检索结果-内蒙古大学图书馆

中华肝脏病杂志 2006年第2期14卷 81-85页

作者：王琳成军李克洪源解放军第三○二医院传染病研究所病毒性肝炎研究室北京100039

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白6号结合蛋白基因(Hcbp6)序列表达的调控机制。方法根据软件对启动子的预测,选取翻译起始密码子ATG上游3256bp及下游180bp的DNA序列, 分成5段活性区域,分别以聚合酶链反应技术(PCR),肝母细胞瘤细胞系He... 详细信息

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白6号结合蛋白基因(Hcbp6)序列表达的调控机制。方法根据软件对启动子的预测,选取翻译起始密码子ATG上游3256bp及下游180bp的DNA序列, 分成5段活性区域,分别以聚合酶链反应技术(PCR),肝母细胞瘤细胞系HepG2基因组DNA为模板,扩增该启动子DNA片段,将其克隆至pCAT3中,构建pCAT3-Hcbp6-p报告基因表达载体,将该质粒分别转染HepG2、NIH3T3细胞,用酶联免疫吸附法检测报告基因编码产物氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果发现质粒pCAT3-Hcbp6-1066p和pCAT3-Hcbp6-240p能够指导CAT的表达,其平均吸光度值(A)是pCAT3-basic对照质粒的3.1倍和6.4倍。结论本研究克隆的启动子DNA序列具有转录活性, 这一结果为研究Hcbp6的调节机制,进一步阐明HCV核心蛋白的作用机制奠定了基础。

关键词：肝炎病毒丙型启动子 Hcbp6

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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4A反式激活基因的克隆化研究

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中华实验和临床病毒学杂志 2006年第3期20卷 270-272页

作者：刘妍白桂芹成军杨倩张黎颖纪冬王建军解放军第三○二医院传染病研究所病毒性肝炎研究室-全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京100039 北京地坛医院传染病研究所

目的应用抑制性消减杂交（SSH）技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白4A（HCV NS4A）转染细胞差异表达cDNA消减文库，克隆HCV NS4A蛋白反式激活相关基因。方法以HCV NS4A表达质粒pcDNA3．1（-）-NS4A转染Hep G2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）... 详细信息

目的应用抑制性消减杂交（SSH）技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白4A（HCV NS4A）转染细胞差异表达cDNA消减文库，克隆HCV NS4A蛋白反式激活相关基因。方法以HCV NS4A表达质粒pcDNA3．1（-）-NS4A转染Hep G2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，进行SSH分析。将富集的二次PCR产物与TIA载体连接，并转染大肠埃希菌进行文库扩增，随机挑取克隆，聚合酶链反应（PCR）扩增后进行测序及同源性分析。结果文库扩增后得到36个阳性克隆，经菌落PCR分析显示200～1000bp插入片段。对其中的25个片段测序，并进行同源性分析，显示18种已知基因编码蛋白和2种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS4A反式激活靶基因。结论成功构建了HCV NS4A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，为进一步阐明HCV NS4A反式调节的靶基因等提供了相关的平台。

关键词：肝炎病毒病毒非结构蛋白质类反式激活(遗传学) 抑制,遗传杂交

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抑制性消减杂交技术筛选重组IFNβ下调HepG2细胞靶基因

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中华实验和临床病毒学杂志 2006年第3期20卷 273-275页

作者：钟彦伟成军曲建慧张黎颖郭江李晓东徐东平解放军第三○二医院传染病研究所病毒性肝炎研究室北京100039 北京地坛医院传染病研究所

目的利用抑制性消减杂交（SSH）技术构建重组干扰素β（IFNβ）刺激人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库，筛选IFNβ下凋HepG2相关基因。方法重组IFNβ2000U／ml刺激对数生长期HepG2细胞，以生理盐水作用的HepG2细胞为阴性对... 详细信息

目的利用抑制性消减杂交（SSH）技术构建重组干扰素β（IFNβ）刺激人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库，筛选IFNβ下凋HepG2相关基因。方法重组IFNβ2000U／ml刺激对数生长期HepG2细胞，以生理盐水作用的HepG2细胞为阴性对照；制备细胞裂解液，从中提取mRNA并逆转录为cDNA，经Rsa Ⅰ酶切后将实验组cDNA分成两份，分别与两种不同的接头连接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠埃希菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。结果成功构建重组IFNβ刺激HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后，得到58个阳性克隆，进行菌落PCR分析，均得到200～1000bp插入片段。随机挑选其中35个插入片段测序，并通过生物信息学分析，结果共获得12种编码基因。结论应用SSH技术成功构建了IFNβ刺激HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库，为进一步了解IFNβ在肝细胞内的免疫调节机制提供了依据。

