检索结果-内蒙古大学图书馆

索马鲁肽原料中N-羟基琥珀酰亚胺残留量反相高效液相色谱检测方法的建立及验证

中国生物制品学杂志 2023年第1期36卷 85-88页

作者：杨庆马鲁南刘忠张贵民山东新时代药业有限公司山东省蛋白类药物工程实验室山东临沂273400 鲁南制药集团股份有限公司哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室山东临沂276006

目的建立检测索马鲁肽原料中N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxy succinimide,NHS)残留量的反相高效液相色谱(reverse phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC)法,并进行验证。方法筛选色谱柱并优化流动相条件(磷酸盐浓度与有... 详细信息

目的建立检测索马鲁肽原料中N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxy succinimide,NHS)残留量的反相高效液相色谱(reverse phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC)法,并进行验证。方法筛选色谱柱并优化流动相条件(磷酸盐浓度与有机相比例),建立检测索马鲁肽原料中NHS残留量的RP-HPLC法,并验证方法的专属性、适用性、准确度、重复性和稳定性,确定线性范围及定量限、检测限。用建立的方法检测3批索马鲁肽中NHS含量。结果确定的色谱条件如下:色谱柱为CAPCELL PAK ADME(4.6 mm×150 mm,3μm);流动相A为0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈(98∶2),流动相B为70%乙腈溶液;洗脱梯度为0 min 0%B,10 min 0%B,19 min 90%B,19.1 min 0%B,25 min 0%B;流速为0.8 mL/min;检测波长为260 nm;柱温为30℃。建立的方法在0.2~3.0μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系,R^(2)=1.0000,检测限和定量限分别为4.8和9.6 ng;专属性、系统适用性良好;3种不同浓度NHS加样样品回收率的相对标准偏差(RSD)为0.58%,准确度良好;6份供试品溶液中NHS含量的RSD为0.16%,重复性良好;室温放置0、4、8、12、16、20和24 h NHS峰面积的RSD为0.34%,稳定性良好。3批索马鲁肽中均未检出NHS。结论建立的RP-HPLC法简单、灵敏度高,可用于索马鲁肽原料中NHS含量的测定。

关键词：反相高效液相色谱法 N-羟基琥珀酰亚胺索马鲁肽

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FGF21-Fc融合蛋白体外活性试验的建立和优化

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中国医药工业杂志 2023年第4期54卷 545-553页

作者：徐金华赵文鹏赵丽丽曹宇彭伟刘忠山东新时代药业有限公司山东临沂273400 哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室山东临沂273400 沈阳药科大学辽宁沈阳110016 鲁南制药集团股份有限公司山东临沂276000

成纤维细胞生长因子-21(FGF21)-Fc融合蛋白体外活性试验的建立分为蛋白水平的结合活性试验和细胞水平的生物学活性试验2种。该研究建立了均相时间分辨荧光(HTRF)法用于检测FGF21-Fc融合蛋白与β-Klotho配体蛋白的结合活性;并自主构建了... 详细信息

成纤维细胞生长因子-21(FGF21)-Fc融合蛋白体外活性试验的建立分为蛋白水平的结合活性试验和细胞水平的生物学活性试验2种。该研究建立了均相时间分辨荧光(HTRF)法用于检测FGF21-Fc融合蛋白与β-Klotho配体蛋白的结合活性;并自主构建了报告基因细胞,当FGF21-Fc融合蛋白与β-Klotho的结合,激活其FGF受体和诱导胞内信号转导所必需的共同受体,可通过检测萤光素酶活性,间接定量测定生物学活性。在建立过程中,分别对结合活性试验中样品和配体的浓度、供体和配体的稀释比例以及孵育时间进行优化,并进行了方法学验证,证明该HTRF技术具有良好的重复性和特异性,可用于FGF21-Fc融合蛋白和β-Klotho的结合活性检测。随后,对生物学活性试验中胎牛血清的浓度、报告基因细胞的密度、试验板的类型以及细胞种板形式进行优化,并进行了方法学验证,证明该报告基因法具有良好的重复性和特异性,可用于FGF21-Fc融合蛋白的生物学活性检测。本研究建立了FGF21-Fc融合蛋白的质控方法,为有同样活性检测难点的药物提供了一种分析技术参考,填补了国内外空白。

