医学院/农业部动物生物技术重点实验室

为了体外分离犬(Canis lupus)骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymai stem cells,BMSCs),并对其进行成骨诱导分化及鉴定,本研究用全骨髓贴壁法分离培养犬BMSCs,待细胞克隆成片后传代。在传代过程中,取不同代数的细胞进行生长曲线测... 详细信息

为了体外分离犬(Canis lupus)骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymai stem cells,BMSCs),并对其进行成骨诱导分化及鉴定,本研究用全骨髓贴壁法分离培养犬BMSCs,待细胞克隆成片后传代。在传代过程中,取不同代数的细胞进行生长曲线测定;取传至第2代(p2)细胞,对诱导前的细胞和成骨诱导分化10和21 d的细胞采用q RT-PCR鉴定性别决定基因相关转录因子2(SRY-related high-monility-group(HMG)-box protein-2,SOX2)、干细胞特异基因POU5f1转录因子4(octamer-binding transcription factor-4,OCT4)和NANOG 3个多能性干细胞标志基因及成骨细胞特异基因骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)和骨粘连蛋白(osteonectin,ONN)基因的表达;成骨诱导分化的细胞进行成骨细胞特异性指标碱性磷酸酯酶(alkaline phosphatase,ALP)、茜素红染色鉴定。结果表明,p5和p10细胞的生长曲线基本保持一致,而p20细胞的生长速度明显低于p5和p10。犬BMSCs表达OCT4和SOX2,但不表达NANOG;成骨细胞诱导10 d仍低水平表达OCT4和SOX2,但成骨细胞诱导21 d,不再表达OCT4和SOX2。随着诱导时间的延长,成骨细胞特异OCN和ONN基因的表达量增加。进行成骨诱导7 d后,ALP活性明显上升;成骨诱导10 d,未形成钙化结节;成骨诱导21 d,形成钙化结节,钙化结节被茜素红染成红色,随着诱导时间的延长,形成的钙化结节明显增多。证明犬BMSCs被成功地诱导为成熟的成骨细胞,可作为种子细胞用于兽医临床上犬的重症骨折、骨营养不良性关节病等疾病的治疗提供基础资料,为宠物犬临床疑难疾病的治疗开辟一条新途径。

关键词：犬骨髓间充质干细胞(BMSCs) 体外培养成骨诱导分化细胞鉴定

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小鼠卵母细胞去核方法的改进

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农业生物技术学报 2014年第9期22卷 1106-1113页

作者：贾洪响马斌斌魏强赵晓娥孟永芳谷建锋马保华西北农林科技大学动物医学院/农业部动物生物技术重点实验室

为摸索一种简单有效的小鼠(Mus musculus)卵母细胞去核方法,本研究对压电脉冲装置(Piezo)辅助显微操作条件下的小鼠中期Ⅱ(metaphaseⅡ,MⅡ)卵母细胞去核方法进行了改进,比较了改进的去核方法和常规去核方法,在无蔗糖或含蔗糖去核操作... 详细信息

