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第二届全国现代免疫诊断技术学术研讨会

作者：候俊胡燕沈宏辉朱雷貌盼勇解放军第302医院传染病研究所病毒研究室 100039

目的：用抗HIV-1p24单克隆抗体和多克隆抗体构建间接ELISA检测试剂,检测献血员、HIV-1抗体阳性及其他病种样品,探讨其应用的可行性,从而为试剂盒的研制奠定基础,同时为HIV的早期诊断、预后判断及评价抗病毒的治疗效果方面提供重要的诊... 详细信息

目的：用抗HIV-1p24单克隆抗体和多克隆抗体构建间接ELISA检测试剂,检测献血员、HIV-1抗体阳性及其他病种样品,探讨其应用的可行性,从而为试剂盒的研制奠定基础,同时为HIV的早期诊断、预后判断及评价抗病毒的治疗效果方面提供重要的诊断依据. 方法:根据Triques,K报道的HIV-1全基因序列中的gag基因序列扩增p24抗原全序列,将其插入pRSET表达载体进行表达,利用固定化金属粒子(Ni2+)配体亲和层析技术(IMAC)纯化p24抗原后,制备抗HIVP24单克隆抗体及多克隆抗体,将抗HIV-1p24单克隆抗体经33﹪的饱和硫酸氨沉淀后包板作为固相,辣根过氧化物酶标记经DEAE52纯化的兔抗HIV-1p24抗体作为酶标记物,建立检测HIVP24抗原的双抗体夹心ELISA方法. 结果:该方法具有较高的敏感性和特异性,检测HIV-1p24标准抗原的检出灵敏度为100pg/ml,检测87份HIV抗体阳性血清中1份HIV-1p24抗原阳性;检测195份健康献血员和131份其他病种病人血清(其中HAV39份;HCV40份;HBV36份;麻疹9份;流行腮腺炎5份;风疹2份),特异性为99.39﹪(324/326),2份弱阳性血清均为HCV抗体阳性. 结论:该方法具有较高的灵敏度和特异性,且操作简便,结合特异性抗体检测有助于缩短HIV感染诊断的窗口期.

关键词：抗HIV-1p24 单克隆抗体间接ELISA检测试剂盒

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乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP13的克隆

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传染病信息 2005年第4期18卷 177-179页

作者：宫嫚成军纪冬刘妍郭江张黎颖王建军张健李筠解放军第三○二医院病毒性肝炎研究室北京100039 北京市地坛医院传染病研究所北京100011

目的克隆乙型肝炎病毒(HBV)X 蛋白反式激活新型靶基因。方法以 HBV X 蛋白表达质粒 pcDNA3 1(-)-X转染 HepG2细胞,以空载体 pcDNA3.1(-)为平行对照,提取总 RNA 进行逆转录,对产物行基因表达谱芯片分析,确定新基因编码序列后,以逆转录多... 详细信息

目的克隆乙型肝炎病毒(HBV)X 蛋白反式激活新型靶基因。方法以 HBV X 蛋白表达质粒 pcDNA3 1(-)-X转染 HepG2细胞,以空载体 pcDNA3.1(-)为平行对照,提取总 RNA 进行逆转录,对产物行基因表达谱芯片分析,确定新基因编码序列后,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增新基因序列。结果获得新基因的全长序列,并测序证实,命名为 X 蛋白反式激活蛋白13(XTP13)。结论成功克隆 XTP13,为进一步阐明 HBxAg 在 HBV 感染中的分子生物学机制奠定基础。

关键词：乙型肝炎病毒 X抗原反式激活

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噬菌体展示技术筛选重组干扰素-β蛋白结合蛋白

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中西医结合肝病杂志 2005年第6期15卷 340-342页

作者：钟彦伟曲建慧成军戴久增吴顺华高学松郭江纪冬王琳中国人民解放军军医进修学院北京100039 中国人民解放军第302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室北京地坛医院传染病研究所

目的:利用噬菌体展示技术筛选重组干扰素β(IFNβ)肝细胞结合蛋白,探讨IFNβ抗病毒的分子生物学机制。方法:应用噬菌体展示技术,以重组的IFNβ蛋白包被酶联免疫板,作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”... 详细信息