关键词：成纤维细胞生长因子-21 均相时间分辨荧光结合活性报告基因法生物学活性

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抗SIRPα单克隆抗体的制备及其体外活性

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中国医药工业杂志 2023年第3期54卷 366-373页

作者：赵丽丽赵文鹏许永亮张贵民曹宇刘忠山东新时代药业有限公司山东临沂273400 哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室山东临沂273400 沈阳药科大学辽宁沈阳110016 鲁南制药集团股份有限公司山东临沂276000

利用分子生物学技术构建可表达带有小鼠抗体Fc端(mFc)的信号调节蛋白α(SIRPα)的质粒,并转染至中国仓鼠卵巢癌细胞(CHO细胞)中来制备SIRPα-mFc蛋白。将获得的SIRPα-mFc蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,并将免疫后的小鼠脾脏细胞与SP2/0... 详细信息

利用分子生物学技术构建可表达带有小鼠抗体Fc端(mFc)的信号调节蛋白α(SIRPα)的质粒,并转染至中国仓鼠卵巢癌细胞(CHO细胞)中来制备SIRPα-mFc蛋白。将获得的SIRPα-mFc蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,并将免疫后的小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。经过酶联免疫吸附反应(ELISA)和流式细胞仪的多轮筛选后,得到7株靶向SIRPα的单克隆抗体。其中,40F3和57B10这2株单克隆抗体结合活性较高,半数效应浓度(EC_(50))分别为5.866、5.457ng/mL;半数抑制浓度(IC_(50))分别为65.31、63.29 ng/mL,均优于商业化抗体SE5A5(抗SIRPα/β抗体,EC_(50)为22.47 ng/mL,IC_(50)为121.2 ng/mL)。并且,这2株抗体的亲和力数量级在1×10^(–11)且不与SIRPg结合,为后续的抗体人源化以及临床前研究提供了参考。

关键词：信号调节蛋白α(SIRPα) 单克隆抗体抗体亲和力制备体外活性

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一种基于等P/V策略的生物反应器缩小模型的建立

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中国生物制品学杂志 2021年第7期34卷 868-872页

作者：赵丽丽朱玉强马动张贵民刘忠山东新时代药业哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室山东临沂273400

目的应用3 L生物反应器,基于等P/V策略建立生产规模450 L生物反应器的缩小模型。方法应用3 L生物反应器,按照生产工艺培养稳定表达抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体的CHO细胞,培养16 d应用亲和层析纯化抗CD20单克隆抗体,分子排阻法分析抗体聚体... 详细信息

目的应用3 L生物反应器,基于等P/V策略建立生产规模450 L生物反应器的缩小模型。方法应用3 L生物反应器,按照生产工艺培养稳定表达抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体的CHO细胞,培养16 d应用亲和层析纯化抗CD20单克隆抗体,分子排阻法分析抗体聚体,弱阳离子高效液相色谱法分析抗体的酸性峰和碱性峰含量,2-AB标记法检测抗体糖型含量,mini-tab软件对结果进行双单侧检验(Two One-Sided Test,TOST)分析。结果与生产规模相比,缩小规模细胞生长、二氧化碳分压(pCO_(2))水平及主要代谢产物乳酸和铵离子水平基本一致,抗体表达量、聚体含量、糖型结果及酸性峰和碱性峰含量经分析,均具有等价性。结论基于等P/V缩小原则成功建立了生产规模生物反应器的缩小模型。

关键词：等P/V 生物反应器缩小模型 CHO细胞

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饮水中添加复合酶对黄羽肉鸡生长性能、血清抗氧化指标、免疫功能和肠道结构的影响

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饲料工业 2023年第1期44卷 51-57页

作者：陈鑫珠杨雅妮邱水玲靳伟刚李忠荣邱华玲林海虹刘景福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省畜禽遗传育种重点实验室福建福州350013 福建农林大学福建福州350001 福建福大百特生物科技有限公司福建福州350007 酶高效表达国家工程实验室福建福州350007