关键词：干扰素β 杂交减量调节

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340例慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒多位点耐药相关突变分析

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中华肝脏病杂志 2008年第10期16卷 735-738页

作者：徐东平刘妍成军李晓东戴久增李乐梁兆玲白丽钟彦伟许智慧任晓强张玲霞解放军第三0二医院传染病研究所病毒性肝炎研究室北京100039 北京地坛医院

目的分析慢性乙型肝炎患者HBV逆转录酶基因与核苷（酸）类似物耐药相关的12个位点上的突变情况及其临床意义。方法提取血清HBVDNA，扩增HBV逆转录酶基因，对PCR产物进行DNA双向测序，对测序成功的样本进行基因型分析。检测逆转录酶基因1... 详细信息

目的分析慢性乙型肝炎患者HBV逆转录酶基因与核苷（酸）类似物耐药相关的12个位点上的突变情况及其临床意义。方法提取血清HBVDNA，扩增HBV逆转录酶基因，对PCR产物进行DNA双向测序，对测序成功的样本进行基因型分析。检测逆转录酶基因12个位点上的碱基突变情况，分析不同核苷（酸）．类似物使用情况、患者的耐药相关突变情况及不同核苷（酸）类似物耐药的突变形式。结果检出拉米夫定耐药突变63例，阿德福韦耐药突变10例，恩替卡韦耐药突变8例，替比夫定耐药突变l例。拉米夫定耐药突变中以M204V和M204I最常见，前者通常伴随L180M突变，后者常单独出现；阿德福韦耐药中以N236T±A181位碱基替换为主；恩替卡韦耐药突变发生在拉米夫定耐药基础上，以T184位碱基替换为主；替比夫定的耐药突变为M204I。少数未接受过核苷（酸）类似物治疗的患者也可检出耐药相关突变。结论检测HBV逆转录酶基因多位点耐药相关突变，有助于临床及时发现和确认乙型肝炎患者是否存在HBV耐药，合理进行抗病毒治疗。

关键词：肝炎病毒乙型突变耐药

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乙型肝炎病毒X蛋白转录抑制抑癌基因p53表达的研究

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中华实验和临床病毒学杂志 2006年第1期20卷 26-29页

作者：李进刘妍戴久增徐东平张玲霞解放军第三○二医院传染病研究所病毒性肝炎研究中心-全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京100039

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白对抑癌基因p53基因表达的调节作用。方法以寡核苷酸芯片技术筛选的HBx反式调节基因结果为基础,利用生物信息学技术确定抑癌基因p53的启动子区域(p53p),构建真核报告基因表达载体pCAT3-p53p;以该质粒单独... 详细信息

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白对抑癌基因p53基因表达的调节作用。方法以寡核苷酸芯片技术筛选的HBx反式调节基因结果为基础,利用生物信息学技术确定抑癌基因p53的启动子区域(p53p),构建真核报告基因表达载体pCAT3-p53p;以该质粒单独及与pcDNA3·1(-)-X共转染HepG2细胞,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。进一步采用半定量RT-PCR技术检测HBVX蛋白对p53基因表达的调节。结果成功构建报告载体pCAT3-p53p,克隆的p53启动子有顺式激活下游基因的活性;pCAT3-p53p与pcDNA3·1(-)-X共转染时CAT的表达活性明显下降,说明HBV X蛋白抑制p53基因启动子的转录。RT-PCR结果表明,转染了pcDNA3·1(-)-X的HepG2细胞中p53基因mRNA表达减少。结论HBVX蛋白在转录水平上反式抑制抑癌基因p53的表达,本实验不仅验证了基因芯片的筛选结果,而且为HBx在致肝细胞癌发生中的作用提供分子基础。

关键词：肝炎,病毒性,人肝炎,乙型蛋白p53 反式抑制

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40例乙型肝炎患者HBV逆转录酶基因耐药突变分析与表达载体构建

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中华实验和临床病毒学杂志 2009年第5期23卷 340-342页

