检索结果-内蒙古大学图书馆

解放军医学杂志 2010年第6期35卷 629-631,634页

作者：李晓东李庆虹李进周渝霞郝玉清戴久增李乐姚增涛张玲霞徐东平军事医学科学院北京100850 解放军302医院全军传染病研究所病毒性肝炎研究室

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)基因亚型在中国华北地区的分布情况及其对核苷(酸)类药物基因型耐药突变发生率的影响。方法提取2377例慢性乙肝(1942例)和乙肝相关肝硬化(435例)患者血清HBVDNA,采用巢式PCR扩增反转录酶(RT)基因区,对PCR产物... 详细信息

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)基因亚型在中国华北地区的分布情况及其对核苷(酸)类药物基因型耐药突变发生率的影响。方法提取2377例慢性乙肝(1942例)和乙肝相关肝硬化(435例)患者血清HBVDNA,采用巢式PCR扩增反转录酶(RT)基因区,对PCR产物直接测序,根据所测RT/S基因序列构建系统进化树确定HBV基因亚型,检测RT区耐药突变,将数据录入HBVdb数据库进行分析。结果感染HBV各基因亚型的例数为B1型10例(0.4%),B2型344例(14.5%),B3型6例(0.3%),B4型8例(0.3%),C1型28例(1.2%),C2型1937例(81.4%),C3型21例(0.9%),C4型6例(0.3%),D型17例(0.7%)。B2和C2亚型患者之间在性别、HBVDNA载量、总胆红素、丙氨酸氨基转移酶/天冬氨酸氨基转移酶(ALT/AST)水平、胆碱酯酶、凝血酶原活动度方面差异无统计学意义(P>0.05);慢性乙肝患者中,C2亚型病毒感染的拉米夫定耐药突变V173L、L180M、M204I和阿德福韦酯耐药突变A181V检出率显著高于B2亚型病毒感染(P<0.05);乙肝相关肝硬化患者中,B2亚型病毒感染的阿德福韦酯耐药突变N236T检出率显著高于C2亚型病毒感染(P=0.014)。结论我国华北地区流行的HBV以C型和B型为主,其中C2和B2为主要亚型,HBV基因亚型可能会影响临床核苷(酸)类药物的耐药突变发生率。

关键词：肝炎病毒,乙型基因亚型抗药性,病毒突变

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1.1倍长乙型肝炎病毒基因组在Huh7细胞中的高效复制和表达

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解放军医学杂志 2010年第6期35卷 635-638页

作者：蒋林彬施建飞刘妍刘文思兰兰钟彦伟徐东平桂林医学院生物技术学院广西桂林541004 解放军302医院全军传染病研究所病毒性肝炎研究室

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)1.1倍基因组长度的重组载体,研究其在人肝癌细胞系Huh7中的复制与表达。方法以慢性乙型肝炎患者C基因型HBV DNA为模板,用聚合酶链反应(PCR)扩增出HBV基因组的两条DNA片段,酶切后与载体连接成含HBV1.1倍基因组... 详细信息

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)1.1倍基因组长度的重组载体,研究其在人肝癌细胞系Huh7中的复制与表达。方法以慢性乙型肝炎患者C基因型HBV DNA为模板,用聚合酶链反应(PCR)扩增出HBV基因组的两条DNA片段,酶切后与载体连接成含HBV1.1倍基因组长度的重组载体。经PCR、酶切及测序鉴定后,将重组载体经FuGENEHD转染入Huh7细胞,用ELISA检测转染细胞培养上清液的HBsAg和HBeAg表达,用荧光定量PCR和Southern杂交检测HBV DNA的复制水平及复制中间体。结果经鉴定证实成功构建1.1倍基因组长度C基因型HBV重组载体,体外转染Huh7细胞48h后,培养上清液中检出HBsAg和HBeAg表达;转染72h后,荧光定量PCR检出较高的HBV DNA复制水平(107～109拷贝/ml);Southern杂交检出病毒复制中间体。结论构建的1.1倍长重组载体可以介导高水平的HBV病毒复制和基因表达,为进一步体外瞬时转染HBV表型耐药分析奠定基础。

关键词：肝炎病毒,乙型基因组病毒复制基因表达

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G1764A/C1766T/T1768A三联突变对HBV核心启动子活性的上调作用研究