目的:利用噬菌体展示技术筛选重组干扰素β(IFNβ)肝细胞结合蛋白,探讨IFNβ抗病毒的分子生物学机制。方法:应用噬菌体展示技术,以重组的IFNβ蛋白包被酶联免疫板,作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程。经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,最后对所筛选克隆进行DNA序列测定和生物信息学分析。结果:对肝细胞cDNA文库经过5轮的生物淘洗,从最后一轮筛选的顶层琼脂中随机挑选40个克隆,构建克隆载体,序列测定后经过同源性搜索和生物信息学分析,确定了和IFNβ蛋白具有结合作用的肝细胞蛋白。结论:筛选到与IFNβ蛋白具有结合作用的多种具有不同生理、生化功能的肝细胞蛋白。

关键词：噬菌体展示技术干扰素-β(IFN-β) 结合蛋白

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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B反式激活基因的克隆化研究

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肝脏 2005年第1期10卷 24-26页

作者：刘妍成军王建军白桂芹王志凌郭风劲纪冬崔玉芳北京解放军第三○二医院传染病研究所基因治疗研究中心全军病毒性肝炎防治研究重点实验室

目的　应用抑制性消减杂交 (suppressionsubtractivehybridization ,SSH)技术构建丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 4B(NS4B)转染细胞差异表达cDNA消减文库 ,克隆HCVNS4B蛋白反式激活相关基因。方法　以HCVNS4B表达质粒pcDNA3 .1( ) NS4B... 详细信息

目的　应用抑制性消减杂交 (suppressionsubtractivehybridization ,SSH)技术构建丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 4B(NS4B)转染细胞差异表达cDNA消减文库 ,克隆HCVNS4B蛋白反式激活相关基因。方法　以HCVNS4B表达质粒pcDNA3 .1( ) NS4B转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1( )为对照 ,制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,进行抑制性消减杂交分析。将富集的二次PCR产物与T A载体连接 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑取克隆聚合酶链反应 (PCR)扩增后进行测序及同源性分析。结果　文库扩增后得到 3 3个阳性克隆 ,经菌落PCR分析显示其中 2 8个克隆含有大小不等的 2 0 0～ 10 0 0bp插入片段。测序及同源性分析显示 ,12种已知基因编码蛋白 ,包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因 ,可能是NS4B反式激活靶基因。结论　成功构建了HCVNS4B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,为进一步阐明HCVNS4B反式调节的靶基因在肝炎。

关键词： NS4B 非结构蛋白反式激活基因克隆化研究丙型肝炎病毒(HCV) 聚合酶链反应(PCR) cDNA消减文库抑制性消减杂交分析反式激活相关基因 HepG2细胞反式激活靶基因分子生物学机制同源性分析基因编码蛋白蛋白编码基因

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病毒性肝炎临床免疫学特点和免疫细胞治疗

病毒性肝炎临床免疫学特点和免疫细胞治疗

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2005年北京地区肝病、感染学术年会

作者：王福生解放军第三○二医院全军传染病研究所全军艾滋病和病毒性肝炎重点实验室

本文介绍了实验室多年来从事HBV/HCV感染的免疫学特征研究,结合国内外以及我们自己在肝炎细胞免疫学方面进展进行了介绍。

关键词：病毒性肝炎免疫学免疫细胞

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抗HIV-1核心抗原p24单克隆抗体的制备及特性的初步鉴定

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细胞与分子免疫学杂志 2004年第6期20卷 699-701页

作者：侯俊胡燕朱雷沈宏辉杨健洋洪世雯貌盼勇解放军第302医院传染病研究所病毒研究室北京100039

目的 :建立分泌抗HIV 1p2 4单克隆抗体 (mAb)的杂交瘤细胞株 ,并对其特性进行初步鉴定。方法 :以纯化的基因工程制备的p2 4抗原免疫BALB/c小鼠 ,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2 /0骨髓瘤细胞融合 ,经HAT、HT选择培养及有限稀释法进行克隆化后 ... 详细信息

