检索结果-内蒙古大学图书馆

弓形虫Chinese 1基因型Wh6弱毒株感染小鼠抗强毒株致死性感染的免疫保护作用

中国人兽共患病学报 2020年第2期36卷 87-93页

作者：陈守斌何佳丽崔雯王聪陶晴计永胜罗庆礼胡晓东沈继龙王维安徽医科大学基础医学院安徽病原生物学省级实验室和人兽共患病安徽省重点实验室合肥230032

目的研究我国流行的优势基因型Chinese 1弱毒Wh6株感染抗致死性强毒Wh3株攻击感染的保护力,探讨其潜在的制备减毒活疫苗的价值。方法将30只BALB/c雌性小鼠随机分为3组(I,II,III组),每组10只。取弱毒株弓形虫保种小鼠脑组织,分离包囊,计... 详细信息

目的研究我国流行的优势基因型Chinese 1弱毒Wh6株感染抗致死性强毒Wh3株攻击感染的保护力,探讨其潜在的制备减毒活疫苗的价值。方法将30只BALB/c雌性小鼠随机分为3组(I,II,III组),每组10只。取弱毒株弓形虫保种小鼠脑组织,分离包囊,计数。I组小鼠灌胃包囊25-35个;II组给与PBS对照;III组正常小鼠不予任何干预。35 d后,I组感染小鼠脑组织压片镜检,查见典型弓形虫包囊,表明慢性弓形虫感染BALB/c小鼠模型建立成功。分别取Wh3株速殖子(3000个),腹腔感染I组和II组小鼠,观察小鼠存活及腹腔虫荷;同时剖杀小鼠,收集脾细胞培养上清,采用流式细胞术、荧光定量PCR、酶联免疫吸附试验等检测脾细胞中的Th1、Th2细胞因子水平。结果II组对照鼠在感染Wh3株弓形虫速殖子后第7 d内死亡5只,第8 d剩余5只全部死亡,随机取3只死亡小鼠对其腹腔进行计数,计数结果为(1.28±0.0351)×106/mL;而I组小鼠截止实验结束全部存活(P<0.01)。II组鼠脾细胞培养上清Th1细胞因子IFN-γ、IL-12和Th2细胞因子IL-10水平相比I组显著升高(P<0.001)。其中Th1细胞因子升高程度明显高于Th2细胞因子,巨噬细胞向Th1方向极化。结论用弱毒株Wh6包囊攻击感染BALB/c鼠,可诱导强力的抵抗Wh3强毒株致死性感染的免疫保护力。Chinese 1基因型Wh6株具有候选减毒活虫疫苗研究的潜在价值。

关键词：弓形虫疫苗 Chinese 1基因型免疫保护

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白纹伊蚊自噬基因ATG8蛋白多克隆抗体的制备及应用

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中国病原生物学杂志 2023年第7期18卷 787-792页

作者：何珊肖秋秋石梦婷李威仪彭哲慧程金芝吴家红贵州医科大学公共卫生与健康学院环境污染与疾病监控教育部重点实验室贵州贵阳550025 贵州医科大学基础医学院现代病原生物学特色重点实验室贵州医科大学基础医学院人体寄生虫学教研室安顺市人民医院检验科

目的通过原核表达系统制备白纹伊蚊(Aedes albopictus,Aa)ATG8,免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,并验证抗体的实用性。方法从白纹伊蚊Aa23细胞中提取cDNA,通过PCR扩增AaATG8基因片段,然后与载体pET30a连接,构建原核表达载体pET30a-AaATG8... 详细信息

目的通过原核表达系统制备白纹伊蚊(Aedes albopictus,Aa)ATG8,免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,并验证抗体的实用性。方法从白纹伊蚊Aa23细胞中提取cDNA,通过PCR扩增AaATG8基因片段,然后与载体pET30a连接,构建原核表达载体pET30a-AaATG8并转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞,挑取单克隆进行PCR鉴定,提取质粒进行测序鉴定。再将重组质粒转化到大肠埃希菌BL21感受态细胞,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白rAa-ATG8,纯化透析后免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体,采用ELISA检测抗体效价,并以该抗体为一抗采用Western blot检测不同物种ATG8蛋白的表达。结果成功构建原核表达载体PET30a-AaATG8并在大肠埃希菌中诱导表达目的蛋白。重组蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,ELISA检测其血清抗体效价为1∶640000;Western blot显示rAa-ATG8多克隆抗体可用于检测埃及伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊、三带喙库蚊、家蝇ATG8蛋白,反应条带位于18、16或14 ku处。结论成功获得高效价的rAa-ATG8多克隆抗体,该抗体不仅可用于检测白纹伊蚊ATG8蛋白,还可用于检测埃及伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊、三带喙库蚊、家蝇ATG8蛋白,为研究自噬在蚊虫以及其他物种中的作用奠定了基础。