试验旨在研究饮水中添加不同复合酶对黄羽肉鸡生长性能、血清抗氧化指标、免疫功能和肠道结构的影响,将4 000羽29日龄黄羽肉鸡随机分成5组,每组4个重复,每重复200羽(公母各半)。对照组饮水中无添加,试验1组、2组饮水中分别添加50 mg/L和... 详细信息

试验旨在研究饮水中添加不同复合酶对黄羽肉鸡生长性能、血清抗氧化指标、免疫功能和肠道结构的影响,将4 000羽29日龄黄羽肉鸡随机分成5组,每组4个重复,每重复200羽(公母各半)。对照组饮水中无添加,试验1组、2组饮水中分别添加50 mg/L和100 mg/L复合酶A,试验3、4组饮水中分别添加125 mg/L和175 mg/L复合酶B,各组饲喂相同日粮(未添加酶制剂),试验期40 d,测定70日龄黄羽肉鸡生长性能、血清抗氧化指标、免疫功能和肠道结构。结果表明:(1)试验组70日龄平均体重、29~70日龄平均日增重显著高于对照组(P<0.05),料重比显著低于对照组(P<0.05)。(2)试验2、3、4组血清羟自由基含量均显著高于对照组(P<0.05),试验2组血清超氧化物歧化酶活性显著低于对照组(P<0.05)。(3)试验4组血清溶菌酶活性、免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白M(IgM)含量均显著高于对照组(P<0.05);试验组免疫器官指数及胸腺白细胞介素-1、白细胞介素-6、白细胞介素-8、肿瘤坏死因子-α等与对照组均无显著差异(P>0.05)。(4)试验4组十二指肠重量、绒毛高度、黏膜层厚度和绒毛高度/隐窝深度均显著高于对照组(P<0.05);试验1组空肠绒毛高度和黏膜层厚度、试验2组空肠绒毛高度和隐窝深度、试验4组空肠重量和隐窝深度均显著高于对照组(P<0.05)。试验4组回肠重量显著高于对照组(P<0.05)。综上,两种复合酶均可显著提高黄羽肉鸡的生长性能,复合酶B可以提高黄羽肉鸡血清抗氧化功能和免疫功能,改善十二指肠及空肠结构,推荐饮水中添加剂量以125 mg/L为宜。

关键词：复合酶黄羽肉鸡生长性能抗氧化指标免疫功能肠道结构

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鼠源抗CD47单克隆抗体的筛选及活性评价

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中国医药工业杂志 2022年第5期53卷 672-678页

作者：朱中松赵丽丽张贵民曹宇刘忠山东新时代药业有限公司山东临沂273400 哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室山东临沂273400 鲁南制药集团股份有限公司山东临沂276000

通过杂交瘤技术筛选得到了一株鼠源抗白细胞分化抗原47(CD47)单克隆抗体。采用聚乙二醇融合法,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)法筛选抗CD47的杂交瘤细胞,通过Protein G亲和柱纯化抗体,利用十二烷基磺酸钠(SD... 详细信息

通过杂交瘤技术筛选得到了一株鼠源抗白细胞分化抗原47(CD47)单克隆抗体。采用聚乙二醇融合法,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)法筛选抗CD47的杂交瘤细胞,通过Protein G亲和柱纯化抗体,利用十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)法检测目的蛋白的相对分子质量,通过生物分子相互作用分析仪检测目的抗体的亲和力,并通过ELISA法测定抗CD47抗体的信号调节蛋白α(SIRPα)的阻断效力。用藻红蛋白(PE)标记的Raji细胞与不同浓度的抗CD47单抗共同孵育,检测抗CD47抗体促进巨噬细胞吞噬的作用。采用血凝试验对抗CD47单抗导致红细胞凝集的能力进行了分析,并进一步通过小鼠实体瘤模型,考察抗CD47单抗的抑制肿瘤生长作用。结果显示,筛选得到的一株杂交瘤细胞,即抗CD47单克隆抗体3D8,其亲和力常数值为1.29×10^(-11)mol/L,ELISA法测得其半数有效浓度(EC_(50))值为0.17 nmol/L,可有效阻断CD47与SIRPα的相互作用,增强巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力,吞噬率达85%。该抗体在亲和力、阻断力、吞噬率等方面均优于在售抗体,同时不会导致红细胞凝集。在小鼠实体瘤模型中,肿瘤生长抑制率为95.44%,可明显抑制肿瘤生长。本研究为后期抗CD47抗体的人源化和抗CD47抗体的临床前研究提供了参考。

