目的 基于网络药理学方法,探讨防风在砷暴露引起的小鼠肝肾损伤中的作用机制,特别是其对铁死亡的调控效应。方法 通过中药系统药理学数据库与分析平台(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis pla...
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目的 基于网络药理学方法,探讨防风在砷暴露引起的小鼠肝肾损伤中的作用机制,特别是其对铁死亡的调控效应。方法 通过中药系统药理学数据库与分析平台(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP)、中药综合数据库(traditional Chinese medicine integrated database, TCMID)、中药百科全书数据库(encyclopedia of traditional chinese medicine, ETCM)数据库收集防风中18味中药有效成分及预测靶点;通过GeneCards数据库获取肝损伤、肾损伤及砷中毒靶点,并在铁死亡数据库(ferroptosis database, FerrDb)中获取铁死亡靶点;确定交集靶点后,构建蛋白质-蛋白质相互作用网络(protein-protein interaction, PPI),进行基因本体论(gene ontology, GO)功能注释,京都基因与基因百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)分析;为验证上述预测,将36只昆明小鼠随机分为正常对照组(Control)、亚砷酸钠(Sodium arsenite, NaAsO2)模型组、防风低剂量(NaAsO2+L)组、防风中剂量(NaAsO2+M)组、防风高剂量(NaAsO2+H)组以及二巯基丙磺酸钠(sodium dimercaptopropanesulfonate, DMPS)阳性药(NaAsO2+D)组,共6组;通过对应药物灌胃30 d后,HE染色观察小鼠肝、肾病理变化,Western blot检测肝、肾组织中炎症因子[核因子E2相关因子2(anti-nuclear factor erythroid 2-related factor 2 antibody, Nrf2)、白细胞介素-1β(anti-interleukin-1 beta antibody, IL-1β)、IL-18]、铁死亡相关蛋白[谷胱甘肽过氧化物酶4(anti-Glutathione peroxidase 4 antibody, GPX4)、溶质载体家族7成员11(anti-solute carrier family 7 member 11 antibody, SLC7A11)、环氧合酶2(anti-cyclooxygenase-2 antibody, COX2)]以及PI3K/AKT通路蛋白[磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(anti-phosphorylated Phosphoinositide 3-kinase antibody, p-PI3K)、磷脂酰肌醇3-激酶(anti-phosphoinositide 3-kinase antibody, PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(anti-phospho-AKT antibody, p-AKT)、蛋白激酶B(anti-AKT antibody, AKT)]的表达,采用生化试剂盒检测各组小鼠肝、肾组织中Fe2+、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)的含量。结果 网络药理学显示,氯霉素A、亥矛酚苷、川白酯内酯等18种防风化合物被筛选出来;筛选出2 655个肝损伤靶点,2 300个肾损伤靶点,防风活性成分靶点72个,2 224个砷靶点,1 546个铁死亡靶点,PPI分析预测AKT1、ESR1、CASP8、IL6、TP53等可能是其治疗砷致肝、肾铁死亡的重要靶点;KEGG富集分析预测PI3K/AKT与防风调节砷诱导肝、肾铁死亡密切相关;动物实验结果显示,与Control相比,NaAsO2处理小鼠肝、肾细胞边界不清、细胞肿胀、炎性细胞大量浸润,炎症细胞因子(IL-1β、IL-18)、MDA、Fe2+、COX2含量增加,Nrf2、GSH、GPX4、SC7A11、p-PI3K以及p-AKT水平降低(P<0.05);与NaAsO2模型组相比,防风高、中、低剂量组和NaAsO2+D组小鼠肝、肾组织中细胞损伤、炎性细胞浸润、炎性细胞因子、铁死亡相关蛋白、PI3K/AKT通路蛋白、Fe2+、MDA及GSH水平的变化均被不同程度逆转(P<0.05)。结论 防风调控铁死亡缓解NaAsO2暴露介导的小鼠肝、肾组织损伤,其作用机制可能与抑制炎症反应和激活PI3K/AKT信号通路有关。
目的拟通过单细胞转录组测序技术(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)解析移植前体外培养人胸腺组织切片的残余细胞类型和功能,并利用培养上清液分子标志物的水平特征建立胸腺组织切片质量评估方法。方法收集2023年5月至2024年1月在重庆医科大学附属儿童医院心胸外科接受心脏外科手术的18例先天心脏病患者废弃的胸腺制备成胸腺组织切片。体外培养14 d后,通过scRNA-seq鉴定残余的细胞类型,联合基因本体论(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析残余细胞的功能,并查阅胸腺组织切片培养的相关文献筛选出指示胸腺细胞功能的分子标志物。采用ELISA检测上清液分子标志物的蛋白水平变化,绘制受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC),以曲线下面积(area under the curve,AUC)判定上清液分子标志物对胸腺组织切片质量的评估价值。将分子标志物判定为质量检测合格与质量检测不合格的胸腺组织切片移植至6~8周龄Balb/c-nude雄性小鼠(体质量14~17 g)皮下(对照组不移植胸腺组织切片),通过流式细胞术和组织学检测分析移植后免疫重建效果。结果(1)scRNA-seq数据显示,胸腺组织切片中含有11种细胞,主要细胞为上皮细胞、成纤维细胞和T细胞。GO和KEGG富集分析显示,上皮细胞与趋化作用、上皮细胞发育、细胞基质粘附、紧密连接等条目相关;成纤维细胞主要与细胞外基质组织、上皮细胞增殖、负向调控细胞迁移、肌动蛋白细胞骨架调节等条目相关;T细胞主要与T细胞分化、T细胞活化的调控、T细胞凋亡、T细胞受体信号等条目相关。(2)筛选出CCL19、CCL21、CXCL12、CXCL16、IL16、SELL作为指示胸腺细胞功能的分子标志物,与第1天相比,CCL19、CCL21、CXCL12和CXCL16蛋白分泌量伴随体外培养显著增加(P<0.05),IL16和L-selectin(SELL表达分泌的蛋白)蛋白分泌量伴随体外培养显著下降(P<0.05)。联合IL16和L-selectin生成预测因子Pre1评估体外培养1 d的胸腺组织切片质量的价值最高,ROC曲线下面积为0.883。联合CCL19、CCL21、CXCL12、CXCL16生成预测因子Pre2评估体外培养14 d的胸腺组织切片质量的价值最高,ROC曲线下面积为0.948。(3)裸鼠移植实验证实:与对照组相比,质量检测合格的胸腺组织切片能在体内发育成胸腺结构,并有效提升裸鼠外周血中T细胞的比例(P<0.01),而质量检测不合格的胸腺组织切片移植到裸鼠体内无法重建裸鼠的T细胞发育。结论移植前胸腺组织切片残留的组成细胞主要为上皮细胞、成纤维细胞和T细胞;IL16和L-selectin可作为判定胸腺原料质量的潜在指标。CCL19、CCL21、CXCL12和CXCL16可有效评估胸腺组织切片成品的质量。
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