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微生物学通报 2019年第11期46卷 2944-2951页

作者：贾化可张功友陶小买吴东明隆耀航刘红美贵州医科大学医药生物技术与工程研究中心贵州贵阳550025 贵州医科大学生物与医学工程重点实验室贵州贵阳550025 贵州省免疫细胞与抗体工程研究中心贵州贵阳550025

【背景】PilZ结构域是最早发现的环二鸟苷酸(Cyclic diguanylate,c-di-GMP)受体信号分子,与c-di-GMP结合后可以调控目标基因或者蛋白的活性,在细菌的生长过程中发挥着至关重要的作用,而短短芽孢杆菌中PilZ结构域的研究相对缺乏。【目的... 详细信息

【背景】PilZ结构域是最早发现的环二鸟苷酸(Cyclic diguanylate,c-di-GMP)受体信号分子,与c-di-GMP结合后可以调控目标基因或者蛋白的活性,在细菌的生长过程中发挥着至关重要的作用,而短短芽孢杆菌中PilZ结构域的研究相对缺乏。【目的】挖掘短短芽孢杆菌GZDF3菌株中的PilZ结构域蛋白基因,并进行重组表达,为研究其功能奠定基础。【方法】从Pfam数据库中下载PilZ结构域模型,HMMScan软件扫描GZDF3全基因组序列,在保守结构域数据库(Conserved domain database,CDD)中分析蛋白保守结构域,Protein BLAST比对分析;采用ExPASy在线软件预测蛋白的基本理化性质;构建重组表达载体进行蛋白重组表达。【结果】GZDF3基因中存在5个含有PilZ结构域的蛋白编码基因,其中命名为Gene4836的基因经Protein BLAST比对分析显示其编码糖基转移酶,Gene1423为YcgR超家族蛋白编码基因,Gene1723编码透明质酸合成酶,属于糖基转移酶超家族2,其余Gene2571、Gene2956编码假定蛋白;Gene4836的编码产物分子量为24.08 kD,等电点为6.39,为酸性亲水性蛋白;C端有一个PilZ结构域;0.5 mmol/L乳糖诱导、30°C培养20 h,表达出一大小约为25kD的重组蛋白,与生物信息学预测结果相符。【结论】首次对短短芽孢杆菌含有PilZ结构域蛋白编码基因进行原核表达,并成功纯化出重组蛋白,为后续研究其功能奠定了基础。

关键词：短短芽孢杆菌 PilZ结构域糖基转移酶原核表达重组蛋白

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短短芽孢杆菌几丁质酶BBChi4基因的原核表达及抑菌活性研究

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基因组学与应用生物学 2019年第8期38卷 3533-3539页

作者：陶小买曾丽娜贾化可张婷婷任建国张洁刘红美贵州医科大学医药生物技术工程研究中心贵阳550025 贵州医科大学生物与医学工程重点实验室贵阳550025 贵州医科大学贵州省免疫细胞与抗体工程研究中心贵阳550025

采用生物信息学方法分析短短芽孢杆菌GZDF3菌株几丁质酶BBChi4基因,以GZDF3菌株全基因组DNA为模版设计特异性引物,通过PCR扩增出BBChi4基因的全序列并对其测序验证。将测序验证无误的基因序列连接到原核表达载体(pET-28a),构建重组表达... 详细信息

采用生物信息学方法分析短短芽孢杆菌GZDF3菌株几丁质酶BBChi4基因,以GZDF3菌株全基因组DNA为模版设计特异性引物,通过PCR扩增出BBChi4基因的全序列并对其测序验证。将测序验证无误的基因序列连接到原核表达载体(pET-28a),构建重组表达载体pET-28a-BBchi4,转入大肠杆菌BL21进行诱导表达,利用打孔法对诱导表达产物进行抑菌活性研究。生物信息学分析显示BBChi4基因全长为2 181 bp,编码726个氨基酸,分子量大小为77.69 kD,等电点为4.83,属于酸性几丁质酶。破碎重组表达菌体上清液SDS-PAGE电泳显示,重组蛋白质分子量大约为78 kD,与生物信息学预测结果一致。诱导表达最佳参数为1 mmol/L IPTG,30℃诱导4 h。破碎重组表达菌体上清液对半夏致病真菌(尖孢镰刀菌)有较强的拮抗作用。重组表达载体pET-28a-BBchi4的成功构建及表达为深入研究几丁质酶的功能提供科学依据。

