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高技术通讯 2005年第5期15卷 77-81页

作者：马鸣潇金宁一王振国费东亮郑敏金扩世夏志平葛淑敏金明兰中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所全军基因工程重点实验室长春130062 锦州医学院畜牧兽医学院锦州121001 不详

参照国内外已发表的禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)的基因序列和AIV相关的RT-PCR检测方法,根据AIV高保守、高特异的M蛋白基因设计了一套通用型引物,通过对相关病毒、棉拭子检测,建立了AIV通用型RT-PCR检测方法.根据AIV HA基因... 详细信息

参照国内外已发表的禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)的基因序列和AIV相关的RT-PCR检测方法,根据AIV高保守、高特异的M蛋白基因设计了一套通用型引物,通过对相关病毒、棉拭子检测,建立了AIV通用型RT-PCR检测方法.根据AIV HA基因设计了H5、H7、H9亚型的联合RT-PCR引物,其上下游引物分别位于裂解位点两侧,在确定各亚型单项RT-PCR检测方法的反应条件和反应体系的基础上,建立、优化了三联RT-PCR检测方法的反应体系和反应条件,并通过相关病毒、质粒、棉拭子检测,建立了AIV三联RT-PCR检测方法.最终建立了AIV系列RT-PCR检测方法,该方法具有快速、敏感、特异等优点,为AIV检测、流行病学调查、致病性分析及疫苗使用等奠定了基础.

关键词： PCR检测方法禽流感病毒流行病学调查基因设计反应体系反应条件 AIV Virus PCR引物基因序列 H9亚型裂解位点疫苗使用通用型国内外相关 M蛋白 V系列致病性基础三联棉

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口蹄疫三价重组鸡痘病毒疫苗分子设计及其构建

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高技术通讯 2007年第3期17卷 288-294页

作者：马鸣潇金宁一刘慧娟沈国顺郑敏金明兰鲁会军霍晓伟马海利中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所全军基因工程重点实验室长春130062 辽宁医学院动物医学院锦州121001 吉林大学畜牧兽医学院长春130062

针对我国口蹄疫（FMD）流行情况,利用计算机软件模拟分析,构建了口蹄疫病毒（FMDV）复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT。该表达盒以O型、A型FMDV结构蛋白VP1全基因和AsiaⅠ型FMDV2个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因（其... 详细信息

针对我国口蹄疫（FMD）流行情况,利用计算机软件模拟分析,构建了口蹄疫病毒（FMDV）复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT。该表达盒以O型、A型FMDV结构蛋白VP1全基因和AsiaⅠ型FMDV2个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因（其中2个抗原表位来源于FMDVIND63/7株,该毒株与我国新疆分离株属于同一基因拓扑型,其余3个抗原表位来源于FMDVYNBS/58株）作为主要免疫原基因,以非结构蛋白上的2个Th2细胞表位基因及结构蛋白上的1个Th2细胞表位基因作为辅助基因。将构建好的表达盒OAAT和猪IL-18基因分别插入到鸡痘病毒（FPV）表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子（ATI-P7.5×20）和单一启动子（P7.5）下游,构建了携带OAAT表达盒和猪IL-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-OAAT-IL18。应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,经BrdU进行3次加压蚀斑筛选后,以不同代次的细胞mRNA为模板,利用FMDVVP1基因和猪IL-18基因特异引物进行RT-PCR和IFA检测,筛选出OAAT和猪IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rF-PV-OAAT-IL18,该重组鸡痘病毒的构建为新型FMDV活载体疫苗的研究奠定了基础。

关键词：复合多表位抗原表达盒 OAAT口蹄疫病毒鸡痘病毒

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重组HIV-1 DNA疫苗工程菌中试发酵工艺的优化

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中国生物制品学杂志 2010年第5期23卷 500-502,506页

作者：宋英今金宁一李霄田明摇张立树李昌天津大学农业与生物工程学院天津300072 解放军军事医学科学院军事兽医研究所全军基因工程实验室长春130062

目的优化重组HIV-1DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺。方法优化质粒转化条件,制备工程菌Jm109/pVAX1-MEGp24种子液,连续传30代,检测其遗传稳定性;优化培养基成分、补料基质、补料方式和培养时间,确定最佳发酵参数;并应用最佳发酵参数,于50L... 详细信息