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解放军医学杂志 2010年第8期35卷 954-957页

作者：王耀刘妍许智慧纪冬李晓东钟彦伟徐东平内蒙古农业大学生命科学学院呼和浩特010018 解放军302医院全军传染病研究所病毒性肝炎研究室北京100039

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(CP)荧光素酶表达载体,探讨HBVCP变异对下游基因转录活性的影响。方法 2005年5月至2008年3月于解放军302医院就诊的慢性乙型肝炎(CHB)及慢加急性肝衰竭(ACLF)患者各40例,采集血清提取HBV DNA,采用巢... 详细信息

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(CP)荧光素酶表达载体,探讨HBVCP变异对下游基因转录活性的影响。方法 2005年5月至2008年3月于解放军302医院就诊的慢性乙型肝炎(CHB)及慢加急性肝衰竭(ACLF)患者各40例,采集血清提取HBV DNA,采用巢式PCR法扩增HBVCP片段,克隆至pGEM-TEasy载体。挑选含有CP相关变异位点的质粒,经KpnⅠ/BglⅡ双酶切后,构建pGL3-CP荧光素酶真核报告质粒,并采用定点突变方法获得野生型质粒,将两者同时转染肝癌细胞系HepG2,48h后进行荧光素酶检测。结果患者临床资料经统计分析后显示,CHB患者HBeAg阳性率和HBV DNA载量均高于ACLF患者(P<0.01),而TBIL含量则低于ACLF患者(P<0.01);对CP区热点突变频率分析后发现:G1764A/C1766T/T1768A三联突变在CHB患者中为0.0%(0/40),在ACLF患者中为12.5%(5/40,P<0.05)。细胞转染结果显示:典型CP双联突变A1762T/G1764A病毒株的启动子活性为相应野生株的1.67倍,而G1764A/C1766T/T1768A三联突变病毒株的启动子活性为相应野生株的1.43～1.80倍。结论 HBeAg阳性率、TBIL水平、HBV DNA载量与乙型肝炎重症化相关,HBVCP中存在的A1762T/G1764A、G1764A/C1766T/T1768A突变有顺式激活下游基因转录活性的作用。

关键词：肝炎,乙型,慢性突变启动区反式激活

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HBV表型耐药方法的建立及临床分离株的表型耐药分析

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解放军医学杂志 2010年第6期35卷 632-634页

作者：刘禄郝瀚刘永明苏何玲蒋林彬纪冬刘文思兰兰徐东平钟彦伟桂林医学院生物技术学院桂林541004 解放军302医院全军传染病研究所病毒性肝炎研究室吉林大学生命科学学院长春130012

目的建立HBV表型耐药分析方法 ,体外培养慢性乙型肝炎患者血清HBV分离株并系统分析其对拉米夫定(LAM)的敏感性。方法从1例LAM耐药慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV DNA,PCR扩增RT基因,克隆到pGEM-Teasy载体中,随机挑选10个克隆进行DNA序... 详细信息

目的建立HBV表型耐药分析方法 ,体外培养慢性乙型肝炎患者血清HBV分离株并系统分析其对拉米夫定(LAM)的敏感性。方法从1例LAM耐药慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV DNA,PCR扩增RT基因,克隆到pGEM-Teasy载体中,随机挑选10个克隆进行DNA序列测定,并分析RT区LAM耐药相关的突变位点。用XhoI和NcoI双酶切pGEM-Teasy-RT及pTriEx-HBV(C),构建1.1倍HBV野生株和LAM耐药突变株的重组载体pTriEx-wRT和pTriEx-mRT,转染人肝癌细胞系HepG2细胞。转染60h后加入不同浓度(0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L)的LAM,药物连续作用5d后,抽提病毒核心颗粒HBV DNA,通过实时荧光PCR及Southern blotting检测不同药物浓度作用下HBV DNA的复制水平。结果成功建立体外HBV表型耐药分析方法。野生未突变株重组载体pTriEx-wRT转染HepG2细胞后,随着LAM浓度的升高,HBV DNA水平明显下降,而突变株重组载体pTriEx-mRT转染HepG2细胞后,HBV DNA水平无明显下降,IC50值与野生株相比增加了2500倍。结论建立的HBV表型耐药分析方法对监测HBV耐药性具有可行性。

