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中华实验和临床病毒学杂志 2006年第3期20卷 270-272页

作者：刘妍白桂芹成军杨倩张黎颖纪冬王建军解放军第三○二医院传染病研究所病毒性肝炎研究室-全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京100039 北京地坛医院传染病研究所

目的应用抑制性消减杂交（SSH）技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白4A（HCV NS4A）转染细胞差异表达cDNA消减文库，克隆HCV NS4A蛋白反式激活相关基因。方法以HCV NS4A表达质粒pcDNA3．1（-）-NS4A转染Hep G2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）... 详细信息

目的应用抑制性消减杂交（SSH）技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白4A（HCV NS4A）转染细胞差异表达cDNA消减文库，克隆HCV NS4A蛋白反式激活相关基因。方法以HCV NS4A表达质粒pcDNA3．1（-）-NS4A转染Hep G2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，进行SSH分析。将富集的二次PCR产物与TIA载体连接，并转染大肠埃希菌进行文库扩增，随机挑取克隆，聚合酶链反应（PCR）扩增后进行测序及同源性分析。结果文库扩增后得到36个阳性克隆，经菌落PCR分析显示200～1000bp插入片段。对其中的25个片段测序，并进行同源性分析，显示18种已知基因编码蛋白和2种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS4A反式激活靶基因。结论成功构建了HCV NS4A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，为进一步阐明HCV NS4A反式调节的靶基因等提供了相关的平台。

关键词：肝炎病毒病毒非结构蛋白质类反式激活(遗传学) 抑制,遗传杂交

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SSH技术筛选β干扰素真核表达载体转染细胞的下调基因

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中国病毒学 2006年第1期21卷 21-23页

作者：钟彦伟成军曲建慧张黎颖郭江李晓东解放军第302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室北京100039 北京地坛医院传染病研究所北京100011

筛选β-干扰素质粒转染下调相关基因。以β-干扰素表达质粒pcDNA3.1(-)-IFNβ转染HepG2细胞,同时以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并合成cDNA,经RsaI酶切后将来自pcDNA3.1(-)转染的cDNA分成两组,分别与... 详细信息

筛选β-干扰素质粒转染下调相关基因。以β-干扰素表达质粒pcDNA3.1(-)-IFNβ转染HepG2细胞,同时以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并合成cDNA,经RsaI酶切后将来自pcDNA3.1(-)转染的cDNA分成两组,分别与两种不同的接头adaptor1和adaptor2衔接,再与来自pcDNA3.1(-)-IFNβ转染的cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。成功构建人β-干扰素质粒转染下调相关基因差异表达的cDNA。所获得的50个克隆中,随机挑选37个克隆均含有插入片段,将这些克隆进行序列测定,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得22种编码基因,其中3种为未知功能的基因。筛选到的cDNA序列,包括与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的一些蛋白编码基因。

关键词： β-干扰素下调抑制性消减杂交技术(SSH)

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中国人群流行的乙型肝炎病毒特异性CTL表位特点分析

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解放军医学杂志 2006年第8期31卷 775-777页

作者：李晓东徐东平成军钟彦伟刘妍董菁王琳张玲霞解放军第302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室北京100039 北京地坛医院传染病研究所

目的研究中国人群中流行的乙型肝炎病毒(HBV)基因型B型和C型特异性CTL表位的序列特点。方法以国外文献报道的13个HBV的CTL表位氨基酸序列为参考序列,分析其与GenBank下载的45条及作者从乙型肝炎病人血清中扩增的另外5条B型或C型CTL表位... 详细信息

目的研究中国人群中流行的乙型肝炎病毒(HBV)基因型B型和C型特异性CTL表位的序列特点。方法以国外文献报道的13个HBV的CTL表位氨基酸序列为参考序列,分析其与GenBank下载的45条及作者从乙型肝炎病人血清中扩增的另外5条B型或C型CTL表位氨基酸序列的差别。结果与参考序列相比,本研究分析的B型和C型HBV特异性CTL表位氨基酸序列变异发生频率较高。在本研究分析的13个表位中,变异发生率超过70%的表位在B型HBV有4个,分别是表位FLLTRILTI(A0201,S183-191)、VLQAGFFLL(A0201,S188-196)、ILSPFLPLL(A0201,S382-390)和FLPSDFFPSV(A0201,C18-27),C型HBV有2个,分别是表位ILSPFLPLL(A0201,S382-390)和FLPSDFFPSV(A0201,C18-27)。其中文献中研究最多的HBcAg表位18-27(FLPSDFFPSV),在我国流行的B型和C型HBV中表位的变异率分别高达71%和97%。结论中国人群流行的B型和C型HBV特异性CTL表位与国外文献报道的CTL表位相比在大多数位点上都出现变异,并且不同表位的变异率差异很大,在检测CTL数量和功能时应根据这一特点设计实验。

