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中华地方病学杂志 2018年第4期37卷 271-277页

作者：王胜远邱志伟官志忠刘艳洁贵州医科大学附属医院病理科贵阳550004 贵州医科大学附属医院地方病与少数民族性疾病教育部重点实验室贵州省分子生物学重点实验室贵阳550004

目的观察细胞外调节蛋白激酶（Erk）1／2、磷酸化（phospho）-Erk1／2、基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMP-9在实验性慢性氟中毒大鼠脑组织中的改变及硫酸软骨素的治疗作用与机制。方法采用成组设计及细胞培养方法，将人神经母细胞瘤SH-S... 详细信息

目的观察细胞外调节蛋白激酶（Erk）1／2、磷酸化（phospho）-Erk1／2、基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMP-9在实验性慢性氟中毒大鼠脑组织中的改变及硫酸软骨素的治疗作用与机制。方法采用成组设计及细胞培养方法，将人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞分为对照组（正常培养液）、染氟组（氟离子：4.0 mmol／L）和硫酸软骨素处理组（氟离子：4.0 mmol／L、硫酸软骨素：0.4 g／L）。染氟24 h，电子显微镜观察SH-SY5Y细胞超微结构变化；染氟72 h，锥虫蓝染色观察细胞存活数量并计算细胞存活率。15只清洁级SD大鼠，按体质量（100 - 120 g）采用随机数字表法分为对照组（饮用自来水，含氟量〈 0.5 mg／L）、染氟组（氟离子：10.0 mg／L）和硫酸软骨素处理组（氟离子：10.0 mg／L，染氟90 d后0.66 mg／kg硫酸软骨素连续腹腔注射5 d），每组5只，实验周期为95 d。采用Morris水迷宫方法检测大鼠行为学变化，蛋白质免疫印迹法检测脑组织中Erk1／2、phospho-Erk1／2、MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平，免疫组织化学法检测大鼠脑组织海马CA2区phospho-Erk1／2、MMP-2、MMP-9的表达及分布。结果细胞体外培养结果显示，电镜下硫酸软骨素处理组细胞内吞饮小泡较多，有线粒体及内质网肿胀但相对染氟组较少。硫酸软骨素处理组SH-SY5Y细胞存活率［（92 ± 23）%］和细胞数［（7.83 ± 1.38） × 10^6个／ml］明显高于染氟组［（55 ± 2）%、（2.19 ± 1.26） × 10^6个／ml，P均〈 0.05］。动物实验结果显示，对照组与硫酸软骨素处理组大鼠趋向式搜索次数（2.20 ± 1.09、3.40 ± 1.34）高于染氟组（0.40 ± 0.54，P均〈 0.05）。染氟组phospho-Erk1／2的蛋白表达（3.26 ± 0.88）较对照组和硫酸软骨素处理组升高（1.53 ± 0.28、2.36 ± 0.87，P均〈 0.05）。免疫组织化学结果显示，硫酸软骨素处理组phospho-Erk1／2平均灰度值（220.20 ± 3.09）显著高于对照组和染氟组（100.00 ± 0.00、130.98 ± 1.27，P均〈 0.05）；染氟组MMP-2平均灰度值（294.52 ± 5.18）显著高于对照组和硫酸软骨素处理组（100.00 ± 0.00、117.95 ± 1.55，P均〈 0.05）；染氟组和硫酸软骨素处理组MMP-9平均灰度值（993.64 ± 3.66、1 167.30 ± 2.39）均显著高于对照组（100.00 ± 0.00， P均〈 0.05）。结论 Erk1／2通路可能通过调节MMP-2和MMP-9表达维持细胞生存内环境稳定。硫酸软骨素对慢性氟中毒所致的神经损害具有一定的拮抗作用。

关键词：氟硫酸软骨素细胞外调节蛋白激酶1/2 基质金属蛋白酶-2 基质金属蛋白酶-9

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α7 nAChR通过提高抗氧化能力提升AD模型动物学习记忆能力及抗神经毒性作用

α7 nAChR通过提高抗氧化能力提升AD模型动物学习记忆能力及抗神...