关键词：白纹伊蚊自噬相关蛋白8/ATG8 原核表达抗体制备

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白纹伊蚊胰岛素样肽基因的鉴定和时空表达分析

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中国媒介生物学及控制杂志 2023年第2期34卷 204-211页

作者：肖秋秋李威仪何珊程金芝彭哲慧吴家红贵州医科大学基础医学院现代病原生物学特色重点实验室/寄生虫学教研室贵州贵阳550025 贵州医科大学公共卫生学院贵州贵阳550025

目的筛选并鉴定白纹伊蚊全基因组中的胰岛素样肽(insulin-like peptides,ILP)基因,分析其基因结构以及在不同发育时期和不同组织的表达谱。方法基于埃及伊蚊ILPs家族成员序列,在Vectorbase网站上的白纹伊蚊全基因组数据库做同源搜索,Sig... 详细信息

目的筛选并鉴定白纹伊蚊全基因组中的胰岛素样肽(insulin-like peptides,ILP)基因,分析其基因结构以及在不同发育时期和不同组织的表达谱。方法基于埃及伊蚊ILPs家族成员序列,在Vectorbase网站上的白纹伊蚊全基因组数据库做同源搜索,SignalP 6.0进行信号肽预测,MEGA 11.0软件包对ILPs基因结构特点进行分析,最大似然法构建系统进化树。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同发育时期(卵、4龄幼虫、蛹、成蚊),以及吸血前后雌蚊不同组织(头部、脂肪体、中肠、胸部、卵巢)的白纹伊蚊胰岛素样肽(insulin-like peptides of Aedes albopictus,AalbILPs)基因表达变化。采用SPSS 20.0软件做数据统计分析,Tukey’s HSD检验和t检验分析不同发育时期和吸血前后不同组织中AalbILPs基因的表达差异。结果在白纹伊蚊全基因组中获得7条ILPs开放阅读框序列。7条AalbILPs序列均具有胰岛素超家族的保守特征,由连续的信号肽、B、C和A链组成前肽。其中AalbILP6具有截短的C链和羧基末端延伸,类似脊椎动物的胰岛素生长因子。系统进化树显示,AalbILP1、2、3和5在蚊虫中最为保守,AalbILP6其次,而AalbILP4、7为伊蚊所特有。qRT-PCR结果显示,AalbILP1、2、3和5在不同发育阶段均有表达。AalbILP5在雄蚊中相对表达量为1.3583±0.5769,与其他发育阶段和雌蚊相比最高(q_(卵)=6.572,q_(幼虫)=5.771,q_(蛹)=5.409,q_(雌蚊)=3.115,均P<0.05)。AalbILP3和4在成蚊头部特异性表达,AalbILP6主要在雌蚊卵巢表达;AalbILP7为假基因,未转录。与未吸血蚊虫相比,吸血诱导AalbILP3和4在雌蚊头部的表达分别上调2.60和1.68倍(t_(AalbILP3-头部)=9.596,P_(AalbILP3-头部)<0.001;t_(AalbILP4-头部)=4.524,P_(AalbILP4-头部)=0.001);AalbILP1在头部、脂肪体以及中肠的表达分别上调10.33、6.07和3.79倍(t_(头部)=4.255,P_(头部)=0.001;t_(脂肪体)=4.305,P_(脂肪体)=0.001;t_(中肠)=10.480,P_(中肠)<0.001),胸部和卵巢的表达分别下调4.24和2.17倍(t_(胸部)=7.922,P_(胸部)<0.001;t_(卵巢)=3.752,P_(卵巢)=0.003);AalbILP6在雌蚊中肠和卵巢的相对表达量分别上调11.91和2.16倍(t_(中肠)=5.799,P_(中肠)<0.001;t_(卵巢)=9.074,P_(卵巢)<0.001)。结论在白纹伊蚊全基因组中共获得6条ILPs序列,并成功构建其时空表达谱。

关键词：白纹伊蚊胰岛素样肽时空表达血餐

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“虚实结合”实验教学新模式在《人体寄生虫学》教学中的应用——以“血吸虫综合实验”为例