关键词：肝炎,乙型 T淋巴细胞,细胞毒性表位,T淋巴细胞

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抑制性消减杂交技术筛选干扰素α转染HepG2细胞中上调的表达基因

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中国新药与临床杂志 2006年第1期25卷 21-25页

作者：曲建慧成军张黎影徐东平钟彦伟刘妍王琳戴久增张玲霞中国人民解放军第302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室北京100039 北京地坛医院传染病研究所北京100011 中国人民解放军第302医院专家组北京100039

目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术筛选干扰素α(IFN-α) 真核表达质粒转染HepG2细胞后差异表达上调的基因。方法:首先构建IFN-α真核表达载体pcDNA3．1(-) -IFN-α,并转染HepG2细胞,以空载体pcD... 详细信息

目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术筛选干扰素α(IFN-α) 真核表达质粒转染HepG2细胞后差异表达上调的基因。方法:首先构建IFN-α真核表达载体pcDNA3．1(-) -IFN-α,并转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)转染的HepG2细胞为对照;制备转染后的细胞裂解液, 提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增鉴定,进行测序及同源性分析。结果:构建了pcDNA3．1(-)-IFN-α真核表达质粒,并成功构建了该质粒转染HepG2细胞后差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到200个白色克隆,随机挑取70个进行菌落PCR分析,结果显示均含有插入片段,将含有200-1000 bp插入片段的35个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得17种已知基因序列和1个染色体序列。结论:应用SSH技术成功构建了pcDNA3．1(-)-IFN-α转染的HepG2细胞中差异上调表达基因的cDNA消减文库。该文库的建立为进一步阐明IFN-α作用的分子生物学机制提供了重要的理论依据。

关键词：干扰素α 杂交基因文库蒂选

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基因芯片技术筛选干扰素β刺激HepG2细胞后的差异表达基因

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中国新药与临床杂志 2006年第1期25卷 17-20页

作者：钟彦伟成军曲建慧李晓东郭江戴久增中国人民解放军军医进修学院北京100853 北京地坛医院传染病研究所北京100011 中国人民解放军第302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室北京100039

目的:应用基因芯片技术阐明重组干扰素β(IFN-β)作用HepG2细胞后,对HepG2细胞基因表达谱的影响。方法:以2×10~6U·L^(-1)浓度的重组IFN-β刺激对数生长期的HepC2细胞系,以生理盐水处理的 HepG2细胞为平行对照,制备转染后的细... 详细信息

目的:应用基因芯片技术阐明重组干扰素β(IFN-β)作用HepG2细胞后,对HepG2细胞基因表达谱的影响。方法:以2×10~6U·L^(-1)浓度的重组IFN-β刺激对数生长期的HepC2细胞系,以生理盐水处理的 HepG2细胞为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA。应用基因表达谱芯片技术对差异表达的 mRNA进行检测和分析。结果:HepG2细胞经重组IFN-β刺激之后,有80条差异基因表达,其中38条基因表达增强,42餐基因表达降低。这些差异表达基因与细胞的增生,分化和细胞的信号转导密切相关。结论:应用基因表达谱芯片技术筛选到重组IFN-β作用HepC2细胞后差异表达基因,为进一步了解IFN-β治疗病毒性肝炎的作用机制提供新的依据。

关键词：干扰素β 重组蛋白质类基因表达基因芯片

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酵母双杂交技术筛选干扰素β结合蛋白基因

酵母双杂交技术筛选干扰素β结合蛋白基因

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第五届全国肝脏疾病临床暨中华肝脏病杂志成立十周年学术会议

作者：钟彦伟郭风劲曲建慧纪冬程勇前李晓东戴久增王琳成军郭江解放军第302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室解放军第302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室解放军第302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室解放军第302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室解放军第302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室解放军第302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室解放军第302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室解放军第302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室北京地坛医院传染病研究所北京地坛医院传染病研究所

目的:应用酵母双杂交技术筛选重组干扰素β(IFN-β)结合蛋白基因,探索IFN-β抗病毒作用的分子机制。方法:用多聚酶链反应(PCR)技术扩增IFN-β基因,与酵母表达载体pGBKT7连接构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109,然后与含人肝细胞cDNA文库质... 详细信息

目的:应用酵母双杂交技术筛选重组干扰素β(IFN-β)结合蛋白基因,探索IFN-β抗病毒作用的分子机制。方法:用多聚酶链反应(PCR)技术扩增IFN-β基因,与酵母表达载体pGBKT7连接构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109,然后与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基(SD／ -Trp-Leu-His-Ade)和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落。提取酵母质粒后转化大肠杆菌(DH5 α)并经氨苄青霉素抗性筛选;提取单克隆菌落质粒,酶切鉴定,序列测定后进行生物信息学分析

关键词：酵母双杂交技术干扰素β 结合蛋白

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乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白结合蛋白的筛选

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世界华人消化杂志 2006年第24期14卷 2382-2385页