关键词：短短芽孢杆菌几丁质酶基因原核表达抑菌活性

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瘤内注射OVA mRNA治疗小鼠结肠癌的研究

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免疫学杂志 2021年第12期37卷 1065-1070页

作者：谢颖张瑾宬刘雨周雪杨君仪刘鲜梅刘丽娜贵州医科大学生物与工程学院生物与医学工程重点实验室/贵州省免疫细胞与抗体工程研究中心/医药生物技术工程研究中心贵阳550025 贵州医科大学环境污染与疾病监控教育部重点实验室

目的研究瘤内注射OVA mRNA对小鼠CT26结肠癌的治疗效果,为以OVA为基础的肿瘤治疗提供新的思路。方法建立小鼠CT26结肠癌皮下肿瘤模型,将OVA mRNA直接注射至结肠癌荷瘤小鼠皮下肿瘤内,观察肿瘤生长和小鼠存活情况;实时荧光定量PCR检测小... 详细信息

目的研究瘤内注射OVA mRNA对小鼠CT26结肠癌的治疗效果,为以OVA为基础的肿瘤治疗提供新的思路。方法建立小鼠CT26结肠癌皮下肿瘤模型,将OVA mRNA直接注射至结肠癌荷瘤小鼠皮下肿瘤内,观察肿瘤生长和小鼠存活情况;实时荧光定量PCR检测小鼠肿瘤组织中细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-6、TGF-β的表达;免疫荧光染色检测肿瘤组织中CD8^(+)T细胞的浸润情况;TUNEL试剂盒检测肿瘤组织的细胞凋亡。结果每只小鼠皮下接种5×10^(5)个CT26细胞成功建立了小鼠结肠癌皮下肿瘤模型。荷瘤小鼠瘤内注射OVA mRNA能显著抑制结肠癌皮下肿瘤生长和延长小鼠的存活时间,并且上调肿瘤组织内细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-12的表达以及增加肿瘤浸润CD8+T细胞的数量和促进肿瘤组织的细胞凋亡。结论瘤内注射OVA mRNA通过促进肿瘤细胞凋亡和抗肿瘤免疫应答,以治疗小鼠CT26结肠癌。

关键词：结肠癌瘤内免疫治疗卵清蛋白 mRNA治疗

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MTT法检测奶牛乳房炎无乳链球菌活菌数的研究

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中国动物传染病学报 2021年第6期29卷 100-104页

作者：马林玉胡家银林煊陈鹤丹谢颖付文莉杨君仪刘丽娜贵州医科大学生物与工程学院生物与医学工程重点实验室贵州省免疫细胞与抗体工程研究中心医药生物技术工程研究中心贵阳550025

为建立一种准确、快速反映无乳链球菌活菌数的计数方法,以奶牛乳房炎致病菌中的无乳链球菌为研究对象,对MTT计数法中的最大吸收波长、MTT和DMSO最佳用量、无乳链球菌与MTT最适反应时间等影响因素进行了优化,并对MTT法与平板菌落计数法... 详细信息

为建立一种准确、快速反映无乳链球菌活菌数的计数方法,以奶牛乳房炎致病菌中的无乳链球菌为研究对象,对MTT计数法中的最大吸收波长、MTT和DMSO最佳用量、无乳链球菌与MTT最适反应时间等影响因素进行了优化,并对MTT法与平板菌落计数法定量检测结果进行了比较。结果显示:MTT法测定无乳链球菌活菌数的最大吸收波长为570 nm,0.5 mg/mL MTT与100μL无乳链球菌菌液反应的最佳反应量为45μL,最适反应时间为3 h,溶解产物的DMSO最佳用量为125μL;无乳链球菌活菌数在1.5×10^(7)~4.73×10^(8 )CFU/mL范围内时,MTT法与平板菌落计数法定量结果具有较好的线性关系(R^(2)>0.99)。结果表明,本研究建立的MTT法可用于无乳链球菌活菌计数。

关键词：奶牛乳房炎无乳链球菌 MTT 活菌计数

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亚硒酸钠对HepG2细胞脂质和葡萄糖代谢相关基因表达的影响

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基因组学与应用生物学 2021年第4期40卷 1838-1845页