关键词：抗CD47单克隆抗体杂交瘤技术亲和力红细胞凝集抗肿瘤活性

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纽莫康定杂质C_(0)的制备研究

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中国抗生素杂志 2022年第3期47卷 280-288页

作者：曾凡洲刘志钰朱兵峰王钦超张贵民魏荣省鲁南新时代生物技术有限公司临沂273400 鲁南制药集团股份有限公司临沂273400 哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室临沂273400

目的为控制纽莫康定B_(0)的质量及为卡泊芬净的杂质传递研究提供物料,本研究对关键杂质纽莫康定C_(0)进行了制备。方法通过发酵液提取工艺富集、高压液相制备色谱、减压浓缩、冷冻干燥,制备得到纽莫康定C_(0)干粉,并对其进行紫外吸收... 详细信息

目的为控制纽莫康定B_(0)的质量及为卡泊芬净的杂质传递研究提供物料,本研究对关键杂质纽莫康定C_(0)进行了制备。方法通过发酵液提取工艺富集、高压液相制备色谱、减压浓缩、冷冻干燥,制备得到纽莫康定C_(0)干粉,并对其进行紫外吸收光谱、红外吸收光谱、核磁共振、质谱等分析和结构鉴定。结果得到了色谱纯度99.19%、峰纯度999.4(DAD检测器)、热重3.05%的纽莫康定C_(0)干粉1.7395 g,其结构经过确证为纽莫康定C_(0)。结论制备得到的纽莫康定C_(0),可作为质量研究对照品和杂质传递研究用物料,并对纽莫康定其他杂质的制备具有重要参考价值。

关键词：纽莫康定C_(0)制备高压液相制备色谱结构确证

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联合酶解法结合UPLC Q-TOF高分辨质谱检测重组水蛭素蛋白的二硫键结构

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中国医药工业杂志 2023年第11期54卷 1636-1645页

作者：徐金华赵丽丽柳常青张贵民刘忠山东新时代药业有限公司山东临沂273400 哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室山东临沂273400 鲁南新时代生物技术有限公司山东临沂273400 鲁南制药集团股份有限公司山东临沂276000

采用联合酶切法结合UPLC Q-TOF高分辨质谱解析重组水蛭素蛋白的复杂二硫键交联结构。首先从蛋白水平验证重组水蛭素蛋白是否含有游离半胱氨酸,包括高分辨质谱表征相对分子质量和定量检测游离巯基;然后利用单一酶解法标注每个或每组二硫... 详细信息

采用联合酶切法结合UPLC Q-TOF高分辨质谱解析重组水蛭素蛋白的复杂二硫键交联结构。首先从蛋白水平验证重组水蛭素蛋白是否含有游离半胱氨酸,包括高分辨质谱表征相对分子质量和定量检测游离巯基;然后利用单一酶解法标注每个或每组二硫键在蛋白序列中所处的位置;最后根据单酶所测结果,设计混合酶切的方式确定具体的二硫键配对方式,并利用二硫苏糖醇还原法加以验证,最终确证重组水蛭素蛋白的二硫键位置。结果显示,重组水蛭素蛋白存在10个半胱氨酸,共形成5对二硫键,分别为Ṩ1(Cys1-Cys2)、Ṩ2-Ṩ3(Cys3-Cys5/Cys4-Cys6或Cys3-Cys6/Cys4-Cys5)、Ṩ4(Cys7-Cys9)和Ṩ5(Cys8-Cys10)。

关键词： UPLC Q-TOF高分辨质谱二硫键蛋白类药物联合酶解

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复合酶在白羽肉鸡低蛋白日粮中的应用效果研究

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饲料工业 2024年第11期45卷 37-43页

作者：岳稳高龙李忠荣刘景方桂友林勤靳伟刚陈鑫珠福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省畜禽遗传育种重点实验室福建福州350013 福建福大百特科技发展有限公司酶高效表达国家工程实验室福建福州350007 福建农林大学动物科学学院(蜂学学院) 福建福州350001 福建福大百特科技发展有限公司博士后科研工作站福建福州350007