作者：田江克成军刘妍崔玉芳纪冬王琳程勇前钟彦伟徐东平解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所免疫学研究室北京市100850 北京地坛医院传染病研究所北京市100011 解放军第302医院传染病研究所病毒性肝炎研究中心北京市100039

目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞与乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白(MHBst)结合蛋白．方法:PCR扩增MHBst基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达．后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进... 详细信息

目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞与乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白(MHBst)结合蛋白．方法:PCR扩增MHBst基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达．后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基(SD／-Trp-Leu-His-Ade)和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落增菌后提出质粒转化入大肠杆菌(DH5α),并经氨苄青霉素抗性筛选,提取单克隆菌落质粒,酶切鉴定,序列测定后进行生物信息学分析．结果:应用酵母双杂交技术筛选出阳性克隆8个,经生物信息学分析,排除读码框架不正确者,最后得到7种已知基因,分别为ADP核糖基因子2种,RAB6相互作用蛋白(RAB6IP1)1种,CCR4-NOT转录复合体亚基10(CCR4- NOT-10)1种,脂多糖蛋白结合蛋白(LBP)1种,醛缩酶B(ALDOB)1种,补体成分3(C3)1种,丙酮酸脱氢酶(PDH)1种．结论:成功克隆出MHBst结合蛋白．

关键词：酵母双杂交技术 MHBst 结合蛋白克隆

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乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP13的克隆化

乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP13的克隆化

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第五届全国肝脏疾病临床暨中华肝脏病杂志成立十周年学术会议

作者：宫嫚纪冬刘妍王建军张健李筠成军郭江张黎颖解放军第302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室解放军第302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室解放军第302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室解放军第302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室解放军第302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室解放军第302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室北京地坛医院传染病研究所北京地坛医院传染病研究所北京地坛医院传染病研究所

目的:应用基因表达谱芯片技术及生物信息学技术筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白反式激活新型靶基因,进一步阐明HBV感染相关性疾病的发病机制。方法:以HBV X蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-X转染 HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照... 详细信息

目的:应用基因表达谱芯片技术及生物信息学技术筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白反式激活新型靶基因,进一步阐明HBV感染相关性疾病的发病机制。方法:以HBV X蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-X转染 HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取总RNA进行逆转录,对产物行基因表达谱芯片分析。应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HBV X反式激活作用的新的靶基因。结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)

关键词：反式激活靶基因克隆化乙型肝炎病毒 XTP13

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应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选XTP12蛋白上调基因

应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选XTP12蛋白上调基因

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第五届全国肝脏疾病临床暨中华肝脏病杂志成立十周年学术会议

作者：宫嫚纪冬刘妍李筠成军郭江张黎颖解放军第302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室解放军第302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室解放军第302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室解放军第302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室北京地坛医院传染病研究所北京地坛医院传染病研究所北京地坛医院传染病研究所

目的:为筛选与克隆乙型肝炎病毒(HBV)反式激活基因XTP12的上调基因,了解其可能存在的调节功能线索,我们应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术筛选并克隆XTP12反式激活的新型靶基因。方法: 以XTP12表达质粒pcDNA3．1(-)-XTP12转... 详细信息

目的:为筛选与克隆乙型肝炎病毒(HBV)反式激活基因XTP12的上调基因,了解其可能存在的调节功能线索,我们应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术筛选并克隆XTP12反式激活的新型靶基因。方法: 以XTP12表达质粒pcDNA3．1(-)-XTP12转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy 载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性

关键词：抑制性消减杂交技术反式激活消减文库上调基因 XTP12

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应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选HBV XTP12蛋白反式激活基因的上调基因

应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选HBV XTP12蛋白反式激活基因的...

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中华中医药学会第十二届内科肝胆病学术会议暨第四次国家中医肝病重点专科协作组学术会议

作者：宫嫚成军纪冬刘妍郭江张黎颖李筠解放军第302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室

为筛选与克隆乙型肝炎病毒(HBV)反式激活基因XTP12的上调基因,了解其可能存在的调节功能线索,我们应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioin-formatics)技术筛选并克降XTP12反式激活的新型靶基因。以XTP12表达质粒pcDNA3.1(-)-XT... 详细信息

为筛选与克隆乙型肝炎病毒(HBV)反式激活基因XTP12的上调基因,了解其可能存在的调节功能线索,我们应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioin-formatics)技术筛选并克降XTP12反式激活的新型靶基因。以XTP12表达质粒pcDNA3.1(-)-XTP12转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa I酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析,结果成功构建人XTP12反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到68个阳性克降,进行菌落PCR分析,均得到200-1 000 bp插入片段。随机挑选其中28个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得28种编码基因,其中26种为已知基因编码蛋白,2种为未知功能的新基因。筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及肿瘤等密切相关的蛋白编码基因,推测了XTP12可能存在的调控机制的线索。

关键词：肝炎病毒,乙型 X蛋白反式激活抑制性消减杂交

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