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2019全国老年痴呆与认知障碍相关疾病学术大会

作者：曹坤向洁董阳婷徐毅冉龙艳李毅官志忠贵州医科大学附属医院病理科贵州医科大学地方病与少数民族疾病教育部重点实验室贵州省分子生物学重点实验室

目的α7尼古丁型乙酰胆碱能受体(α7 nAChR)对学习与记忆功能密切相关,但其作用机制尚不十分清楚。为此,本研究选用APP/PS1双转基因动物模型,应用α7 nAChR激动剂/抑制剂研究nAChR是否能对抗Aβ引起的神经毒性作用,改善学习与记忆功能... 详细信息

目的α7尼古丁型乙酰胆碱能受体(α7 nAChR)对学习与记忆功能密切相关,但其作用机制尚不十分清楚。为此,本研究选用APP/PS1双转基因动物模型,应用α7 nAChR激动剂/抑制剂研究nAChR是否能对抗Aβ引起的神经毒性作用,改善学习与记忆功能。方法选择α7 nAChR激动剂PNU-282987、α7 nAChR抑制剂甲基牛扁碱(MLA)分别处理6月龄、10月龄APP/PS1双转基因小鼠,水迷宫测定小鼠空间学习及记忆能力;HE染色观察APP/PS1双转基因小鼠脑组织病理学改变;免疫组织化学染色检测小鼠大脑内老年斑分布及表达;生物化学方法测定小鼠大脑及血清中丙二醛(MDA)含量、SOD及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性;Western蛋白印迹法检测小鼠海马APP代谢途径中α分泌型淀粉样前体蛋白(αAPP)、β分泌型淀粉样前体蛋白(βAPP)、β淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)、BACE2及解聚素金属蛋白酶结构域蛋白10(ADAM10),抗氧化应激通路核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶1 (HO-1)、突触素(SYN)和突触相关蛋白(SNAP-25)等蛋白的表达水平。结果在6月龄、10月龄小鼠中,与对照组相比,PNU处理组小鼠的平台逗留时间明显升高,穿越平台次数明显增多,逃避潜伏期也有相应缩短;而MLA处理组小鼠平台逗留时间,穿越平台次数明显减少,逃避潜伏期则相应延长。6月龄APP/PS1转基因小鼠中,PNU处理组小鼠脑组织MDA含量较阳性对照组降低,SOD及GSH-Px活性较阳性对照组明显升高;MAL处理组小鼠脑组织MDA含量较阳性对照组升高,而SOD及GSH-Px活性较阳性对照组明显降低。10月龄APP/PS1转基因小鼠中,氧化应激指标略有加重,血清中氧化应激水平变化与脑组织中相似。Western蛋白印迹法结果显示,在6月龄小鼠中,PNU能够上调Nrf2/HO-1,ADAM10,BACE2,αAPP,SYN和SNAP-25蛋白表达水平,MLA可降低BACE1,αAPP,SYN和SNAP-25蛋白表达水平;在10月龄小鼠中,PNU能够上调Nrf2/HO-1,ADAM10,αAPP,SYN和SNAP-25蛋白表达水平,MLA可降低ADAM10,αAAP,SYN,SNP-25蛋白表达水平。结论α7 nAChR可通过提高抗氧化能力来提升AD动物学习记忆能力及抗神经毒性作用:①激活α7 nAChR能改善APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力,而抑制α7 nAChR可加重该动物模型学习记忆障碍;②激活α7 nAChR能够活化Nrf/HO-1抗氧化应激通路和降低氧化应激水平;③α7 nAChR可调节APP代谢相关酶,促进αAPP生成,抑制Aβ生成及增强SYN、SNAP-25蛋白表达,改善突触可塑性。

关键词： α7尼古丁型乙酰胆碱能受体学习记忆氧化应激突触可塑性

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白藜芦醇通过激活SIRT1在阿尔茨海默病发病机制中的神经保护作用

