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Wnt信号通路与自身免疫调节因子共同参与胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞的分化

中国组织工程研究 2024年第13期28卷 1996-2001页

作者：文廷浩李远迪何可可宋雯茜王先斌高杰苏敏胡蓉贵州医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室贵州省贵阳市550025 贵州医科大学转化医学研究中心贵州省贵阳市550025 贵州医科大学细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室贵州省再生医学重点实验室中国医学科学院成体干细胞转化研究重点实验室贵州省贵阳市550025

背景:自身免疫调节因子(autoimmune regulator gene,Aire)及Wnt信号通路在小鼠胚胎干细胞多能性的维持及分化中都发挥着重要作用,但Wnt信号与Aire是否参与了小鼠胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞的分化尚未可知。目的:探讨Wnt信号通路和自身... 详细信息

背景:自身免疫调节因子(autoimmune regulator gene,Aire)及Wnt信号通路在小鼠胚胎干细胞多能性的维持及分化中都发挥着重要作用,但Wnt信号与Aire是否参与了小鼠胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞的分化尚未可知。目的:探讨Wnt信号通路和自身免疫调节因子与胚胎干细胞分化的关系。方法:采用两步分化方法定向诱导小鼠胚胎干细胞分化为内胚层再分化为胸腺上皮祖细胞,然后用Aire shRNA慢病毒感染小鼠胚胎干细胞,嘌呤霉素筛选单克隆稳定株,再采用两步分化方法进行诱导分化,分别于定向诱导分化第0,3,10天,采用细胞免疫荧光、流式细胞术、Western blot、Real-Time qPCR检测相关基因及蛋白的表达变化。结果与结论:①定向诱导分化第0天,免疫荧光染色显示SSEA1、OCT4表达呈阳性;②定向诱导分化第3天,免疫荧光染色显示SOX17、FOXA2表达呈双阳性;③定向诱导分化第10天,流式细胞术结果显示EPCAM1、K5、K8表达呈阳性;④与未分化的小鼠胚胎干细胞相比,诱导分化的胸腺上皮祖细胞中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β蛋白表达升高,Aire蛋白表达降低;⑤与未分化的小鼠胚胎干细胞相比,诱导分化的胸腺上皮祖细胞中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β及Aire mRNA表达升高;⑥与正常培养的小鼠胚胎干细胞及其最终分化的胸腺上皮祖细胞相比,敲低Aire基因的小鼠胚胎干细胞及其最终分化的胸腺上皮祖细胞中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β蛋白表达水平降低。综上所述,Wnt信号通路和Aire共同参与了小鼠胚胎干细胞定向诱导分化为小鼠胸腺上皮祖细胞的过程。

关键词： Wnt信号通路自身免疫调节因子胚胎干细胞胸腺上皮祖细胞内胚层细胞

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丁酸钠、Hemin及DMSO诱导K562红系分化作用的差异

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安徽医科大学学报 2021年第5期56卷 746-751页

作者：刘含杨红兰莫晶张鹏范安然何志旭贵州医科大学组织工程生物医药技术国家地方联合工程实验室组织工程与干细胞实验中心贵州省再生医学重点实验室贵阳550004 贵州医科大学免疫学教研室贵阳550004 中国医学科学院成体干细胞转化研究重点实验室贵阳550004

目的比较丁酸钠、氯化血红素(Hemin)及DMSO诱导K562红系分化作用的差异。方法检测在1.5 mmol/L丁酸钠,20μmol/L Hemin及2%DMSO处理下,K562细胞增殖、细胞周期、四甲基联苯胺(TMB)染色阳性率及CD235a表达量的变化。结果连续药物暴露120 ... 详细信息