为摸索一种简单有效的小鼠(Mus musculus)卵母细胞去核方法,本研究对压电脉冲装置(Piezo)辅助显微操作条件下的小鼠中期Ⅱ(metaphaseⅡ,MⅡ)卵母细胞去核方法进行了改进,比较了改进的去核方法和常规去核方法,在无蔗糖或含蔗糖去核操作液中的去核效果及核移植重构胚的后续发育能力;用改进的去核法在无蔗糖的去核操作液中对卵母细胞进行去核,比较卵母细胞去核操作液及核移植操作液中添加不同浓度胎牛血清(FBS)时核移植重构胚的后续发育能力。结果显示,MⅡ期卵母细胞在无蔗糖和含3%蔗糖的去核操作液中通过调整显微镜物镜距离显示MⅡ期纺锤体区域的方法进行显核,显核率分别为98.4%(184/187)和98.7%(153/155)(P>0.05)。在无蔗糖或含蔗糖的去核操作液中,用改进的去核法,即去核针穿过透明带后,紧贴MⅡ期纺锤体区域的质膜,施加负压将MⅡ期纺锤体区域吸住并将其直接拉出卵母细胞,去核率分别为84.6%和88.2%;用常规去核法在这2种去核操作液中去核,去核率分别为83.1%和88.6%,各组之间差异均不显著(P>0.05);用改进的去核法比常规去核法吸出的胞质少。用改进的去核方法在无蔗糖的去核操作液中去核后,构建的核移植重构胚发育到8-细胞、桑椹胚和囊胚的比率最高,桑椹胚发育率(16.3%)和囊胚发育率(5.8%)显著高于用该法在含蔗糖的去核操作液中去核组(5.1%和0)。用常规去核法在无蔗糖操作液及含蔗糖操作液中去核后,核移植重构胚的桑椹胚发育率分别为3.3%和1.2%(P<0.05),且均未获得囊胚发育。去核操作液和核移植操作液中添加20%FBS时,重构胚囊胚发育率显著高于添加10%FBS组(10.9%对4.9%)(P<0.05),表明用改进的去核方法在添加20%胎牛血清(FBS)的操作液中进行去核及核移植操作是可行的,而且对重构胚后续发育的支持能力较好。本研究为进一步提高小鼠体细胞核移植效率做出了有益的探索。

关键词：体细胞核移植重构胚去核卵母细胞小鼠

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培养液充气标准气氧气比例及充气时间对小鼠胚胎密闭培养效果的影响

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农业生物技术学报 2013年第7期21卷 783-791页

作者：谷建锋魏强赵晓娥马保华西北农林科技大学动物医学院农业部动物生物技术重点实验室

胚胎密闭培养是空间胚胎发育研究的基本条件,在胚胎密闭培养中,培养液适宜的氧含量对早期胚胎发育至关重要。本研究采用两种氧气比例不同的标准气和两个充气时长,对胚胎培养液进行标准气充气,研究标准气的氧气比例和培养液充气时间对密... 详细信息

胚胎密闭培养是空间胚胎发育研究的基本条件,在胚胎密闭培养中,培养液适宜的氧含量对早期胚胎发育至关重要。本研究采用两种氧气比例不同的标准气和两个充气时长,对胚胎培养液进行标准气充气,研究标准气的氧气比例和培养液充气时间对密闭培养小鼠(Mus musculus)2-细胞胚胎体外发育的影响。胚胎密闭培养前,使用由5%O2,5%CO2,90%N2或7.5%O2,5%CO2,87.5%N2组成的高纯标准气对胚胎培养液分别充气120或150min,以不充气密闭培养和常规微滴培养为对照组。在培养开始后24和48h检测胚胎过氧化物;培养96和72h时检测胚胎缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α);培养72和96h时统计囊胚发育率和孵化率,并进行囊胚细胞计数。结果显示,利用氧气比例为7.5%的标准气对胚胎培养液充气120min组和充气150min组的胚胎在培养24h时能够检测出过氧化物累积;5%O2标准气充气120min,5%O2标准气充气150min和7.5%O2标准气充气120min组胚胎,在培养96h时可检测到HIF-1α阳性,而不充气密闭培养组在培养48h时即可检测到HIF-1α阳性;5%O2标准气充气120或150min,7.5%O2标准气充气120或150min时,密闭培养胚胎均能获得较理想的囊胚发育率和孵化率。培养72h时,5%O2标准气充气120 min组的囊胚发育率(92.63±0.89)%高于其他3个充气密闭培养组,但无统计学差异(P>0.05),不充气密闭培养组囊胚发育率(57.04±10.04)%显著低于各充气密闭培养组(P<0.05),微滴培养组囊胚发育率(98.67±1.33)%显著高于7.5%O2的标准气充气120min组((87.15±2.35)%,P<0.05)。培养96h时,各充气密闭培养组及微滴培养组囊胚发育率和囊胚孵化率无显著差异(P>0.05),但均显著高于不充气密闭培养组(P<0.05)。各充气密闭培养组胚胎体外培养72h后,囊胚细胞数差异不显著(P>0.05)。培养96h时,5%O2标准气充气120min组密闭培养胚胎的囊胚细胞数(114.12±3.66)显著高于其他充气密闭培养组和不充气密闭培养组(P<0.05),与微滴组(110.56±5.24)无统计学差异(P>0.05)。研究结果表明,使用由5%O2,5%CO2和90%N2组成的标准气对胚胎培养液持续充气120～150min时,可较好地支持密闭培养小鼠2-细胞胚胎发育至囊胚阶段,并完成囊胚的孵化。本研究确定了小鼠2-细胞胚胎密闭培养适宜的标准气O2比例和充气时间,完善了胚胎密闭培养体系,为建立适宜于小鼠早期胚胎空间发育研究的密闭培养体系积累基础资料。