目的优化重组HIV-1DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺。方法优化质粒转化条件,制备工程菌Jm109/pVAX1-MEGp24种子液,连续传30代,检测其遗传稳定性;优化培养基成分、补料基质、补料方式和培养时间,确定最佳发酵参数;并应用最佳发酵参数,于50L发酵罐进行3批中试规模的发酵,考察在发酵培养过程中质粒的稳定性和超螺旋质粒的比例。结果工程菌在连续传代30次后,质粒拷贝数基本保持稳定;最佳发酵参数为:采用以甘油为碳源的培养基,以梯度恒速流加方式补料,培养时间13h;通过3批稳定发酵,最终可获得湿菌67.0～68.6g/L,质粒含量可达1.62～1.73mg/g菌,超螺旋质粒的比例达93%以上。结论已建立了稳定的重组HIV-1DNA疫苗工程菌中试发酵工艺,为进一步规模化生产奠定了基础。

关键词： HIV-1 DNA疫苗工程菌发酵

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O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及其在重组杆状病毒中的表达

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中国兽医学报 2006年第1期26卷 42-44页

作者：韩松金宁一鲁会军郑敏尹革芬葛淑敏金扩世解放军军事医学科学院军事兽医研究所解放军基因工程重点实验室吉林长春130062

利用杆状病毒表达系统进行了口蹄疫病毒VP1基因在Sf9细胞中的表达研究。首先克隆了VP1基因片段,将pMD18-VP1质粒及杆状病毒转座载体质粒pFastBac分别用BamH及Hind酶切后,用T4DNA连接酶连接,构建了重组质粒pFastBac-VP1;再将该重组质粒转... 详细信息

利用杆状病毒表达系统进行了口蹄疫病毒VP1基因在Sf9细胞中的表达研究。首先克隆了VP1基因片段,将pMD18-VP1质粒及杆状病毒转座载体质粒pFastBac分别用BamH及Hind酶切后,用T4DNA连接酶连接,构建了重组质粒pFastBac-VP1;再将该重组质粒转化DH10Bac感受态细菌,在菌体内进行重组,并经三重抗性与蓝白斑筛选,得到杆状病毒重组质粒Bacmid-VP1;将Bacmid-VP1转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒,并进行表达水平的检测。经SDS-PAGE和Western-blotting检测,结果表明,VP1蛋白在重组杆状病毒中获得表达。

关键词：口蹄疫病毒 VP1基因杆状病毒表达

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载基因壳聚糖纳米粒的制备及免疫增强作用的初步研究

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中国生物工程杂志 2008年第2期28卷 37-41页

作者：计越金宁一鲁会军马鸣潇金明兰霍晓伟郑敏李旭刘慧娟中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所全军基因工程重点实验室

目的:制备壳聚糖载基因纳米粒,并对其体外转染效率及其在小鼠体内的免疫增强效果进行初步研究。方法:以构建的口蹄疫DNA疫苗为模型药物,采用复凝聚法制备纳米粒;用透射电镜观察形态;用纳米粒度分析仪测定粒径、多分散度和zeta电位;凝胶... 详细信息

目的:制备壳聚糖载基因纳米粒,并对其体外转染效率及其在小鼠体内的免疫增强效果进行初步研究。方法:以构建的口蹄疫DNA疫苗为模型药物,采用复凝聚法制备纳米粒;用透射电镜观察形态;用纳米粒度分析仪测定粒径、多分散度和zeta电位;凝胶阻滞分析测定基因在纳米粒中的位置;用体外基因转染实验评价纳米粒的转染活性。用载基因壳聚糖纳米粒免疫雌性Balb/c小鼠,检测免疫小鼠的细胞免疫和体液免疫水平。结果:所制备的载基因纳米粒形态规则、大多成球形,平均粒径约为150nm,多分散度<0.26,zeta电位约为21mV;凝胶分析结果表明质粒DNA与壳聚糖分子间可以通过电性结合作用而完全结合,基因几乎全部被包裹在纳米粒内部;体外基因转染实验表明壳聚糖作为一种新型的非病毒基因递送载体能够高效传递DNA进入BHK-21细胞,基因能够在该细胞中高效表达;小鼠免疫实验表明纳米粒不仅能诱导机体产生较高的细胞免疫水平,而且体液免疫水平也显著提高。结论:壳聚糖纳米粒能将基因递送到细胞内并且能够表达,小鼠免疫实验显示其具有良好的免疫增强效果。

关键词：壳聚糖纳米粒转染免疫原性

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O型口蹄疫病毒O／LZ株拯救

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畜牧兽医学报 2008年第3期39卷 333-336页

作者：马鸣潇金宁一沈国顺刘慧娟霍晓伟金明兰郑敏鲁会军金扩世中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所全军基因工程重点实验室