目的比较丁酸钠、氯化血红素(Hemin)及DMSO诱导K562红系分化作用的差异。方法检测在1.5 mmol/L丁酸钠,20μmol/L Hemin及2%DMSO处理下,K562细胞增殖、细胞周期、四甲基联苯胺(TMB)染色阳性率及CD235a表达量的变化。结果连续药物暴露120 h后结果显示,丁酸钠对K562细胞增殖有抑制作用,48~72 h细胞阻滞于G0/G1;96~120 h细胞阻滞于G2/M期,120 h TMB阳性率为(22.02±2.27)%。Hemin对K562细胞的增殖及细胞周期均无影响;120 h TMB阳性率为(90.83±2.69)%。DMSO处理的K562细胞其G0/G1期比例增多,但暴露时间大于72 h时,细胞增殖与对照组差异无统计学意义;120 h TMB阳性率为(1.84±0.48)%,相较于对照组阳性率(2.89±0.18)%差异无统计学意义。丁酸钠和Hemin处理120 h后血型糖蛋白A(CD235a)的表达水平较对照组和DMSO处理组升高,且2组间差异无统计学意义。DMSO处理组CD235a与对照组差异无统计学意义。结论通过综合比较红系分化诱导前后K562细胞增殖、细胞周期、TMB阳性率及CD235a表达量的变化发现,Hemin是较丁酸钠和DMSO体外诱导K562红系分化更有效的化学试剂。

关键词：丁酸钠氯化血红素 DMSO K562 红系分化

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人脐带间充质干细胞对T细胞活化介导的肺动脉平滑肌细胞增殖抑制及机制研究

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第三军医大学学报 2019年第22期41卷 2174-2180页

作者：吴西军刘庆刘俊峰杨小燕何志旭贵州医科大学细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室贵州省再生医学重点实验室贵阳550004 贵州医科大学中国医学科学院成体干细胞转化研究重点实验室贵阳550004 贵州医科大学免疫学教研室贵阳550004 贵州医科大学附属医院呼吸内科贵阳550004 贵州医科大学附属医院儿童血液肿瘤科贵阳550004

目的阐释人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hu-MSCs)抑制T淋巴细胞活化介导的肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)增殖的作用及可能的调节机制。方法复苏并培养hu-MSCs和大鼠来源的PASMCs、T细胞,将实验分为PASMCs对照组、T细胞刺激组(PASMCs+T淋巴细胞)、MSC干预组(PASMCs+T淋巴细胞+MSC)、英夫利西单抗干预组(PASMCs+T淋巴细胞+英夫利西单抗)、TNF-α刺激组(PASMCs+T淋巴细胞+MSC+TNF-α)。通过荧光分光光度计、RT-qPCR、倒置荧光显微镜观察等方法研究钙调磷酸酶、T淋巴细胞核因子的变化。结果 T淋巴细胞刺激组TNF-α浓度明显升高(P<0.01);MSCs与英夫利西单抗均能明显降低其TNF-α浓度(P<0.01)。与单纯PASMCs对照组比较,T淋巴细胞刺激组PASMCs的增殖能力明显增强(P<0.01),胞浆中游离钙离子的浓度明显升高(P<0.01),胞内CaN的表达(P<0.01)和活性(P<0.01)均显著上调,NFATc2的表达和活性亦显著上调(P<0.01);与T淋巴细胞刺激组相比,MSCs干预组、英夫利西单抗干预组PASMCs的增殖被明显抑制(P<0.01),胞浆中游离钙离子的浓度均明显下降(P<0.01),胞内CaN的表达(P<0.01)和活性(P<0.01)均显著下调,NFATc2的表达(P<0.01)和活性亦下调;外源TNF-α可有效逆转MSC的干预作用,其作用与T淋巴细胞刺激组几乎相当。结论 hu-MSCs可以通过改变CaN、NFATc2的表达和活化状态,抑制T淋巴细胞活化,抑制炎症因子TNF-α导致的PASMCs增殖。

关键词：间充质干细胞肺动脉平滑肌细胞细胞增殖肿瘤坏死因子α 钙调磷酸酶 T淋巴细胞核因子

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红系祖细胞在造血缺陷斑马鱼体内的移植

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中国比较医学杂志 2019年第5期29卷 84-89页

作者：李志操黄波向文碧孙琮杰吴西军周艳华何志旭舒莉萍贵州医科大学细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室组织工程与干细胞实验中心临床医学院儿科学教研室贵州省再生医学重点实验室贵阳550004 中国医学科学院成体干细胞转化研究重点实验室贵阳550004 遵义医科大学附属医院儿科学教研室贵州遵义563003

