目的探讨苯甲酰乌头碱(benzoylaconitine,BAC)对H9c2心肌细胞氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)/复氧(reoxyenation,R)损伤的保护作用。方法体外培养建立H9c2心肌细胞OGD/R损伤模型,通过不同浓度(0、25、50、75、100μmol/L)BAC处理,确定最佳BAC治疗浓度。根据BAC最佳剂量,将心肌细胞分为对照组、OGD/R组、BAC处理组(OGD/R+75μmol/L BAC组)、PI3K/Akt抑制剂组(OGD/R+LY294002组)以及BAC和PI3K/Akt抑制剂组(OGD/R+LY294002+75μmol/L BAC组)。通过相关试剂盒评估细胞活力及细胞乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)水平;检测细胞肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的表达。蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)通路蛋白和微管相关蛋白1轻链3(light chain 3,LC3)Ⅱ/LC3Ⅰ、苄氯素1(Beclin1)和自噬降解底物(P62)等自噬相关蛋白的表达情况。结果与对照组比较,OGD/R组细胞活力显著下降,LDH显著升高(P<0.01);与OGD/R组比较,OGD/R+75μmol/L BAC组H9c2心肌细胞活力显著升高(0.87±0.06 vs 0.49±0.06,P<0.01),ODG/R+75μmol/L BAC组LDH水平显著下降(86.75±7.79 U/L vs 234.42±6.20 U/L,P<0.01)。与对照组比较,OGD/R组TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表达显著升高(P<0.01),OGD/R组GSH-Px、p-PI3K、p-Akt、P62表达显著降低(P<0.01);与OGD/R组比较,OGD/R+75μmol/L BAC组p-PI3K、p-Akt、P62蛋白表达显著升高(0.90±0.07 vs 0.58±0.04、1.02±0.02 vs 0.49±0.01、1.48±0.05 vs 0.87±0.04),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表达显著降低(0.52±0.01 vs 1.24±0.04、0.12±0.01 vs 0.32±0.02,P<0.01)。结论BAC能够降低OGD/R后心肌细胞炎性反应和氧化应激水平,调节细胞自噬稳态,降低心肌细胞损伤,其调节心肌自噬稳态的作用可能与PI3K/Akt通路的激活有关。
目的:探讨雷帕霉素(Rapa)保护脓毒症大鼠下丘脑的作用机制。方法:将60只健康雄性SD大鼠随机分为四组:假手术组(Sham)、雷帕霉素组(Rapa)、脓毒症组(Sepsis)以及脓毒症+雷帕霉素预处理组(Sepsis+Rapa),每组含15只大鼠。经4天腹腔雷帕霉素注射后,采用盲肠结扎穿孔(CLP)的方法建立脓毒症模型。随后,绘制大鼠的生存曲线,通过HE染色和尼氏染色技术观察下丘脑的组织病理学变化。利用ELISA技术测定下丘脑组织中活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)的含量;原位末端转移酶标记法观察大鼠下丘脑组织凋亡;Western blot方法测定大鼠下丘脑组织中p-mTOR、mTOR、P62和LC3的表达,并计算LC3II/LC3I比值;免疫荧光检测下丘脑中LC3与Tom20的共定位。结果:与脓毒症组相比,雷帕霉素提高脓毒症大鼠的生存率(P=0.0022),减轻脓毒症大鼠下丘脑病理损伤和细胞凋亡(11.75±4.77 vs 30.63±6.65),减少下丘脑组织的ROS(163.8±21.28 vs 283.8±55.98)和MDA(63.35±11.62 vs 91.64±8.166)的水平。Western-blot和免疫荧光结果显示,雷帕霉素下调脓毒症大鼠下丘脑组织中mTOR和p62的水平,增加LC3II/LC3I比值,增强LC3和Tom20在下丘脑组织中的相互结。结论:雷帕霉素通过抑制mTOR信号通路,上调线粒体自噬,减轻脓毒症对下丘脑的损伤,有效保护下丘脑。
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