试验旨在研究低蛋白日粮中添加复合酶对白羽肉鸡生长性能、血清生化和抗氧化指标、免疫功能和消化器官的影响。将288只1日龄白羽肉鸡随机分为6组,试验期42 d,试验配方设计1~21日龄和22~42日龄两阶段。对照组(CK组)饲喂常规蛋白日粮(两... 详细信息

试验旨在研究低蛋白日粮中添加复合酶对白羽肉鸡生长性能、血清生化和抗氧化指标、免疫功能和消化器官的影响。将288只1日龄白羽肉鸡随机分为6组,试验期42 d,试验配方设计1~21日龄和22~42日龄两阶段。对照组(CK组)饲喂常规蛋白日粮(两阶段粗蛋白水平分别为21.28%和19.04%);试验组均饲喂低蛋白日粮(两阶段粗蛋白水平较CK组分别降低0.97%和0.94%),试验1、2、3组全程分别添加200 mg/kg复合酶A(T1组)、200 mg/kg复合酶B(T2组)、300 mg/kg复合酶B(T3组),试验4组两阶段分别添加复合酶B 100、300 mg/kg;另设低蛋白日粮组(T0组)。试验结束时进行生长性能、血清生化和抗氧化指标、免疫功能和消化器官发育情况的测定分析。结果表明:T2、T3组21日龄活体重、42日龄活体重和欧洲生产效率指数均较高,T3组1~42日龄料重比低于其他组;CK组和T3组血清中尿素(UREA)含量显著低于T4组(P<0.05),T2组血清谷草转氨酶(AST)活性显著高于T1组外的其他组(P<0.05),T0、T1和T2组血清超氧化物歧化酶(SOD)含量显著低于T4组(P<0.05);T4组IgA、IgG和IgE显著高于T0组(P<0.05)。综上所述,在低蛋白日粮中添加复合酶能够提高白羽肉鸡指标和抗氧化能力,促进免疫器官和消化器官发育,提高免疫力。

关键词：复合酶白羽肉鸡生长性能生化和抗氧化指标免疫功能消化器官发育

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高效液相色谱法测定司美格鲁肽原料药中游离脂肪酸侧链的含量

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中南药学 2023年第1期21卷 199-202页

作者：杨庆马鲁南刘忠曹宇张贵民山东新时代药业有限公司山东省蛋白类药物工程实验室山东临沂273400 鲁南制药集团股份有限公司哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室山东临沂276006

目的建立高效液相色谱法检测司美格鲁肽原料药中的游离脂肪酸侧链[(S)-9,18,23-三氧代-2,5,11,14-四氧杂-8,17,22-三氮杂三十九烷-1,21,39-三羧酸]的含量。方法采用Kinetex C8(4.6 mm×150 mm,2.6μm)色谱柱;流动相A为0.1%三氟乙酸... 详细信息

目的建立高效液相色谱法检测司美格鲁肽原料药中的游离脂肪酸侧链[(S)-9,18,23-三氧代-2,5,11,14-四氧杂-8,17,22-三氮杂三十九烷-1,21,39-三羧酸]的含量。方法采用Kinetex C8(4.6 mm×150 mm,2.6μm)色谱柱;流动相A为0.1%三氟乙酸-水溶液;流动相B为0.1%三氟乙酸-乙腈溶液;洗脱梯度(0 min,30%B;20 min,70%B;21min,30%B;30 min,30%B),流速0.7 mL·min^(-1);柱温35℃;检测波长210 nm。考察方法的专属性、线性范围、定量限与检测限、准确度和耐用性等。采用该方法检测3批司美格鲁肽原料药中的游离脂肪酸侧链含量。结果脂肪酸侧链与司美格鲁肽的分离度为4.05,在1.00~50.15μg·mL^(-1)与峰面积呈良好的线性关系,回归方程为Y=0.2584X-0.0936,R^(2)=0.9999;检测限和定量限分别为0.392μg·mL^(-1)和0.784μg·mL^(-1)。结论建立的方法具有良好的专属性和准确度,可用于司美格鲁肽原料药中游离脂肪酸侧链含量的测定。

关键词：高效液相色谱法司美格鲁肽游离脂肪酸侧链

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