目的评估红系祖细胞在先天原始造血缺陷cloche^(-/-)突变体斑马鱼体内的移植效果。方法收集绿色荧光标记红系祖细胞的转基因系zTg(gata1:EGFP)斑马鱼胚胎,制备成单细胞悬液,经流式细胞仪分选出携带绿色荧光的gata1^+细胞,利用显微注射... 详细信息

目的评估红系祖细胞在先天原始造血缺陷cloche^(-/-)突变体斑马鱼体内的移植效果。方法收集绿色荧光标记红系祖细胞的转基因系zTg(gata1:EGFP)斑马鱼胚胎,制备成单细胞悬液,经流式细胞仪分选出携带绿色荧光的gata1^+细胞,利用显微注射技术将gata1^+细胞移植到42hpf的cloche^(-/-)突变体斑马鱼心脏中,采用体视荧光显微镜追踪观察移植后的红系祖细胞在cloche^(-/-)突变体斑马鱼中的表达情况。结果成功分选出携带绿色荧光的gata1^+细胞,并在移植后2 h可观察到携带绿色荧光的gata1^+细胞逐渐增殖扩散且16 h持续有绿色荧光表达。结论红系祖细胞有重建造血的潜力,为进一步研究红系祖细胞移植后的功能鉴定提供实验依据。

关键词：红系祖细胞斑马鱼移植 cloche^-/-突变

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衰老对小鼠角膜中Pax6和Wnt7a表达的影响

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中国老年学杂志 2024年第17期44卷 4160-4164页

作者：高杰王明彪文邦红范雪朱婕胡蓉苏敏贵州医科大学组织学与胚胎学教研室贵州贵安新区561113 贵州医科大学转化医学研究中心贵州贵安新区561113 贵州医科大学细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室贵州省再生医学重点实验室中国医学科学院成体干细胞转化研究重点实验室贵州贵安新区561113

目的研究衰老对小鼠角膜中配对盒基因(Pax)6和Wnt7a表达的影响,探索其与角膜缘干细胞(LSCs)衰老的关系。方法60只雌性昆明小鼠分为3组:青年组(2月龄),中年组(10月龄),老年组(18月龄)各20只。苏木素-伊红(HE)染色观察角膜形态结构改变,... 详细信息

目的研究衰老对小鼠角膜中配对盒基因(Pax)6和Wnt7a表达的影响,探索其与角膜缘干细胞(LSCs)衰老的关系。方法60只雌性昆明小鼠分为3组:青年组(2月龄),中年组(10月龄),老年组(18月龄)各20只。苏木素-伊红(HE)染色观察角膜形态结构改变,免疫荧光染色和流式细胞术检测p63、Pax6和Wnt7a分布和表达,实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测p63、Pax6和Wnt7a mRNA相对表达。结果与青年组相比,随着月龄的增加,小鼠角膜上皮的厚度明显变薄,角膜厚度明显增厚,p63、Pax6和Wnt7a表达均逐渐明显减少(P<0.05)。结论随着增龄,角膜呈老化趋势,可能与Pax6-Wnt7a调控有关。

关键词：角膜缘干细胞衰老 p63 配对盒基因(Pax6) Wnt7a

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Pax6基因表达对过氧化氢诱导骨髓间充质干细胞衰老的影响

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中国组织工程研究 2024年第31期28卷 4921-4925页

作者：高杰邹星星文邦红李远迪苏敏胡蓉贵州医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室贵州省贵阳市550025 贵州医科大学转化医学研究中心贵州省贵阳市550025 贵州省高等学校自身免疫病研究重点实验室贵州省贵阳市550025 贵州医科大学细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室贵州省再生医学重点实验室中国医学科学院成体干细胞转化研究重点实验室贵州省贵阳市550025