关键词：肝炎,乙型,慢性拉米夫定药物耐受性突变

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一种高效扩增人T细胞受体α链可变区基因方法的建立

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解放军医学杂志 2009年第2期34卷 139-142页

作者：王琳叶海燕李晓东刘妍范振平张玲霞徐东平解放军第302医院全军传染病研究所病毒性肝炎研究室北京100039

目的建立一种高效扩增人T细胞受体(TCR)α链可变区(Vα)基因的方法。方法根据TCR Vα32个亚家族的基因序列特点,设计扩增Vα基因的上游内、外引物各42条,并将上游内、外引物各分为5组简并引物。在恒定区(C区)设计下游内、外引物,测序引... 详细信息

目的建立一种高效扩增人T细胞受体(TCR)α链可变区(Vα)基因的方法。方法根据TCR Vα32个亚家族的基因序列特点,设计扩增Vα基因的上游内、外引物各42条,并将上游内、外引物各分为5组简并引物。在恒定区(C区)设计下游内、外引物,测序引物以及扩增Cα基因的上游引物各1条。提取细胞RNA,用PolyA介导反转录后,采用巢式PCR扩增正常人外周血单个核细胞(PBMC)中CD8 T细胞TCR Vα的32个亚家族基因,以Jurkat T淋巴瘤细胞作为对照。用T-easy载体克隆RT-PCR产物,对克隆基因进行测序分析。结果从正常人CD8 T细胞中扩增到了所有TCR Vα亚家族基因,以10个Jurkat细胞所提取的RNA作为模板即可获得成功扩增。TCR Vα同一亚家族基因的同源性均大于75%,序列差异主要在CDR3高变区。结论建立了一种高效灵敏的TCR Vα编码基因扩增方法,为抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的TCR克隆和功能研究打下了良好基础。

关键词： T淋巴细胞受体,抗原,T细胞克隆,分子

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乙型肝炎病毒的病毒学特点及其临床意义

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解放军医学杂志 2009年第6期34卷 655-658页

作者：徐东平解放军第302医院全军传染病研究所病毒性肝炎研究室北京100039

乙型肝炎病毒(HBV)为嗜肝双链DNA病毒,病毒基因组特点如下:①病毒的多聚酶/反转录酶(RT)缺乏校对功能,使HBV较其他DNA病毒更易产生变异;②病毒基因组开放读码框架重叠,1个基因位点上的突变有可能同时引起2种病毒蛋白突变;③生命周期中... 详细信息

乙型肝炎病毒(HBV)为嗜肝双链DNA病毒,病毒基因组特点如下:①病毒的多聚酶/反转录酶(RT)缺乏校对功能,使HBV较其他DNA病毒更易产生变异;②病毒基因组开放读码框架重叠,1个基因位点上的突变有可能同时引起2种病毒蛋白突变;③生命周期中存在稳定的共价闭合环状DNA(cccDNA);④可以整合到宿主细胞染色体DNA中;⑤病毒蛋白对某些宿主细胞基因表达具有反式调节作用。HBV的这些病毒学特点与乙型肝炎的慢性化和疾病进展密切相关。多位点检测HBVRT基因耐药突变对临床监测病毒耐药、合理进行抗病毒治疗十分重要,分析病毒基因组变异和检测cccDNA对深入了解HBV致病机制与疗效评价有积极意义。技术方法的创新与改进是进行HBV临床病毒学特点研究的基础。

关键词：肝炎病毒,乙型突变抗药性,病毒抗病毒药

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慢性乙型肝炎患者血清HBV全长序列分析及复制力评价

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解放军医学杂志 2009年第6期34卷 670-674页

作者：纪冬刘妍王耀苏何玲思兰兰钟彦伟徐东平解放军第302医院全军传染病研究所病毒性肝炎研究室北京100039

目的分析乙型肝炎患者HBV全长基因组序列并对其复制力进行评价。方法从慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV病毒DNA,PCR扩增HBV全长基因组,克隆到pGEM-Teasy载体中,每个样品挑选5～10个克隆测序,分析基因型以及全长基因组耐药相关的突变位点... 详细信息