作者：张亮亮易婉婷黄江涛代杰曾柱贾义贵州医科大学贵州省免疫细胞和抗体工程研究中心贵阳550025 贵州医科大学生物与医学工程重点实验室贵阳550025 贵州医科大学医学生物技术工程研究中心贵阳550025 贵州医科大学基础医学院贵阳550025

硒是人和动物必需的微量元素,不同浓度的硒可以调节猪、羔羊、小鼠、人和酵母中与脂质和葡萄糖代谢相关基因的表达水平,但是目前尚不清楚低剂量硒对HepG2细胞脂质和葡萄糖代谢相关基因的影响。因此,我们通过实时荧光定量PCR和基因组学分... 详细信息

硒是人和动物必需的微量元素,不同浓度的硒可以调节猪、羔羊、小鼠、人和酵母中与脂质和葡萄糖代谢相关基因的表达水平,但是目前尚不清楚低剂量硒对HepG2细胞脂质和葡萄糖代谢相关基因的影响。因此,我们通过实时荧光定量PCR和基因组学分析,研究了亚硒酸钠对HepG2细胞中脂质和葡萄糖代谢相关基因表达水平的影响。结果表明,脂质代谢相关基因FAR1,DGKD和HILPDA在24 h和36 h时表达增加,葡萄糖代谢相关基因UGDH,IRS-2和PEPCK在24 h和36 h时表达增加。与对照组相比,0.1μmol/L亚硒酸钠处理HepG2细胞24 h可以增加TRAP1,HILPDA和PEPCK的表达水平,它们在肿瘤发生发展中起着重要的作用。此外,转录组学分析表明,亚硒酸钠可以改变代谢调控网络,包括萜类骨架的生物合成、胰岛素抵抗、磷酸肌醇代谢和细胞周期途径等。以上结果表明,0.1μmol/L亚硒酸钠可能会影响HepG2细胞的脂质和葡萄糖代谢,影响肿瘤的发生发展。

关键词：亚硒酸钠脂质代谢葡萄糖代谢 HepG2细胞

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重楼中一株产纤维素酶内生真菌的分离及鉴定

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生物技术通报 2022年第2期38卷 95-104页

作者：张功友王一涵郭敏张婷婷王兵刘红美贵州医科大学医药生物技术工程研究中心贵阳550025 贵州医科大学药用植物功效与利用国家重点实验室贵阳550025 贵州医科大学生物与工程学院贵阳550025 贵州省高校免疫细胞与抗体工程研究中心贵阳550025 贵州医科大学基础医学院贵阳550025

从重楼根茎中分离、鉴定具有产纤维素酶活性的内生真菌。采用表面消毒法从重楼块茎中分离内生真菌;用纤维素酶活性CMC平板检测分离菌株的产纤维素酶活性;对高产菌株进行形态学观察和分子生物学测序鉴定;探究影响纤维素酶活力的因素;利... 详细信息

从重楼根茎中分离、鉴定具有产纤维素酶活性的内生真菌。采用表面消毒法从重楼块茎中分离内生真菌;用纤维素酶活性CMC平板检测分离菌株的产纤维素酶活性;对高产菌株进行形态学观察和分子生物学测序鉴定;探究影响纤维素酶活力的因素;利用平板法检测该株菌产其他胞外水解酶的活性。从3个来源的重楼中分离出41株内生真菌,通过平板检测发现AS-5、AS-7、AS-9和AS-18菌株能产生纤维素酶,其中AS-9菌株活性最强;通过形态学观察和ITS、LSU序列分析将AS-9菌株鉴定为Setophoma terrestris;该菌在pH值为7.0和温度为28℃时表现出最大纤维素酶活性,紫外线照射对产纤维素酶活性无明显作用;检测发现AS-9菌株同时具有产酪蛋白酶、脂肪酶、天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶和脲酶活性。首次在重楼中发现内生真菌Setophoma terrestris,且具有较好的产纤维素酶能力,值得深入研究。

关键词：纤维素酶重楼分离鉴定 Setophoma terrestris 胞外水解酶

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失巢凋亡相关基因对子宫内膜癌患者预后状况的预测价值

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基因组学与应用生物学 2024年第4期43卷 697-707页