背景:多种眼科疾病的发生发展与过度氧化应激密切相关,抑制氧化应激反应可能会产生预防和治疗效果。目的:探究Pax6基因表达对过氧化氢诱导的小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)衰老的影响。方法:复苏BM-... 详细信息

背景:多种眼科疾病的发生发展与过度氧化应激密切相关,抑制氧化应激反应可能会产生预防和治疗效果。目的:探究Pax6基因表达对过氧化氢诱导的小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)衰老的影响。方法:复苏BM-MSCs、Pax6/BM-MSCs、shPax6/BM-MSCs,经过氧化氢处理24 h后进行β-半乳糖苷酶染色,流式细胞术检测增殖指标Ki67的表达和细胞凋亡情况,RT-PCR检测衰老相关分子Wnt7a、p21、p53的表达。结果与结论:①经过氧化氢处理后,3组细胞显示衰老表型,β-半乳糖苷酶染色阳性;与BM-MSCs组相比,Pax6/BM-MSCs组内阳性细胞表达较少,shPax6/BM-MSCs组内阳性细胞表达较多,差异有显著性意义(P<0.05);②流式细胞术结果显示:与BM-MSCs组相比,Pax6/BM-MSCs组细胞内Ki67阳性表达增加,细胞凋亡水平降低,shPax6/BM-MSCs组细胞内Ki67阳性表达降低,细胞凋亡水平升高,差异有显著性意义(P<0.05);③RT-PCR检测结果显示:与BM-MSCs组相比,Pax6/BM-MSCs组的Wnt7a、p53、p21表达量降低,shPax6/BM-MSCs组的Wnt7a、p53、p21表达量增加,差异有显著性意义(P<0.05);④结果表明:Pax6过表达能够对抗过氧化氢诱导的BM-MSCs衰老进程,可能与Wnt信号通路有关。

关键词：骨髓间充质干细胞 Pax6 Wnt7a 过氧化氢凋亡衰老

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住院脑梗死患者抑郁相关因素分析及风险预警模型的构建

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现代预防医学 2021年第10期48卷 1901-1905页

作者：张丽娟许键炜冯占辉李委周谊霞彭爽罗娟张亦慷贵州医科大学护理学院贵州医科大学基础医学院贵州医科大学细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室贵州省再生医学重点实验室中国医学科学院成体干细胞转化研究重点实验室贵州医科大学附属医院神经内科毕节医学高等专科学校护理系贵州中医药大学护理学院贵州医科大学临床医学院

目的构建脑梗死后抑郁风险预警模型,为医护人员早期、快速识别高危患者,及时行干预措施提供理论依据。方法选取住院脑梗死患者142例,单因素分析相关资料;二分类logistic回归分析确定脑梗死后抑郁的独立危险因素并建立风险预警模型;ROC... 详细信息

目的构建脑梗死后抑郁风险预警模型,为医护人员早期、快速识别高危患者,及时行干预措施提供理论依据。方法选取住院脑梗死患者142例,单因素分析相关资料;二分类logistic回归分析确定脑梗死后抑郁的独立危险因素并建立风险预警模型;ROC曲线判断各独立指标与风险预警模型诊断的准确性;交叉验证法检验风险预警模型效能。结果脑梗死后抑郁的发生率为33.80%。单因素分析显示脑梗死后抑郁与NIHSS评分、Barthel指数、MRS、FSS、对支持的利用度、文化程度、家庭人均月收入、居住地、手术史、总胆固醇、甘油三酯有关(P<0.05)。二分类logistic回归分析显示手术史、Barthel指数、FSS是脑梗死后抑郁的独立危险因素。手术史、Barthel指数、FSS及基于独立危险因素建立的风险预警模型ROC曲线下面积/灵敏度/特异度分别为0.599/72.9%/46.80%、0.744/64.6%/77.70%、0.829/68.8%/85.10%、0.928/72.90%/97.87%,交叉检验风险预警模型准确率为85.92%。结论手术史、Barthel指数、FSS是脑梗死患者发生抑郁的独立危险因素,基于此建立的风险预警模型对脑梗死后抑郁预警效果良好。