目的分析乙型肝炎患者HBV全长基因组序列并对其复制力进行评价。方法从慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV病毒DNA,PCR扩增HBV全长基因组,克隆到pGEM-Teasy载体中,每个样品挑选5～10个克隆测序,分析基因型以及全长基因组耐药相关的突变位点,并对个别位点进行定点突变。将克隆到pGEM-Teasy载体中的全长HBV基因组经BspQI/ScaI双酶切后,转染入肝癌细胞系HepG2、Huh7。转染3d后检测上清HBsAg表达量及细胞内HBV复制中间体核心颗粒DNA载量,分析全长HBV基因组的复制力(1.0倍HBV复制模型)。结果从2份慢性乙型肝炎患者血清中成功获得5条HBV全长克隆,来自同一份血清的克隆核苷酸,其一致性为98%～100%,提示HBV存在准种特性。测序结果表明5条HBV全长基因均为C型。通过定点突变又获得3个全长克隆。经序列分析发现,HBV反转录酶区存在A181V/S、L229M、V84M、M204I氨基酸位点的突变,前C/C区存在T1753C、A1762T、G1764A和G1896A核苷酸位点的突变。复制力分析提示上述位点突变后病毒复制力均有不同程度下降,L229M还可以进一步降低A181V突变株的复制力。结论自行建立的无载体1.0倍HBV复制模型可在细胞内分泌抗原蛋白以及装配子代病毒,完成生活周期,这为下一步分析HBV的耐药表型打下了基础。此外,还可指导临床制定更加合理的抗病毒策略,筛选针对已出现或将来可能出现的耐药突变的新型抗病毒药物。

关键词：肝炎,乙型,慢性序列分析,DNA DNA复制

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HBV前S2蛋白对胰岛素受体基因下调作用的研究

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解放军医学杂志 2009年第6期34卷 679-682页

作者：苏何玲纪冬韩萍刘妍张健陈国凤钟彦伟徐东平解放军第302医院全军传染病研究所病毒性肝炎研究室北京100039 解放军第302医院全军传染病研究所感染7科北京100039

目的探讨乙型肝炎病毒前S2蛋白(pre-S2)对胰岛素受体(INSR)基因的转录调节作用。方法以pGEM-Teasy-65-2质粒为模板,扩增乙型肝炎病毒(HBV)pre-S2基因片段,构建真核表达载体pcDNA3.1-preS2,以不同剂量(1.0、1.5、2.0μg)转染肝癌细胞系He... 详细信息

目的探讨乙型肝炎病毒前S2蛋白(pre-S2)对胰岛素受体(INSR)基因的转录调节作用。方法以pGEM-Teasy-65-2质粒为模板,扩增乙型肝炎病毒(HBV)pre-S2基因片段,构建真核表达载体pcDNA3.1-preS2,以不同剂量(1.0、1.5、2.0μg)转染肝癌细胞系HepG2和Huh7,36h及72h后分别提取转染后细胞总RNA,利用实时荧光定量PCR检测细胞内的INSR mRNA水平,观察HBV的pre-S2蛋白对INSR基因的转录调节作用,同时观察阻断pre-S2蛋白后INSR的表达情况。结果转染不同剂量pcDNA3.1-preS2后,HepG2细胞内INSR基因的表达水平分别为对照的61%、20%、11%(转染后36h)和92%、69%、37%(转染后72h),Huh7细胞内INSR基因的表达水平分别为对照的63%、47%、35%(转染后36h)和83%、73%、34%(转染后72h);细胞INSR mRNA水平随真核表达载体pcDNA3.1-preS2转染剂量的增加而降低。在转染2μgpcDNA3.1-preS2的同时,将抗pre-S2单克隆抗体加入培养上清,可部分阻断pre-S2蛋白对INSRmRNA表达的抑制,HepG2细胞中的INSRmRNA水平分别恢复到转染空质粒对照的65%(转染后36h)和81%(转染后72h),Huh7细胞中的INSRmRNA水平则分别恢复到69%(转染后36h)和96%(转染后72h)。结论HBVpre-S2蛋白对肝癌细胞系HepG2和Huh7细胞的INSR基因有明显下调作用,抗pre-S2抗体能部分阻断这种下调作用,此机制可以在分子水平部分解释肝源性糖尿病的发生。

关键词：肝炎病毒,乙型前S2蛋白受体,胰岛素基因调节

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滚环扩增在乙型肝炎病毒cccDNA检测中的应用

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解放军医学杂志 2009年第6期34卷 675-678页