目的 :建立分泌抗HIV 1p2 4单克隆抗体 (mAb)的杂交瘤细胞株 ,并对其特性进行初步鉴定。方法 :以纯化的基因工程制备的p2 4抗原免疫BALB/c小鼠 ,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2 /0骨髓瘤细胞融合 ,经HAT、HT选择培养及有限稀释法进行克隆化后 ,用间接ELISA法及Dotblot对其进行筛选和特性鉴定。结果 :筛选到 2株可分泌抗HIV 1p2 4mAb的杂交瘤细胞 ,其腹水效价为 1×10 -5,亲和力为 1.7× 10 4～ 1.8×10 4mol/L ,mAb的Ig亚类均为IgG1。两株mAb与HBcAg、HCVRNA阳性血清及HIVgp4 1等均无交叉反应 ,只与HIV 1p2 4抗原阳性血清产生特异反应。结论 :成功地建立了 2株可分泌抗HIV 1p2 4mAb的杂交瘤细胞 ,为进一步研制HIV 1p2

关键词： HIV-1 p24抗原单克隆抗体杂交瘤

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乙型肝炎病毒e抗原基因作为酵母双杂交体系结合域载体的构建及表达

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中华实验和临床病毒学杂志 2004年第2期18卷 158-161页

作者：李伯安戚扬舒翠利刘岩陈昊李靖高蓉侯俊程云解放军第三○二医院传染病研究所免疫研究室北京100039

目的　以乙型肝炎病毒e抗原 (HBeAg)全基因为外源片段 ,构建酵母双杂交体系中结合域载体 ,研究其在酵母细胞中的表达 ,排除自身激活作用及毒性作用 ,验证其适用性。方法　根据报道序列设计、合成HBeAg全基因巢式引物 ,取患者血清 ,通过... 详细信息

目的　以乙型肝炎病毒e抗原 (HBeAg)全基因为外源片段 ,构建酵母双杂交体系中结合域载体 ,研究其在酵母细胞中的表达 ,排除自身激活作用及毒性作用 ,验证其适用性。方法　根据报道序列设计、合成HBeAg全基因巢式引物 ,取患者血清 ,通过PCR方法分离HBeAg全基因片段 ,克隆入T载体 ,酶切鉴定及序列测定后 ,克隆入酵母双杂交体系结合域载体pGBKT7,构建pGBKT7 eAg载体。再次酶切鉴定阳性克隆后转入酵母 ,验证毒性作用 ;通过Western blot实验证实外源基因在酵母中的表达 ;并进一步验证自身激活作用。结果　由血清中分离的及 2次酶切鉴定的片段大小分别为 6 5 7bp和 6 39bp ,与预期大小一致 ;序列测定与报道的HBV分离株核酸及氨基酸同源性分别为96 %和 10 0 % ;转人酵母后无毒性及自身激活作用 ;Western blot实验出现阳性与预期大小 (2 4 .3× 10 3)一致的条带。结论　pGBKT7 eAg载体在酵母细胞中表达出融合蛋白 ,进一步验证无自身激活及毒性作用 ,此载体构建成功 ,适用于酵母双杂交体系。

关键词：乙型肝炎病毒e抗原基因表达酵母双杂交体系结合域载体

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HBcAg核酸疫苗与白细胞介素表达质粒联合接种小鼠的免疫应答观察

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中华传染病杂志 2004年第5期22卷 310-313页

作者：黄祖瑚吴欣成军邢益平董菁李军卢山南京医科大学第一附属医院感染病科 210029 解放军第三O二医院传染病研究所基因治疗研究中心美国马萨诸塞大学医学中心基因免疫研究室

目的观察HBcAg核酸疫苗与鼠白细胞介素12(IL12)和白细胞介素18(IL18)表达质粒联合免疫小鼠所诱导的特异性免疫应答。方法小鼠随机分为载体质粒组、HBcAg核酸疫苗组(核酸疫苗组)、HBcAg核酸疫苗+IL12组(C+IL12组)、HBcAg核酸疫苗+IL18组(... 详细信息