关键词：脑梗死抑郁 Barthel指数疲劳严重程度风险预警模型

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rpl15在斑马鱼胚胎中的表达形式探究

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中国比较医学杂志 2021年第8期31卷 9-15页

作者：周唯君彭涛周栋珍杨懿琛周艳华李化何志旭舒莉萍贵州医科大学细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室贵州省再生医学重点实验室基础医学院免疫学教研室贵阳550004 中国医学科学院成体干细胞转化研究重点实验室贵阳550004 遵义医科大学附属医院儿科学教研室贵州遵义563003 贵州大学贵阳550025

目的探究rpl15基因在野生型斑马鱼胚胎中的表达形式。方法利用NCBI和Ensemble数据库进行rpl15基因的共线性分析和Rpl15蛋白质序列相似性分析,使用MEGA X软件绘制进化树;构建pCS2^(+)-rpl15重组质粒,再利用T3聚合酶制备地高辛标记的rpl1... 详细信息

目的探究rpl15基因在野生型斑马鱼胚胎中的表达形式。方法利用NCBI和Ensemble数据库进行rpl15基因的共线性分析和Rpl15蛋白质序列相似性分析,使用MEGA X软件绘制进化树;构建pCS2^(+)-rpl15重组质粒,再利用T3聚合酶制备地高辛标记的rpl15反义RNA探针,用全胚胎原位杂交检测rpl15基因的mRNA水平的表达;通过Western blot检测24、48和72 hpf斑马鱼胚胎中Rpl15蛋白的表达。结果在进化过程中,rpl15基因相对保守。构建了pCS2^(+)-rpl15重组质粒,原位杂交结果显示在24 hpf,rpl15基因在斑马鱼的几乎所有细胞中广泛表达;到48 hpf,rpl15在中枢神经系统的表达最强并且在胰腺的表达也开始显现;72 hpf仍然可见rpl15在后脑中的表达以及胰腺、肝和肠道中的表达。Western blot结果显示24、48和72 hpf斑马鱼胚胎中Rpl15蛋白的相对表达量随时间增加而增多。结论系统观察了斑马鱼发育过程中rpl15的表达部位及表达水平的变化,为斑马鱼rpl15缺失模型的建立提供了实验基础。

关键词：斑马鱼 rpl15基因原位杂交基因表达反义mRNA 胚胎发育

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骨髓间充质干细胞对衰老猕猴胸腺及脾脏结构和功能的影响

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中国组织工程研究 2023年第19期27卷 2953-2959页

作者：潘杭朱向情何洁杨再玲田川吕冠柯阮光萍叶丽何志旭舒莉萍潘兴华贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心贵州省贵阳市550004 中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室、云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室、昆明市干细胞与再生医学重点实验室、基础医学实验室云南省昆明市650032 贵州医科大学基础医学院免疫学教研室、细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室、贵州省再生医学重点实验室、省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室、中国医学科学院成体干细胞转化研究重点实验室贵州省贵阳市550004 贵州医科大学附属医院肿瘤医院贵州省贵阳市550004 四川省医学科学院、四川省人民医院四川省成都市610000 遵义医科大学附属医院儿科学教研室贵州省遵义市563100

背景:随着年龄的增长,脾脏的结构和功能发生改变,胸腺在青春期之后逐渐萎缩退化,导致机体发生免疫功能障碍。目的:探讨骨髓间充质干细胞对衰老猕猴胸腺及脾脏结构和功能的作用。方法:筛选出平均年龄25岁老年猕猴6只,随机分为老年组和老... 详细信息