白藜芦醇通过激活SIRT1在阿尔茨海默病发病机制中的神经保护作用

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2019全国老年痴呆与认知障碍相关疾病学术大会

作者：曹坤向洁董阳婷徐毅龙艳李毅官志忠贵州医科大学附属医院病理科贵州医科大学地方病与少数民族疾病教育部重点实验室贵州省分子生物学重点实验室

目的沉默信息调节因子（SIRT）是一组依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）激活的具有去乙酰化作用的蛋白。本研究通过观察慢β-淀粉样肽前体蛋白（APP）高表达转基因小鼠及经Aβ处理的体外培养神经细胞中SIRT1的表达,探讨其在AD中枢神经... 详细信息

目的沉默信息调节因子（SIRT）是一组依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）激活的具有去乙酰化作用的蛋白。本研究通过观察慢β-淀粉样肽前体蛋白（APP）高表达转基因小鼠及经Aβ处理的体外培养神经细胞中SIRT1的表达,探讨其在AD中枢神经损伤中的作用及其相关分子机制。方法用4月龄及8月龄APPswe/PSEN1dE9双转基因小鼠模型（APP高表达）,经灌胃给予20 mg·kg白藜芦醇（RSV）-SIRT1激活剂、20 mg·kg Suramin-SIRT1抑制剂、对照组动物给予生理盐水,处理时间为2个月。细胞模型采用0.5μmol·L Aβ寡聚体（AβO）、10μmol·L RSV、200 mg·L Suramin、20μmol·L ZLN005及过氧化物酶体增殖物激活受体共激活因子1 （PGC-1α）转染质粒分别或合并处理,孵育时间为24～48 h。用免疫荧光方法检测SIRT1在脑组织中的表达及定位;用CCK-8试验检测细胞的存活率;流式细胞技术或激光共聚焦显微镜检测体外培养细胞凋亡;用ELISA试剂盒检测血清、脑脊液中α-可溶性分泌型APP片断（αAPP）及脑组织中不可溶性Aβ含量;用蛋白印迹、免疫荧光、实时荧光定量PCR及NAD检测试剂盒分别检测小鼠脑组织不同脑区和体外培养细胞中各种相关蛋白、mRNA表达水平及NAD水平;用Morris水迷宫检测小鼠学习记忆能力。结果不同月龄双转基因小鼠大脑海马及皮质区均出现数量不等的老年斑,且其数量及分布程度随月龄增加而增加;应用RSV处理双转基因小鼠后,其学习记忆能力及脑组织病理学变化明显改善,而Suramin则可进一步加重这些改变。双转基因小鼠海马、皮质区及加AβO处理神经元内SIRT1蛋白及mRNA表达均出现不同程度降低;同时,PGC-1α蛋白表达明显降低;α-分泌酶（ADAM10）及β-分泌酶（BACE2）蛋白表达出现不同程度降低,而β-分泌酶（BACE1）明显升高;另外,双转基因小鼠血清及脑脊液中αAPP含量明显降低;脑组织中不可溶性Aβ水平明显增加,动物及细胞模型中NAD含量明显降低;同时,AβO使细胞凋亡明显升高;而上述改变均可被RSV逆转,动物老年斑明显减少。而随着PGC-1α的沉默,SIRT1不能降低细胞凋亡;而激活PGC-1α后,即使抑制SIRT1的表达,也能调控细胞凋亡。结论①APP高表达转基因小鼠脑组织及经AβO的神经细胞中SIRT表达的降低,可能是导致老年斑大量聚集的原因之一。②RSV通过增加SIRT的表达,减少AβO诱导的细胞毒性作用,其机制可能涉及SIRT激活后调控其下游的一系列蛋白,从而减少细胞凋亡,进而降低细胞老化所引起的学习记忆能力的改变。③SIRT激活后通过活化AD AM 10,增强APP非淀粉代谢途径,促进sAPPα分泌,从而减少Aβ在大脑中的沉积。