目的观察HBcAg核酸疫苗与鼠白细胞介素12(IL12)和白细胞介素18(IL18)表达质粒联合免疫小鼠所诱导的特异性免疫应答。方法小鼠随机分为载体质粒组、HBcAg核酸疫苗组(核酸疫苗组)、HBcAg核酸疫苗+IL12组(C+IL12组)、HBcAg核酸疫苗+IL18组(C+IL18组)和HBcAg核酸疫苗+IL12/IL18组(C+IL12/IL18组)。载体质粒、HBcAg核酸疫苗、IL12及IL18表达质粒经肌内注射法免疫各组小鼠。采用酶联免疫吸附试验检测小鼠血清HBcAg特异性抗体、IgG亚类(IgG1,IgG2a)以及小鼠脾淋巴细胞培养上清液干扰素(IFN)γ含量。采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测免疫小鼠特异杀伤性T淋巴细胞(CTL)活性。结果除对照质粒组外,核酸疫苗免疫的各组小鼠均能检出血清抗HBc,C+IL12组、C+IL18组和C+IL12/IL18组的抗HBc终点滴度与C组相比均明显增高(P<0.05)。各组小鼠抗HBcIgG亚类均以IgG2a占优。核酸疫苗免疫组除C+IL12+IL18组外,小鼠脾细胞培养上清液IFNγ水平均显著高于对照质粒组(P<0.01)。C+IL18组和C+IL12/IL18组小鼠脾细胞HBcAg特异性CTL活性强于其他各组。结论IL12和(或)IL18表达质粒与HBcAg核酸疫苗联合免疫,具有增强HBcAg核酸疫苗所激发的免疫应答特别是细胞免疫应答的作用。

关键词： HBcAg核酸疫苗白细胞介素表达质粒接种小鼠免疫应答白细胞介素12 白细胞介素18

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应用噬菌体展示技术筛选HBsAg启动子I的DNA结合蛋白

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世界华人消化杂志 2004年第11期12卷 2737-2739页

作者：杨艳杰成军陈东风王春花黄燕萍吴煜刘敏王建军钟彦伟刘妍张黎颖中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京市100038 中国人民解放军第三军医大学大坪医院消化内科重庆市400038

目的:通过筛选HBsAg基因启动子Ⅰ(SP Ⅰ,surface promoter Ⅰ)结合蛋白,为HBV复制机制的研究探索新的途径. 方法:应用噬菌体展示技术,以HBsAg基因启动子Ⅰ的聚合酶链反应(PCR)产物DNA作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮... 详细信息

目的:通过筛选HBsAg基因启动子Ⅰ(SP Ⅰ,surface promoter Ⅰ)结合蛋白,为HBV复制机制的研究探索新的途径. 方法:应用噬菌体展示技术,以HBsAg基因启动子Ⅰ的聚合酶链反应(PCR)产物DNA作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“黏附-洗脱-扩增”筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索. 结果:噬菌体经富集后,从随机筛选的14个克隆中得到8 个阳性克隆,成功构建了克隆载体.序列测定后经过同源性搜索,确定了和HBV表面抗原基因启动子Ⅰ特异结合的肝细胞蛋白,共编码7种蛋白.其中3个克隆编码未知功能蛋白;其余的克隆分别编码4-氨基丁酸氨基转移酶、触珠蛋白、复制蛋白等蛋白. 结论:用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HBsAg基因启动子Ⅰ的结合蛋白,分析了该蛋白的编码基因.

关键词：噬菌体展示技术筛选 HBsAg 启动子I DNA结合蛋白聚合酶链反应乙型肝炎病毒

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乙型肝炎病毒基因分型的临床意义

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世界华人消化杂志 2004年第7期12卷 1670-1673页

作者：杨艳杰成军陈东风吴煜黄燕萍钟彦伟王春花刘敏中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗中心全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京市100039 中国人民解放军第三军医大学大坪医院消化内科重庆市400038

虽然近年来对乙型肝炎病毒(HBV)基因组变异已边行了较为系统的研究,但仍有许多问题尚未解决.目前研究的热点集中在HBV基因型的特点及临床意义和HBV聚合酶基因变异与核苷类似物耐药性的研究.根据聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-R... 详细信息

虽然近年来对乙型肝炎病毒(HBV)基因组变异已边行了较为系统的研究,但仍有许多问题尚未解决.目前研究的热点集中在HBV基因型的特点及临床意义和HBV聚合酶基因变异与核苷类似物耐药性的研究.根据聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)基因型分型法,目前已将前-S基因分为A,B,C,D,E,F,G,H八种基因型.现就HBV基因型分型方法,基因型与肝炎疾病的关系、预后以及与干扰素、拉米夫定等抗病毒疗效相关性的研究作一综述.

关键词：乙型肝炎病毒基因分型聚合酶链反应 PCR-RFLP

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