背景:随着年龄的增长,脾脏的结构和功能发生改变,胸腺在青春期之后逐渐萎缩退化,导致机体发生免疫功能障碍。目的:探讨骨髓间充质干细胞对衰老猕猴胸腺及脾脏结构和功能的作用。方法:筛选出平均年龄25岁老年猕猴6只,随机分为老年组和老年治疗组各3只;老年治疗组猕猴经股静脉输注超顺磁性铁纳米颗粒标记的第4代骨髓间充质干细胞(1×10^(7)个/kg),1次/d,连续输注3 d,老年组猕猴在同一时间输注等体积的生理盐水;猕猴最后一次输注骨髓间充质干细胞5个月后给予安乐死处理,取出胸腺以及脾脏组织;苏木精-伊红染色观察胸腺组织和脾脏组织的结构变化;免疫荧光染色分析胸腺组织中各种T细胞亚群以及衰老相关基因蛋白P21的表达量变化;免疫组织化学染色分析脾脏组织中各种T细胞亚群以及衰老相关基因蛋白P21的表达量变化;安乐死处理猕猴之前抽取各组猕猴股静脉血5 mL,运用酶联免疫分析外周血血清中衰老相关分泌表型肿瘤坏死因子α和白细胞介素1α的分泌水平。结果与结论:①超顺磁性铁纳米颗粒标记的骨髓间充质干细胞经过股静脉输注入猕猴体内能够成功定植在衰老胸腺和脾脏组织中发挥作用;②骨髓间充质干细胞移植治疗后,衰老猕猴中胸腺部分组织出现清晰的皮质与髓质交界,脂肪细胞减少,出现胸腺小体,向正常的胸腺组织结构转变;衰老猕猴中脾脏组织出现清晰的红髓与白髓分界,脾小体的边缘多完整,且巨噬细胞减少,向正常的脾脏组织结构转变;③与老年组相比,老年治疗组衰老胸腺和脾脏组织中CD3^(+)、CD4^(+)以及CD8^(+)T细胞的表达量呈现增高的趋势,老年治疗组衰老胸腺和脾脏组织中P21蛋白的表达量呈现显著下降趋势;④与老年组相比,老年治疗组外周血中衰老相关分泌表型肿瘤坏死因子α以及白细胞介素1α的分泌水平呈现显著下降趋势;⑤上述结果表明,通过骨髓间充质干细胞的移植治疗,能够改善老年猕猴胸腺及脾脏组织的结构和功能。

关键词：干细胞骨髓间充质干细胞猕猴胸腺脾脏抗衰老免疫衰老相关分泌表型

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三种淀粉样前体蛋白胞外结构域突变体的建立及功能验证

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贵州医科大学学报 2019年第6期44卷 626-631页

作者：张鹏崔冬冰舒莉萍范安然贵州医科大学细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室组织工程与干细胞实验中心贵州省再生医学重点实验室贵州贵阳550004 中国医学科学院成体干细胞转化研究重点实验室贵州贵阳550004

目的:构建3种淀粉样前体蛋白(APP)胞外结构域突变体细胞株并进行功能的初步验证。方法:通过Touch down PCR的方法扩增E1结构域缺失的APP695片段以及E1和信号肽双缺失的片段,采用融合PCR的方法扩增E2结构域缺失的APP695片段,并将获得的... 详细信息

目的:构建3种淀粉样前体蛋白(APP)胞外结构域突变体细胞株并进行功能的初步验证。方法:通过Touch down PCR的方法扩增E1结构域缺失的APP695片段以及E1和信号肽双缺失的片段,采用融合PCR的方法扩增E2结构域缺失的APP695片段,并将获得的片段连接于pCMV-APP695载体中得到APP胞外结构域突变体质粒;质粒转染CHO细胞后,添加G418筛选表达APP胞外结构域突变体的单克隆细胞系;通过Western blot方法检测APP胞外结构域突变体的表达及胞外分泌水平,分析信号肽对该突变体分泌的影响。结果:成功获得了APP的E1结构域突变体、E1/信号肽双缺失突变体以及E2结构域突变体细胞株,且APP突变体可以正常表达和分泌,但是信号肽缺失后APP突变体可以表达、而不能分泌。结论:APP的E1和E2结构域对APP蛋白的胞外分泌无影响。

关键词：淀粉样前体蛋白胞外结构域突变体信号肽神经退行性疾病

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