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中国血吸虫病防治杂志 2023年第2期35卷 180-183,216页

作者：陈晓军周莎邱竞帆陈琳徐志鹏季旻珺郭静张戎南京医科大学基础医学院病原生物学系、江苏省现代病原生物学重点实验室江苏南京211166 南京医科大学人事处江苏南京211166 南京医科大学基础医学院基础医学实验教学中心江苏南京211166

“新医科”背景下,信息技术已成为推动高等教育发展的重要驱动力之一。南京医科大学基础医学实验教学中心联合基础医学院病原生物学系将信息技术与实验教学相融合,设计和构建了“虚实结合”实验教学新模式,并应用于《人体寄生虫学》教学... 详细信息

“新医科”背景下,信息技术已成为推动高等教育发展的重要驱动力之一。南京医科大学基础医学实验教学中心联合基础医学院病原生物学系将信息技术与实验教学相融合,设计和构建了“虚实结合”实验教学新模式,并应用于《人体寄生虫学》教学,取得了良好的教学效果。该模式有助于学生加深对人体寄生虫学基础知识的理解,锻炼实践操作技能,培养医学生道德素养和综合能力。本文以“血吸虫综合实验”为例,对教学方案和实施、教学效果和评价、教学体会等进行了总结。

关键词：人体寄生虫学血吸虫虚实结合实验教学混合式教学

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酵母双杂交筛选与弓形虫毒力因子ROP18相互作用的宿主蛋白

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2013年第1期31卷 18-22页

作者：都建安然程里陈滢沈继龙安徽医科大学基础医学院生化与分子生物学教研室合肥230032 安徽医科大学药学院合肥230032 安徽医科大学省部级基因研究重点实验室病原生物学教研室合肥230032

目的利用酵母双杂交方法,筛选与弓形虫毒力因子ROP18相互作用的宿主蛋白。方法 RT-PCR扩增弓形虫RH株速殖子ROP18基因片段,扩增产物经双酶切后插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,将重组质粒导入酵母AH109菌株中,检测诱饵载体有无毒性和自... 详细信息

目的利用酵母双杂交方法,筛选与弓形虫毒力因子ROP18相互作用的宿主蛋白。方法 RT-PCR扩增弓形虫RH株速殖子ROP18基因片段,扩增产物经双酶切后插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,将重组质粒导入酵母AH109菌株中,检测诱饵载体有无毒性和自激活作用,利用酵母双杂交系统从人胚胎脑cDNA文库中筛选与ROP18相互作用的宿主蛋白。结果构建了诱饵载体pGBKT7-ROP18,ROP18具有自激活功能。用ROP18^(25-25lan)为诱饵,筛选获得一系列与ROP18相互作用的宿主蛋白:DNA损伤特异性结合蛋白1(DDB1)、torsin A相互作用蛋白1(TOR1AIP1)、整联蛋白β1(integrinβ1)、溶质运载蛋白3(SLC3A2)、酪氨酸硫化转移酶2(TPST2)、Derl样域家族成员2(DERL2)和OCIA结构域蛋白1(OCIAD1)。结论通过酵母双杂交技术筛选出与弓形虫毒力因子ROP18相互作用的多种宿主蛋白。

关键词：弓形虫 ROP18^25-251aa 酵母双杂交相互作用宿主蛋白

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吡喹酮对日本血吸虫急性感染小鼠肾脏功能损伤的影响

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2021年第2期39卷 200-209页

作者：赵成思秦敏谭明娟缪婷婷邵天业刘新建王勇南京医科大学病基础医学院原生物学系江苏省现代病原生物学重点实验室南京211166 南京医科大学附属南京医院(南京市第一医院)检验科南京210006

目的研究日本血吸虫感染急性期小鼠肾脏炎症的发生、发展进程,评价吡喹酮对急性期感染小鼠肾脏功能损伤的治疗效果。方法取55只C57BL/6J雌性小鼠,随机分为健康对照组(20只)、健康对照给吡喹酮组(5只)、感染组(20只)、感染给吡喹酮组(5只... 详细信息