关键词：沉默信息调节因子白藜芦醇 Aβ蛋白 Suramin α-分泌酶 β-分泌酶

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白藜芦醇通过激活SIRT1在阿尔茨海默病发病机制中的神经保护作用

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中国药理学与毒理学杂志 2019年第6期33卷 423-423页

作者：曹坤向洁董阳婷徐毅龙艳李毅官志忠贵州医科大学附属医院病理科贵州贵阳550004 贵州医科大学地方病与少数民族疾病教育部重点实验室贵州贵阳550004 贵州省分子生物学重点实验室贵州贵阳550004

目的沉默信息调节因子(SIRT)是一组依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)激活的具有去乙酰化作用的蛋白。本研究通过观察慢β-淀粉样肽前体蛋白(APP)高表达转基因小鼠及经Aβ处理的体外培养神经细胞中SIRT1的表达,探讨其在AD中枢神经损伤... 详细信息

目的沉默信息调节因子(SIRT)是一组依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)激活的具有去乙酰化作用的蛋白。本研究通过观察慢β-淀粉样肽前体蛋白(APP)高表达转基因小鼠及经Aβ处理的体外培养神经细胞中SIRT1的表达,探讨其在AD中枢神经损伤中的作用及其相关分子机制。方法用4月龄及8月龄APPswe/PSEN1d E9双转基因小鼠模型(APP高表达),经灌胃给予20 mg·kg-1白藜芦醇(RSV)-SIRT1激活剂、20 mg·kg-1Suramin-SIRT1抑制剂、对照组动物给予生理盐水,处理时间为2个月。细胞模型采用0.5μmol·L-1Aβ寡聚体(AβO)、10μmol·L-1RSV、200 mg·L-1Suramin、20μmol·L-1ZLN005及过氧化物酶体增殖物激活受体共激活因子1(PGC-1α)转染质粒分别或合并处理,孵育时间为24~48 h。用免疫荧光方法检测SIRT1在脑组织中的表达及定位;用CCK-8试验检测细胞的存活率;流式细胞技术或激光共聚焦显微镜检测体外培养细胞凋亡;用ELISA试剂盒检测血清、脑脊液中α-可溶性分泌型APP片断(αAPP)及脑组织中不可溶性Aβ含量;用蛋白印迹、免疫荧光、实时荧光定量PCR及NAD+检测试剂盒分别检测小鼠脑组织不同脑区和体外培养细胞中各种相关蛋白、m RNA表达水平及NAD+水平;用Morris水迷宫检测小鼠学习记忆能力。结果不同月龄双转基因小鼠大脑海马及皮质区均出现数量不等的老年斑,且其数量及分布程度随月龄增加而增加;应用RSV处理双转基因小鼠后,其学习记忆能力及脑组织病理学变化明显改善,而Suramin则可进一步加重这些改变。双转基因小鼠海马、皮质区及加AβO处理神经元内SIRT1蛋白及m RNA表达均出现不同程度降低;同时,PGC-1α蛋白表达明显降低;α-分泌酶(ADAM10)及β-分泌酶(BACE2)蛋白表达出现不同程度降低,而β-分泌酶(BACE1)明显升高;另外,双转基因小鼠血清及脑脊液中αAPP含量明显降低;脑组织中不可溶性Aβ水平明显增加,动物及细胞模型中NAD+含量明显降低;同时,AβO使细胞凋亡明显升高;而上述改变均可被RSV逆转,动物老年斑明显减少。而随着PGC-1α的沉默,SIRT1不能降低细胞凋亡;而激活PGC-1α后,即使抑制SIRT1的表达,也能调控细胞凋亡。结论 (1) APP高表达转基因小鼠脑组织及经AβO的神经细胞中SIRT表达的降低,可能是导致老年斑大量聚集的原因之一。(2) RSV通过增加SIRT的表达,减少AβO诱导的细胞毒性作用,其机制可能涉及SIRT激活后调控其下游的一系列蛋白,从而减少细胞凋亡,进而降低细胞老化所引起的学习记忆能力的改变。(3) SIRT激活后通过活化ADAM10,增强APP非淀粉代谢途径,促进s APPα分泌,从而减少Aβ在大脑中的沉积。