关键词：缺氧诱导因子-1α 过氧化物标准气胚胎密闭培养小鼠

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彗星试验检测体外培养山羊卵母细胞的老化程度

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农业生物技术学报 2012年第12期20卷 1433-1440页

作者：赵晓鹏马斌斌孟永芳谷建锋魏强赵晓娥马保华西北农林科技大学动物医学院农业部动物生物技术重点实验室

为提高体外成熟山羊卵母细胞利用率,减少因卵母细胞老化而造成的质量下降,本研究通过彗星试验对体外成熟培养山羊(Capra hircus)卵母细胞的DNA受损程度进行研究。结果表明,随着成熟培养时间的延长,尤其是培养时间超过24h以后,卵母细胞... 详细信息

为提高体外成熟山羊卵母细胞利用率,减少因卵母细胞老化而造成的质量下降,本研究通过彗星试验对体外成熟培养山羊(Capra hircus)卵母细胞的DNA受损程度进行研究。结果表明,随着成熟培养时间的延长,尤其是培养时间超过24h以后,卵母细胞的极体逐渐退化,其DNA损伤程度明显增加,卵母细胞凋亡和老化的现象越来越严重。在体外成熟培养24h之内,检测到极体的卵母细胞的比例随着培养时间的延长而显著增加(20h,(45.74±2.67)%;22h,(66.11±1.12)%),卵母细胞平均彗尾长度均小于100μm,其中有极体卵母细胞彗尾长度在0～50μm之间的比例(20h,(77.27±2.27)%;22h,(40.12±1.55)%)小于无极体卵母细胞(20h,(83.86±1.34)%;22h,(51.39±8.45)%)。体外成熟培养24h时,有极体的卵母细胞比例达到最高值(80.19±2.07)%,有极体和无极体卵母细胞的平均彗尾长度基本相同((96.08±4.52)μmvs(95.25±9.28)μm),有极体卵母细胞的彗尾分布主要以50～100μm((45.71±0.50)%)和100～150μm((35.45±2.92)%)区段为主,而无极体卵母细胞主要分布在0～50μm((30.92±4.02)%)和50～100μm((33.02±3.23)%)两个区段。当培养时间超过26h以后,有极体的卵母细胞比例显著下降(26h,(72.01±2.88)%;28h,(59.77±3.59)%);无论是有极体或无极体的卵母细胞,其平均彗尾长度都继续增加,彗尾长度分布在150μm以上的卵母细胞比例迅速增加。培养至30h时,有极体的卵母细胞比例下降至(46.34±2.07)%,其平均彗尾长度为(180.11±10.33)μm,彗尾长度分布在150μm以上的比例为(58.33±4.81)%;无极体卵母细胞平均彗尾长度为(270±17.72)μm,彗尾长度分布在150μm以上的比例为(80.95±2.38)%,均高于有极体卵母细胞。本研究结果表明,山羊卵母细胞在体外成熟后会逐渐老化,尤其是在成熟培养时间超过24h后,老化卵母细胞比例显著增加。本研究可使我们对卵母细胞老化的机理有了更进一步的了解和认识,有助于通过减少卵母细胞老化来提高卵母细胞的质量。

关键词：彗星试验体外成熟老化卵母细胞山羊

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