作者：任晓强苏何玲邹正升高峰刘立明刘妍李保森徐东平钟彦伟内蒙古农业大学生物工程学院呼和浩特010018 解放军第302医院全军传染病研究所病毒性肝炎研究室解放军第302医院全军传染病研究所感染4科

目的建立慢性乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)的滚环扩增(RCA)方法。方法以27例慢性乙型肝炎患者的肝组织cccDNA和血清松弛环状DNA(rcDNA)为研究对象。根据中国患者HBV基因序列特点设计4对引物,分别可与HBVcccDNA的正、负链... 详细信息

目的建立慢性乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)的滚环扩增(RCA)方法。方法以27例慢性乙型肝炎患者的肝组织cccDNA和血清松弛环状DNA(rcDNA)为研究对象。根据中国患者HBV基因序列特点设计4对引物,分别可与HBVcccDNA的正、负链结合。在Phi29DNA聚合酶的作用下,获得线性多拷贝cccDNA扩增产物,以该产物为模板获得cccDNA全序列;通过对模板的系列稀释鉴定RCA方法的灵敏度;以RCA产物为模板扩增肝组织cccDNA的反转录酶区基因,并与同时扩增的同时间采集的同一患者血清中的rcDNA序列进行比较。结果成功建立了HBVcccDNA全序列的RCA方法,最低可检测到10个拷贝的cccDNA分子,并获得了所有扩增cccDNA的全基因序列。27例患者中,18例患者的肝组织cccDNA和血清rcDNA反转录酶区的序列完全一致,9例患者中共检出84个不同的核苷酸位点,平均每个患者9.3个,84个不同核苷酸中只有5个引起了氨基酸的改变。结论滚环扩增方法对肝组织HBVcccDNA的检测具有较好的灵敏度。该方法的建立对深入了解cccDNA在HBV致病机制中的作用以及评价抗病毒疗效有重要意义。

关键词：肝炎病毒,乙型滚环扩增共价闭合环状DNA

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乙型肝炎患者HBV前S/S蛋白特异性CTL表位变异分析

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解放军医学杂志 2009年第6期34卷 666-669页

作者：许智慧任晓强刘妍王耀李晓东戴久增李乐姚增涛钟彦伟徐东平内蒙古农业大学生物工程学院呼和浩特010018 解放军第302医院全军传染病研究所病毒性肝炎研究室

目的比较慢性重型乙型肝炎(CSHB)与慢性乙型肝炎(CHB)患者HBV前S/S蛋白特异性细胞毒性T细胞(CTL)表位变异的差异,探讨乙型肝炎重症化和慢性化的机制。方法对262例乙型肝炎患者的血清样本进行HLA-A2分型;用巢式PCR扩增血清HBV前S/S基因并... 详细信息

目的比较慢性重型乙型肝炎(CSHB)与慢性乙型肝炎(CHB)患者HBV前S/S蛋白特异性细胞毒性T细胞(CTL)表位变异的差异,探讨乙型肝炎重症化和慢性化的机制。方法对262例乙型肝炎患者的血清样本进行HLA-A2分型;用巢式PCR扩增血清HBV前S/S基因并对PCR产物进行序列测定;根据HBV前S/S基因序列,用VirusBlast软件鉴定患者感染的HBV基因型;用VectorNTI软件对目前已知的13个HLA-A2限制性前S/S蛋白特异性CTL表位进行序列分析。结果123例(46.9%)患者HLA-A2阳性,其中CSHB71例,CHB52例。CTL表位变异分析结果如下:(1)两组间所有患者进行比较,患者S177-185和S338-347表位变异发生率有显著差异(P<0.05);(2)两组间HBVB基因型患者进行比较,患者S131-139、S183-191和S204-212表位变异发生率有极显著差异(P<0.01);(3)两组间HBVC基因型患者进行比较,CSHB组患者的S131-139表位较CHB组患者有增高(P=0.05)。结论某些HBV前S/S蛋白特异性CTL表位在CSHB与CHB患者间变异有明显差异,受病毒基因型影响,CTL表位变异可能与乙型肝炎的重症化和慢性化机制相关。

关键词：肝炎病毒,乙型表位,T淋巴细胞前S/S蛋白

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