关键词：沉默信息调节因子白藜芦醇 Aβ蛋白 Suramin α-分泌酶 β-分泌酶

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α7 nAChR通过提高抗氧化能力提升AD模型动物学习记忆能力及抗神经毒性作用

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中国药理学与毒理学杂志 2019年第6期33卷 427-427页

作者：曹坤向洁董阳婷徐毅冉龙艳李毅官志忠贵州医科大学附属医院病理科贵州贵阳550004 贵州医科大学地方病与少数民族疾病教育部重点实验室贵州贵阳550004 贵州省分子生物学重点实验室贵州贵阳550004

目的α7尼古丁型乙酰胆碱能受体(α7 nAChR)对学习与记忆功能密切相关,但其作用机制尚不十分清楚。为此,本研究选用APP/PS1双转基因动物模型,应用α7 nAChR激动剂/抑制剂研究nAChR是否能对抗Aβ引起的神经毒性作用,改善学习与记忆功能。方法选择α7 nAChR激动剂PNU-282987、α7 nAChR抑制剂甲基牛扁碱(MLA)分别处理6月龄、10月龄APP/PS1双转基因小鼠,水迷宫测定小鼠空间学习及记忆能力;HE染色观察APP/PS1双转基因小鼠脑组织病理学改变;免疫组织化学染色检测小鼠大脑内老年斑分布及表达;生物化学方法测定小鼠大脑及血清中丙二醛(MDA)含量、SOD及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性;Western蛋白印迹法检测小鼠海马APP代谢途径中α分泌型淀粉样前体蛋白(αAPP)、β分泌型淀粉样前体蛋白(βAPP)、β淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)、BACE2及解聚素金属蛋白酶结构域蛋白10(ADAM10),抗氧化应激通路核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶1(HO-1)、突触素(SYN)和突触相关蛋白(SNAP-25)等蛋白的表达水平。结果在6月龄、10月龄小鼠中,与对照组相比,PNU处理组小鼠的平台逗留时间明显升高,穿越平台次数明显增多,逃避潜伏期也有相应缩短;而MLA处理组小鼠平台逗留时间,穿越平台次数明显减少,逃避潜伏期则相应延长。6月龄APP/PS1转基因小鼠中,PNU处理组小鼠脑组织MDA含量较阳性对照组降低,SOD及GSH-Px活性较阳性对照组明显升高;MAL处理组小鼠脑组织MDA含量较阳性对照组升高,而SOD及GSH-Px活性较阳性对照组明显降低。10月龄APP/PS1转基因小鼠中,氧化应激指标略有加重,血清中氧化应激水平变化与脑组织中相似。Western蛋白印迹法结果显示,在6月龄小鼠中,PNU能够上调Nrf2/HO-1,ADAM10,BACE2,αAPP,SYN和SNAP-25蛋白表达水平,MLA可降低BACE1,αAPP,SYN和SNAP-25蛋白表达水平;在10月龄小鼠中,PNU能够上调Nrf2/HO-1,ADAM10,αAPP,SYN和SNAP-25蛋白表达水平,MLA可降低ADAM10,αAPP,SYN,SNAP-25蛋白表达水平。结论α7 nAChR可通过提高抗氧化能力来提升AD动物学习记忆能力及抗神经毒性作用:(1)激活α7 nAChR能改善APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力,而抑制α7 nAChR可加重该动物模型学习记忆障碍;(2)激活α7 nAChR能够活化Nrf/HO-1抗氧化应激通路和降低氧化应激水平;(3)α7 nAChR可调节APP代谢相关酶,促进αAPP生成,抑制Aβ生成及增强SYN、SNAP-25蛋白表达,改善突触可塑性。

关键词： α7尼古丁型乙酰胆碱能受体学习记忆氧化应激突触可塑性

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