作者：苏何玲刘妍刘文钟彦伟陈雪媛王春梅刘永明徐东平桂林医学院生物技术学院 541004 解放军第三○二医院传染病研究所病毒性肝炎研究室

目的分析40例慢性乙型肝炎患者血清中HBV逆转录酶区基因耐药相关突变，构建突变基因重组表达载体用于表型耐药分析。方法从服用抗HBV核苷（酸）类似物的患者血清中提取病毒DNA，PCR扩增HBVRT全长基因，克隆到pGEM—Teasy载体中，随机挑... 详细信息

目的分析40例慢性乙型肝炎患者血清中HBV逆转录酶区基因耐药相关突变，构建突变基因重组表达载体用于表型耐药分析。方法从服用抗HBV核苷（酸）类似物的患者血清中提取病毒DNA，PCR扩增HBVRT全长基因，克隆到pGEM—Teasy载体中，随机挑选3～5个克隆进行DNA序列测定，以DNASTAR软件分析RT基因内与核苷（酸）类似物耐药相关的常见突变位点。用XhoI和NcoI双酶切pGEM—Teasy—RT及pTriEx—HBV（C）构建1．1表达载体，测序正确后转染Huh7细胞，检测HBsAg和HBeAg表达水平。结果40例患者均分别检出拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦耐药相关的单一或联合突变；成功克隆了96条HBVRT基因，分别带有上述核苷（酸）类似物耐药相关变异的序列；挑选主要突变组合形式的40条RT基因构建pTriEx—HBV（C）1．1表达载体，转染Huh7细胞48h后在培养上清中检测到HBsAg和HBeAg，表明表达载体构建成功。结论本研究成功进行了临床患者HBV耐药相关突变分析与突变体重组表达载体构建，为进行表型耐药分析打下了基础。

关键词：肝炎病毒,乙型药物耐受,病毒重组遗传

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乙型肝炎病毒前-S1蛋白结合蛋白小鼠同源基因的生物信息学分析

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中华肝脏病杂志 2005年第4期13卷 241-244页

作者：成军董菁王建军张健纪冬钟彦伟刘妍王琳北京地坛医院传染病研究所 100011 解放军第三0二医院传染病研究所基因治疗中心全军病毒性肝炎防治研究重点实验室

目的克隆、鉴定乙型肝炎病毒(HBV)前-S1蛋白结合蛋白(PS1BP)小鼠同源基因,并进行初步的生物信息学分析。方法以克隆的人PS1BP基因序列作为参照,利用美国国立卫生研究院国立医学图书馆生物工程信息学中心建立的的核苷酸数据库,以及在线... 详细信息

目的克隆、鉴定乙型肝炎病毒(HBV)前-S1蛋白结合蛋白(PS1BP)小鼠同源基因,并进行初步的生物信息学分析。方法以克隆的人PS1BP基因序列作为参照,利用美国国立卫生研究院国立医学图书馆生物工程信息学中心建立的的核苷酸数据库,以及在线核苷酸序列同源性比对分析软件BLASTn,与数据库中已经收录的小鼠cDNA序列进行比对,确定PS1BP小鼠同源基因,比较人和小鼠PS1BP的蛋白质一级结构序列的同源性。对小鼠PS1BP蛋白质一级结构的特点进行生物信息学分析,并确定小鼠PS1BP基因组DNA的结构特点。结果通过不同种属核昔酸序列的同源性比对,确定小鼠PS1BP的cDNA由1455nt组成,编码产物由484aa组成。与人PS1BP蛋白质一级结构的同源性为84.92％(411／484)。对小鼠PS1BP蛋白一级结构序列进行生物信息学分析,发现一系列潜在的蛋白修饰位点。以小鼠PS1BP的cDNA序列作为参照,对高通量基因序列数据库进行同源基因的搜索,发现小鼠的一段基因组DNA序列(AC117576.3)与之同源,进一步的分子结果表明,小鼠的PS1BP基因组DNA含有3段外显子序列,2段内含子序列。结论确定了小鼠PS1BP基因序列,为进一步研究其功能和生物学作用奠定了基础。

关键词：乙型肝炎病毒前-S1蛋白结合蛋白小鼠同源基因生物信息学

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酵母双杂交技术筛选乙型肝炎e抗原反式激活蛋白结合蛋白的基因

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中华肝脏病杂志 2005年第4期13卷 245-248页

作者：王建军成军刘敏杨倩蔺淑梅刘妍解放军第三0二医院传染病研究所基因治疗研究中心全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京100039 北京地坛医院传染病研究所