作者：刘凯凤韦现鹏欧阳燕胡祖权岳萍曾柱贵州医科大学基础医学院贵州省感染免疫与抗体工程特色重点实验室贵州省细胞免疫治疗工程研究中心贵阳550025 贵州医科大学生物与工程学院(健康医药现代产业学院) 贵州医科大学生物与医学工程重点实验室贵州省高等学校免疫细胞与抗体工程研究中心贵阳550025

子宫内膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma,UCEC)是最常见的女性生殖系统肿瘤,肿瘤发生远端转移的患者预后极差。失巢凋亡(anoikis)是一种特殊的程序性细胞死亡形式,在肿瘤的侵袭和转移中起着关键作用,分析失巢凋亡相关基因与U... 详细信息

子宫内膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma,UCEC)是最常见的女性生殖系统肿瘤,肿瘤发生远端转移的患者预后极差。失巢凋亡(anoikis)是一种特殊的程序性细胞死亡形式,在肿瘤的侵袭和转移中起着关键作用,分析失巢凋亡相关基因与UCEC患者预后之间的关系将为临床治疗提供指导。本研究采用非监督一致性聚类算法对数据集进行分组,分析患者的肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)与临床特征的差异。同时,筛选预后相关的失巢凋亡基因,构建风险评分模型,评估UCEC患者的风险评分与临床特征、TME和药物治疗反应之间的关系。在分析失巢凋亡相关基因表达差异的基础上确定两个明确的聚类(A簇和B簇),与A簇UCEC患者相比,B簇UCEC患者的总生存期较短、免疫浸润水平较低。构建的风险评分模型可量化失巢凋亡相关基因的调控模式,高风险评分组表现为预后不良且免疫细胞浸润水平低,而低风险评分组则相反。药物敏感性分析结果表明,高风险评分的人群可能从靶向有丝分裂和DNA修复通路的药物中获得更佳疗效。本研究揭示了失巢凋亡相关基因与临床特征、TME和药物治疗反应之间的潜在关系,并阐明了其在UCEC治疗中的价值。

关键词：子宫内膜癌肿瘤微环境失巢凋亡风险评分模型预后价值

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小鼠黏蛋白1(MUC1)基因的体外转录及其在NIH/3T3细胞中的表达

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细胞与分子免疫学杂志 2018年第10期34卷 896-901页

作者：林煊陈鹤丹谢颖曾柱胡祖权贾义王赟谭承建刘丽娜贵州医科大学生物与医学工程重点实验室贵州省免疫细胞与抗体工程研究中心医药生物技术工程研究中心贵州贵阳550025 贵州医科大学省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室贵州贵阳550025 贵州医科大学生物与工程学院贵州贵阳550025 贵州医科大学基础医学院贵州贵阳550025 贵州民族大学民族医药学院贵州贵阳550025

目的体外转录获得小鼠黏蛋白1(MUC1) mRNA并在NIH/3T3细胞中表达。方法通过反转录PCR从小鼠4T1细胞中扩增MUC1基因,然后插入真核表达载体pc DNA3. 1(+)中构建重组表达载体pc DNA3. 1(+)-MUC1。双酶切鉴定正确后,以该质粒为模板,下游引... 详细信息

目的体外转录获得小鼠黏蛋白1(MUC1) mRNA并在NIH/3T3细胞中表达。方法通过反转录PCR从小鼠4T1细胞中扩增MUC1基因,然后插入真核表达载体pc DNA3. 1(+)中构建重组表达载体pc DNA3. 1(+)-MUC1。双酶切鉴定正确后,以该质粒为模板,下游引物中引入血凝素标签(HA TAG)序列,PCR扩增MUC1-HA TAG融合基因片段,然后克隆至表达载体pc DNA3. 1(+),重组载体经双酶切鉴定和DNA序列测定后作为模板,PCR扩增获得含T7启动子和MUC1-HA TAG融合基因片段的PCR产物作为体外转录模板,通过体外转录、加尾、纯化最终获得修饰的MUC1 mRNA。通过多种转染试剂将体外转录MUC1-HA TAG mRNA转入NIH/3T3细胞,Western blot法检测融合蛋白MUC1-HA TAG的表达。结果反转录PCR扩增的MUC1基因长度约为1900 bp,酶切鉴定和序列分析证实MUC1-HA TAG融合基因已成功插入pc DNA3. 1(+)质粒。插入序列与Gen Bank中小鼠的MUC1基因序列完全一致,HA TAG正确插入MUC1下游,读框正确。Western blot法分析证实体外转录修饰的MUC1-HA TAG mRNA能在NIH/3T3细胞中表达。结论体外转录修饰的小鼠MUC1-HA TAG mRNA能在哺乳动物NIH/3T3细胞中翻译表达。