以构建的口蹄疫病毒O/LZ株全长cDNA为模板,使用T7RNA聚合酶系统在体外进行转录,得到病毒RNA。用脂质体转染法将转录物RNA导入BHK细胞,可观察到典型的口蹄疫病毒致细胞病变效应。对收获的病毒分别用RT-PCR、免疫荧光以及免疫电子显微镜... 详细信息

以构建的口蹄疫病毒O/LZ株全长cDNA为模板,使用T7RNA聚合酶系统在体外进行转录,得到病毒RNA。用脂质体转染法将转录物RNA导入BHK细胞,可观察到典型的口蹄疫病毒致细胞病变效应。对收获的病毒分别用RT-PCR、免疫荧光以及免疫电子显微镜观察等方法进行鉴定,结果表明拯救到特定的口蹄疫病毒。同时用空斑试验法观察了拯救病毒及其母本毒株的生长特性,结果表明二者没有明显差异,这将为进一步探索猪口蹄疫病毒致病的分子机制及研制新型口蹄疫疫苗奠定良好的基础。

关键词：口蹄疫病毒 cDNA 转录产物 RNA

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H5N1高致病性人禽流感DNA疫苗表达质粒的构建及其免疫原性

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中国生物制品学杂志 2010年第3期23卷 286-289页

作者：王飞朱庆三金宁一胡宁宁李霄吉林大学中日联谊医院长春130033 解放军208医院创伤外科长春130062 军事医学科学院军事兽医研究所全军基因工程实验室长春130062

目的构建H5N1高致病性人禽流感DNA疫苗表达质粒,并观察其免疫原性。方法分析H5N1人禽流感病毒HA基因的进化关系,人工合成人禽流感病毒HA基因(包含多数H5N1人禽流感病毒共有序列),构建含细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)和HA融合基因的真... 详细信息

目的构建H5N1高致病性人禽流感DNA疫苗表达质粒,并观察其免疫原性。方法分析H5N1人禽流感病毒HA基因的进化关系,人工合成人禽流感病毒HA基因(包含多数H5N1人禽流感病毒共有序列),构建含细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)和HA融合基因的真核表达质粒pVAX-CLHA及HA基因的真核表达质粒pVAX-HA,经酶切及测序鉴定正确后,转染293-T细胞,经RT-PCR法检测转染细胞中HA基因mRNA的转录水平,间接免疫荧光法(IFA)检测其表达;分别以质粒pVAX-CLHA及pVAX-HA免疫BALB/c小鼠,测定血清HI抗体效价。结果重组DNA疫苗表达质粒pVAX-CLHA和pVAX-HA经酶切及测序证明构建正确,转染的293-T细胞可检测到目的基因的转录及蛋白的表达;3次免疫后均能诱导BALB/c小鼠产生HI抗体,pVAX-CLHA诱导的HI抗体高于pVAX-HA。结论已成功构建了含H5N1HA及CTLA4融合基因的DNA疫苗表达质粒,其对小鼠具有良好的免疫效果,为H5N1高致病性人禽流感DNA疫苗的开发奠定了基础。

关键词：高致病性人禽流感病毒 H5N1亚型 DNA疫苗免疫原性

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猪源新城疫病毒JL01株分离鉴定及F基因遗传进化分析

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病毒学报 2009年第1期25卷 52-57页

作者：鲁会军金扩世李旭王瑞琳韩松金宁一中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所全军基因工程重点实验室吉林长春130062 吉林大学畜牧兽医学院吉林长春130062

2000年,在吉林省某猪场发生具有较高发病率和死亡率的急性传染病,发病率达到40%～50%,病死率15%,取其脾、肺、肾等组织进行电镜观察,可见副粘病毒样颗粒,表明其病原可能为某种猪源副粘病毒,命名为JL01株。在对该病毒的的血凝、血凝抑制... 详细信息