目的研究日本血吸虫感染急性期小鼠肾脏炎症的发生、发展进程,评价吡喹酮对急性期感染小鼠肾脏功能损伤的治疗效果。方法取55只C57BL/6J雌性小鼠,随机分为健康对照组(20只)、健康对照给吡喹酮组(5只)、感染组(20只)、感染给吡喹酮组(5只)和吡喹酮杀虫组(5只)等5组,其中后3组每只小鼠均经腹部皮肤感染(14±2)条日本血吸虫尾蚴。感染后第6周开始给予吡喹酮治疗,健康对照给吡喹酮组和感染给吡喹酮组给药剂量为300 mg/kg,每12小时给一次药,连续给药2周;吡喹酮杀虫组给药剂量为250mg/kg,连续给药3天。健康对照组和感染组小鼠在感染后第1、3、6和8周各剖杀5只,健康对照给吡喹酮组、感染给吡喹酮组和吡喹酮杀虫组在感染后第8周剖杀,收集各组各时间点小鼠的尿样和血样,检测尿蛋白和血清肌酐水平,以评价肾功能变化。取小鼠肾脏,制备病理切片,经HE染色后,观察各组小鼠肾脏组织病理学改变;经F4/80免疫组化染色,观察各组小鼠肾脏中巨噬细胞浸润情况。分别用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blotting检测各组小鼠肾脏炎症相关因子(TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-6)和巨噬细胞趋化因子(CCL2)的mRNA相对转录水平和蛋白表达水平。结果感染后第1、3、6和8周,感染组小鼠的尿蛋白含量分别为(1.67±0.52)、(2.17±0.41)、(3.00±0.89)和(4.00±0.63) g/L,均高于健康对照组小鼠(P<0.01);感染组小鼠的血清肌酐水平分别为(10.01±1.45)、(13.00±2.12)、(14.33±1.21)和(19.00±2.54)μmol/L,均高于健康对照组小鼠(P>0.05或P<0.01)。qRT-PCR检测结果显示,感染组小鼠的炎症因子TNF-αmRNA相对转录水平分别为2.47±0.51、3.14±1.43、1.83±0.31和7.48±5.54, TGF-βm RNA相对转录水平分别为0.94±0.24、2.80±1.07、2.72±0.88和3.03±0.36, IL-1βmRNA相对转录水平分别为1.49±0.28、4.32±1.85、2.08±0.69和2.81±0.73, IL-6 mRNA相对转录水平分别为1.96±0.31、1.48±0.35、2.38±1.17和2.85±1.32,均高于对应时间点的健康对照组小鼠(P<0.05或P<0.01)。Western blotting分析结果显示,感染组小鼠的TNF-α和IL-1β蛋白表达水平均较健康对照组升高。感染组小鼠的巨噬细胞趋化因子CCL2 mRNA相对转录水平为1.84±0.17、3.42±0.85、3.03±1.00和2.63±0.43,均高于健康对照组小鼠(P<0.01)。肾脏病理切片HE染色结果显示,感染组小鼠肾脏组织中大量炎性细胞浸润,肾小球增大,肾小球系膜细胞增生。免疫组化分析结果显示,感染组小鼠肾脏F4/80阳性区域面积为(1.99±0.49)%、(4.27±0.90)%、(6.71±1.38)%和(9.83±1.91)%,均高于健康对照组(P<0.01)。经吡喹酮2周疗程治疗后,感染给吡喹酮组小鼠的肾脏组织损伤减轻,肾小球系膜细胞增生缓解。与感染组比较,感染给吡喹酮组小鼠的尿蛋白含量[(2.67±0.52) g/L]减少,血清肌酐水平[(14.17±2.88)μmol/L]下降,F4/80阳性区域面积[(5.92±1.81)%]减少,TGF-β(0.99±0.23)和IL-6(1.24±0.53)m RNA相对转录水平下降(P<0.05或P<0.01), TNF-α和IL-1β的蛋白表达减少;而吡喹酮杀虫组与感染组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与感染组(5.29±2.98、2.81±0.73、2.63±0.43)比较,感染给吡喹酮组(0.98±0.36、0.95±0.33、0.80±0.27)和吡喹酮杀虫组的TNF-α(1.56±0.66)、IL-1β(1.76±0.76)和CCL2mRNA(1.41±0.48)相对转录水平均下降(P<0.05或P<0.01)。结论日本血吸虫感染小鼠在感染初期和急性期发生肾脏炎症,肾脏组织中伴有巨噬细胞浸润,肾小球和肾功能损伤。吡喹酮2周疗程治疗可明显改善急性日本血吸虫感染小鼠的肾脏炎症和肾功能。

关键词：日本血吸虫肾损伤炎症吡喹酮巨噬细胞

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核不均一核糖核蛋白R基因沉默抑制非小细胞肺癌细胞恶性转化

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中国生物化学与分子生物学报 2022年第12期38卷 1640-1650页