关键词：黏蛋白1(MUC1) 体外转录蛋白表达

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DC-CIK免疫治疗联合化疗治疗血液恶性肿瘤的Meta分析

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基因组学与应用生物学 2023年

作者：熊华毅余鹏刘鲜梅宋咏刚胡祖权曾柱贵州医科大学生物与工程学院(健康医药现代产业学院)贵州省高等学校免疫细胞与抗体工程研究中心/生物与医学工程重点实验室贵州医科大学基础医学院贵州省高等学校感染免疫与抗体工程重点实验室

本研究旨在研究树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞（dendritic cell and cytokine-induced killer cell，DC-CIK）免疫治疗联合化疗治疗血液恶性肿瘤的临床疗效。本研究从PubMed、Web of Science、The Cochrane Library、Embase、CNKI、WanFang Data、SinoMed和VIP等数据库中，收集2000年1月至2023年2月发表的符合要求的随机对照研究，应用RevMan 5.4.1软件进行Meta分析。共纳入15篇文献，894例患者，包括686例骨髓瘤患者和208例白血病患者，其中DC-CIK免疫治疗联合化疗治疗组共451例，设置为联合治疗组，而单纯化疗组共443例，设置为对照组。分析结果显示，联合治疗组在临床疗效、预后情况、生活质量及各项免疫指标（T淋巴细胞亚群分布和细胞因子分泌水平）等方面均优于单纯化疗治疗组，且不会给患者带来特异性的副作用。研究结果表明，DC-CIK免疫治疗联合化疗能够改善恶性血液肿瘤患者的免疫功能，增强机体的抗肿瘤能力，从而显著提高临床治疗的效率。

关键词：树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞联合治疗血液恶性肿瘤 Meta分析

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体外转录小鼠MAGE-A3 mRNA在NIH/3T3细胞中的表达

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安徽医科大学学报 2020年第8期55卷 1157-1160页

作者：陈鹤丹林煊谢颖陈尧杨君仪王赟张世超胡祖权曾柱刘丽娜贵州医科大学生物与工程学院生物技术教研室贵阳550025 贵州医科大学生物与医学工程重点实验室/贵州省免疫细胞与抗体工程研究中心/医药生物技术工程研究中心贵阳550025 贵州医科大学基础医学院贵阳550025 贵州医科大学环境污染与疾病监控教育部重点实验室贵阳550025

目的构建编码MAGE-A3的真核表达载体,体外转录获得MAGE-A3 mRNA,在哺乳动物细胞NIH/3T3中表达MAGE-A3蛋白。方法通过逆转录PCR从三阴型乳腺癌细胞系4T1中扩增得到MAGE-A3编码基因,插入到载体pcDNA3.1(+)中,成功构建重组表达载体pcDNA3.1... 详细信息

目的构建编码MAGE-A3的真核表达载体,体外转录获得MAGE-A3 mRNA,在哺乳动物细胞NIH/3T3中表达MAGE-A3蛋白。方法通过逆转录PCR从三阴型乳腺癌细胞系4T1中扩增得到MAGE-A3编码基因,插入到载体pcDNA3.1(+)中,成功构建重组表达载体pcDNA3.1-MAGE作为体外转录RNA的模板。利用T7体外转录试剂盒获得MAGE-A3 RNA,添加poly(A)尾后进行mRNA纯化。将纯化后的MAGE-A 3 mRNA转染到NIH/3T3细胞中,Western blot实验检测MAGE-A3蛋白的表达。结果pcDNA3.1-MAGE-A3正确表达和构建。体外转录MAGE-A3 mRNAA(260)/A(280)为1.92,浓度是872.3 ng/μl,长度约为500 bp。转染MAGE-A3 mRNA后,NIH/3T3能表达大小约35 ku的MAGE-A3蛋白。结论成功构建编码MAGE-A3的真核表达载体,体外转录获得纯度较高的MAGE-A3 mRNA,该mRNA能在NIH/3T3细胞中表达MAGE-A3蛋白。

关键词： MAGE-A3 体外转录mRNA 蛋白表达

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