目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与乙型肝炎e抗原反式激活蛋白(HBeAgTP)相互作用蛋白的基因。方法应用抑制性消减杂交技术及生物信息学技术筛选并克隆HBeAg反式激活的新型靶基因HBeAgTP。用聚合酶链反应(PCR)法扩增HBeAgTP基因,连接... 详细信息

目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与乙型肝炎e抗原反式激活蛋白(HBeAgTP)相互作用蛋白的基因。方法应用抑制性消减杂交技术及生物信息学技术筛选并克隆HBeAg反式激活的新型靶基因HBeAgTP。用聚合酶链反应(PCR)法扩增HBeAgTP基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,PCR从中扩增出目的片段并测序,进行生物信息学分析。结果成功克隆出HBeAgTP基因并在酵母细胞中表达,应用酵母双杂交筛选出阳性菌落24个,经生物信息学分析为15种已知基因。结论成功克隆出HBeAgTP的结合蛋白,包括一些与细胞内蛋白质的转录、翻译、免疫调节及物质和能量代谢相关的基因。

关键词：酵母双杂交技术筛选乙型肝炎e抗原反式激活蛋白结合蛋白基因

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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4A肝细胞结合蛋白基因的筛选与克隆

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中华肝脏病杂志 2005年第10期13卷 738-740页

作者：刘妍白桂芹成军吴顺华王琳严福明张玲霞崔玉芳解放军第三○二医院传染病研究所基因治疗研究中心全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京100039 北京地坛医院传染病研究所

目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4A(NS4A) 相互作用蛋白的基因,明确其具体作用机制。方法应用酵母双杂交系统3,将聚合酶链反应法扩增的HCV NS4A基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细... 详细信息

目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4A(NS4A) 相互作用蛋白的基因,明确其具体作用机制。方法应用酵母双杂交系统3,将聚合酶链反应法扩增的HCV NS4A基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖上进行双重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠杆菌,接种在氨苄青霉素-LB平板上,选择生长菌落,提取质粒酶切鉴定,测序并在GenBank中进行生物信息学分析。结果成功克隆出HCV NS4A基因, 构建表达载体并在酵母细胞中表达,与肝文库配合后选出既能在四缺培养基又能在铺有X-α-半乳糖的四缺培养基上生长,并变成蓝色的真阳性菌落22个,序列分析显示,筛选到的肝细胞蛋白编码基因参与细胞能量代谢、蛋白翻译合成等多种生物学过程。结论成功克隆出HCV NS4A蛋白在肝细胞内的结合蛋白, 为进一步研究NS4A蛋白的功能、阐明HCV致病的分子生物学机制提供了新线索。

关键词：肝炎病毒,丙型病毒非结构蛋白基因表达肝细胞结合蛋白酵母双杂交丙型肝炎病毒(HCV) 非结构蛋白NS4A 结合蛋白基因人肝细胞克隆

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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B肝细胞结合蛋白基因的筛选与克隆

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中华实验和临床病毒学杂志 2005年第3期19卷 248-251页

作者：刘妍成军白桂芹严福明吴顺华王琳张玲霞解放军第三○二医院传染病研究所基因治疗研究中心全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京100039

目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)相互作用蛋白的基因,明确其具体作用机制。方法应用酵母双杂交系统3,将多聚酶链反应(PCR)法扩增的HCVNS4B基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵... 详细信息

目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)相互作用蛋白的基因,明确其具体作用机制。方法应用酵母双杂交系统3,将多聚酶链反应(PCR)法扩增的HCVNS4B基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和Xα半乳糖(Xαgal)上进行双重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠埃希菌,接种在氨苄西林LB平板上,选择生长菌落,提取质粒酶切鉴定,测序并在GenBank中进行生物信息学分析。结果成功克隆出HCVNS4B基因并在酵母细胞中表达,与肝文库配合后选出既能在4缺(SD/TrpLeuAdeHis)培养基又能在铺有Xαgal的4缺培养基上生长,并变成蓝色的真阳性菌落5个,序列分析显示,筛选到的肝细胞蛋白编码基因参与细胞代谢、生物氧化、生长调节等多种生物学过程。结论成功克隆出HCVNS4B蛋白与肝细胞相互作用蛋白,为进一步研究NS4B蛋白的功能,阐明HCV致病的分子生物学机制提供了新线索。

关键词：肝炎,丙型肝炎病毒属病毒非结构蛋白质类双杂交系统技术丙型肝炎病毒(HCV) NS4B基因结合蛋白基因人肝细胞非结构蛋白克隆

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