作者：刘玲玲苟铉婧桂书琴何小凤王琴容谢渊赵艳周建奖地方病与少数民族疾病教育部重点实验室贵州医科大学基础医学院分子生物学重点实验室贵阳550004

核不均一核糖核蛋白R(hnRNPR)是一种与mRNA生物学功能密切相关的RNA结合蛋白质,与多种肿瘤细胞的恶性转化相关。然而,在非小细胞肺癌(NSCLC)中的作用机制尚不清楚。本研究通过检索公共数据库发现,hnRNPR蛋白主要在肺癌细胞核中表达,hnRN... 详细信息

核不均一核糖核蛋白R(hnRNPR)是一种与mRNA生物学功能密切相关的RNA结合蛋白质,与多种肿瘤细胞的恶性转化相关。然而,在非小细胞肺癌(NSCLC)中的作用机制尚不清楚。本研究通过检索公共数据库发现,hnRNPR蛋白主要在肺癌细胞核中表达,hnRNPR mRNA在非小细胞肺癌组织中高表达,并且与肺腺癌患者的生存率呈负相关;hnRNPR的表达与非小细胞肺癌患者的性别、T分期显著相关(P<0.05)。构建hnRNPR基因沉默的非小细胞肺癌稳定细胞株,检测细胞功能变化,结果显示,hnRNPR基因沉默抑制了细胞增殖、迁移和侵袭能力以及上皮-间质转化(EMT),并将细胞周期阻滞在G1期(P<0.01)。生物信息学分析显示,非小细胞肺癌中hnRNPR基因与9310个基因的表达正相关(皮尔逊相关系数>0,P<0.05),与10680个基因的表达负相关(皮尔逊相关系数<0,P<0.05)。综上所述,hnRNPR在非小细胞肺癌中高表达,可能作为剪接体的组分,通过调节相关基因的表达,促进了NSCLC细胞的恶性转化。

关键词：核不均一核糖核蛋白R 非小细胞肺癌增殖迁移侵袭上皮间质转化

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fliL基因显著影响艰难拟梭菌运动功能及产孢能力

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生物工程学报 2023年第4期39卷 1578-1595页

作者：鲍江舰杨君仪邵瑞瑞张婷廖健程玉梅官志忠齐晓岚陈峥宏洪伟崔古贞贵州医科大学基础医学院贵州省普通高等学校病原生物学特色重点实验室贵州贵阳550004 贵州医科大学地方病与少数民族疾病教育部重点实验室贵州省医学分子生物学重点实验室贵州贵阳550001 省部共建地方病及民族区域性疾病防控协同创新中心贵州贵阳550001 贵州医科大学口腔医学院附属口腔医院贵州贵阳550001 贵州医科大学附属医院综合ICU 贵州贵阳550001 贵州医科大学病理科贵州医科大学附属医院贵州贵阳550001

鞭毛基底体相关FliL家族蛋白(flagellar basal body-associated FliL family protein,fliL)基因编码FliL蛋白,FliL是一种与鞭毛基体相结合的单跨膜蛋白。为研究艰难拟梭菌fliL基因功能,使用非等长同源臂偶联等位交换(allele-coupled exchange,ACE)方法成功构建了fliL基因缺失(ΔfliL)和回补(::fliL)突变株,研究突变菌株与野生型菌株(CD630)生长曲线、抗生素敏感性、pH耐受性、运动能力及产孢能力等表型的差异。结果显示,菌株ΔfliL生长速率及最大生物量均小于菌株CD630,::fliL回补菌株生长情况回复至野生型。与CD630菌株相比,ΔfliL对阿莫西林、氨苄青霉素、诺氟沙星的敏感性提高,对卡那霉素、四环素敏感性降低,::fliL抗生素敏感性部分回复至野生型水平。与CD630菌株相比,ΔfliL游泳运动能力显著降低,::fliL运动能力超越野生型菌株CD630。相比菌株CD630,菌株ΔfliL在pH值为5时耐受能力显著提高,在pH值为9时,耐受能力显著降低。除此之外,ΔfliL产孢能力较CD630显著降低,::fliL产孢能力部分恢复。以上结果表明,艰难拟梭菌fliL基因与其运动能力、抗生素敏感性、环境耐受能力和产孢能力密切相关,可能进一步影响艰难拟梭菌菌株的致病力。

关键词：艰难拟梭菌非等长同源臂偶联等位交换鞭毛 fliL 突变株表型

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家蝇几丁质酶基因8(MDCht8)的cDNA克隆及功能初探