2000年,在吉林省某猪场发生具有较高发病率和死亡率的急性传染病,发病率达到40%～50%,病死率15%,取其脾、肺、肾等组织进行电镜观察,可见副粘病毒样颗粒,表明其病原可能为某种猪源副粘病毒,命名为JL01株。在对该病毒的的血凝、血凝抑制等生物学特性进行鉴定后,初步确定该种猪副粘病毒为猪源新城疫病毒。病毒回归试验表明,纯化的病毒对猪仍有较强的致死性,并可从死亡猪体内分离到新城疫病毒。该病毒对鸡胚平均致死时间(MDT)、脑内致病指数(ICPI)和半数致死量(EID50)分别为55.2h、1.60和10-7.5/0.1 mL,表明该毒株属于新城疫病毒强毒株。在此基础上,采用RT-PCR方法克隆了猪源新城疫病毒F基因,与其他10株NDV毒株进行序列比较分析,结果表明,JL01株与B1、LaSota、Clone30等经典的新城疫病毒弱毒株同源性较高(91.5%～98.5%),与ZJ1、Mukteswar等强毒株的同源性较低。F基因氨基酸裂解位点的序列为112G-K-Q-G-R-L117,与弱毒株序列完全相同。基因分型结果表明JL01株属于基因Ⅰ型。因此,本研究所分离到感染猪的新城疫病毒属于基因变异的新城疫病毒弱毒株,但其致病力与强毒株相当。

关键词：猪源新城疫病毒分离鉴定 F基因分析

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小鼠对HIV-2嵌合结构基因重组鸡痘病毒的免疫反应

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高技术通讯 2006年第7期16卷 730-734页

作者：李子健张立树金宁一江文正李昌北京大学第三医院血管医学研究所北京100083 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所全军基因工程重点实验室长春130062 华东师范大学生命科学学院上海200026

将HIV-2嵌合结构基因gag-gp105插入到转移载体pUTA2复合启动子ATI-P7.5×20下游,构建出鸡痘病毒重组转移质粒pA-gg;经转染和BrdU加压筛选,以基因组PCR和Western blot法鉴定重组病毒;将获得的重组病毒大量制备并纯化后,肌肉注射免疫B... 详细信息

将HIV-2嵌合结构基因gag-gp105插入到转移载体pUTA2复合启动子ATI-P7.5×20下游,构建出鸡痘病毒重组转移质粒pA-gg;经转染和BrdU加压筛选,以基因组PCR和Western blot法鉴定重组病毒;将获得的重组病毒大量制备并纯化后,肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清HIV-2抗体,流式细胞仪测定CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞亚类数量,乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测脾特异性CTL杀伤活性.结果表明,成功筛选出一株可稳定表达HIV-2嵌合蛋白Gag-gp105的重组鸡痘病毒rFPV-gg;该重组病毒免疫组小鼠的血清出现HIV-2抗体,脾T细胞亚类数量增加,并产生针对HIV-2靶细胞的特异性CTL杀伤活性.本研究提示,HIV-2 gag-gp105重组病毒能诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫应答.

关键词：人免疫缺陷病毒Ⅱ型(HIV-2) 结构基因重组鸡痘病毒免疫反应

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共表达H5、H7亚型AIV HA基因与鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒构建

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高技术通讯 2006年第4期16卷 408-413页

作者：王振国金宁一马鸣潇费东亮贾雷立金扩世尹革芬中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所全军基因工程重点实验室长春130062 吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心长春130062 锦州医学院畜牧兽医学院 121001 不详

以鸡痘病毒（FPV）疫苗株为载体,将H5和H7亚型禽流感病毒血凝素（AIV HA）基因串联后（拥有同一个阅读框）和鸡白细胞介素-18（IL-18）基因分别插入到鸡痘病毒表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子（ATI-P7.5×20）和单一启动子1（P7.5... 详细信息

以鸡痘病毒（FPV）疫苗株为载体,将H5和H7亚型禽流感病毒血凝素（AIV HA）基因串联后（拥有同一个阅读框）和鸡白细胞介素-18（IL-18）基因分别插入到鸡痘病毒表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子（ATI-P7.5×20）和单一启动子1（P7.5）下游,构建了携带AIV HA基因和鸡白细胞介素-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5-H7-IL18;用相同的方法构建重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5-IL18;将H5亚型AIV HA基因插入到鸡痘病毒表达载体pUTA2复合启动子（ATI-P7.5×20）下游,构建了携带H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTA2-H5.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,经BrdU进行三次加压蚀斑筛选后,以不同代次的细胞mRNA为模板,利用H5亚型AIV HA基因、H7亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因特异引物进行RT-PCR和蛋白印迹检测,筛选出H5HA-H7HA融合蛋白基因和鸡IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-H7HA-IL18,H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18以及单独表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA.这些重组鸡痘病毒的构建为AIV活载体疫苗的研制奠定了基础.

关键词：禽流感病毒血凝素基因重组禽痘病毒鸡白细胞介素-18

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