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中国病原生物学杂志 2020年第2期15卷 168-173页

作者：吴沁怡国果赵文静苏佩佩杨隆兵修江帆贵州医科大学基础医学院现代病原生物学重点特色实验室贵州贵阳550025 贵州省疾病预防控制中心贵州医科大学食品科学学院

目的从家蝇的EST测序数据库中筛选获得家蝇几丁质酶基因8(MDCht8),对其进行分子特性分析,探讨Cht8基因在家蝇不同组织和发育时期的时空表达模式及其在家蝇免疫防御中的功能。方法克隆MDCht8基因,借助MEGA 5.0软件采用邻接法构建系统进化... 详细信息

目的从家蝇的EST测序数据库中筛选获得家蝇几丁质酶基因8(MDCht8),对其进行分子特性分析,探讨Cht8基因在家蝇不同组织和发育时期的时空表达模式及其在家蝇免疫防御中的功能。方法克隆MDCht8基因,借助MEGA 5.0软件采用邻接法构建系统进化树;采用实时荧光定量PCR检测MDCht8基因时空表达模式及微生物诱导后不同时间点(3、6、12、18、24、36、48h)MDCht8基因表达水平的变化。结果 MDCht8基因的ORF框全长1 512bp,编码一个含503个氨基酸的蛋白多肽,理论相对分子质量约为56.801 7×10^3,进化树分析显示该蛋白与果蝇Cht8遗传距离较近。时空表达模式分析显示,MDCht8基因在2龄幼虫和3龄幼虫内表达量较高,家蝇3龄幼虫的各主要组织中以唾液腺和中肠中的表达水平较高。经白色念珠菌和大肠埃希菌诱导后,家蝇MDCht8基因出现明显上调,金黄色葡萄球菌诱导后未表现出明显上调。成功克隆了MDCht8基因,PCR扩增片段为1 512bp,与预期相符。结论初步揭示了MDCht8基因在家蝇不同虫期,不同组织表达量不同,提示几丁质酶基因在家蝇生长发育过程中具有重要作用;MDCht8基因在家蝇幼虫受到病原微生物攻击后表达上调,且攻击后的不同时间点表达量不同,提示MDCht8基因编码的几丁质酶参与家蝇的免疫防御过程。

关键词：家蝇几丁质酶克隆分子特性时空表达

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基于sacB负筛选标记的Targetron质粒分析系统构建

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中国病原生物学杂志 2022年第9期17卷 1010-1014页

作者：崔古贞花登雄鲍江舰张馨月洪伟吴道艳向松谷俊莹陈峥宏贵州医科大学基础医学院微生物学教研室贵州贵阳550025 贵州省病原生物学特色重点实验室贵州医科大学医学检验学院省部共建地方病与少数民族性疾病重点实验室贵州医科大学附属医院

目的构建基于sacB负筛选标记的Targetron质粒分析系统。方法构建sacB毒蛋白诱导表达受体质粒pACYC-sacB(携带p15A复制子),分析sacB毒蛋白对大肠埃希菌的毒性。设计sacB基因打靶位点,构建脱水四环素诱导的Targetron供体质粒pSY11-sacB(携... 详细信息

目的构建基于sacB负筛选标记的Targetron质粒分析系统。方法构建sacB毒蛋白诱导表达受体质粒pACYC-sacB(携带p15A复制子),分析sacB毒蛋白对大肠埃希菌的毒性。设计sacB基因打靶位点,构建脱水四环素诱导的Targetron供体质粒pSY11-sacB(携带colE1复制子和sacB405a打靶位点)。双质粒共转化大肠埃希菌BL21(DE3),脱水四环素诱导Targetron表达并对sacB基因进行打靶。涂布含有5%蔗糖和0.1 mmol/L IPTG的选择培养基,筛选sacB基因失活的阳性菌落,利用菌落PCR进一步验证Ⅱ型内含子在靶位点的插入情况。结果sacB基因表达的大肠埃希菌不能在含有5%蔗糖的平板中生长;双质粒共转化后,脱水四环素诱导Targetron表达能够插入到sacB405a靶位点;sacB基因失活后,大肠埃希菌能够在含有5%蔗糖的平板上生长,菌落PCR验证内含子插入到DNA靶位点。结论建立了基于sacB负筛选标记的Targetron质粒分析系统,为Ⅱ型内含子功能鉴定、迁移规律分析等奠定了基础。

关键词： Targetron sacB Ⅱ型内含子打靶平台

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