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Let-7a表达质粒的构建及其对肺癌A549细胞k-Ras蛋白表达的抑制作用

南方医科大学学报 2010年第11期30卷 2427-2431页

作者：何晓燕陈俊霞欧阳溪张政彭惠民重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室重庆400016 重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的探讨let-7a介导的基因表达调控在肺癌形成中的作用。方法依据miRBase数据库中hsa-let-7a序列,设计两条寡核苷酸片段,退火处理后克隆至pGenesil-1质粒,构建重组质粒pGenesil-let-7a,同时设计并构建一个阴性对照质粒pGenesil-control... 详细信息

目的探讨let-7a介导的基因表达调控在肺癌形成中的作用。方法依据miRBase数据库中hsa-let-7a序列,设计两条寡核苷酸片段,退火处理后克隆至pGenesil-1质粒,构建重组质粒pGenesil-let-7a,同时设计并构建一个阴性对照质粒pGenesil-control。将pGenesil-let-7a及pGenesil-control转染肺癌A549细胞,经G418筛选,建立稳定表达let-7a-GFP及control-GFP的细胞株。采用MTT比色法检测活细胞数并绘制生长曲线;半定量RT-PCR、Western blotting及免疫细胞化学检测k-Ras表达的差异。结果经测序证实重组质粒构建成功,与未处理的A549细胞和稳定表达pGenesil-control的细胞相比,在稳定表达pGenesil-let-7a的A549细胞中,细胞生长明显减慢,k-Ras的蛋白表达明显降低,而k-Ras的mRNA水平无明显变化。结论 let-7a在翻译水平抑制了k-Ras的表达,并对细胞生长具有显著的抑制作用。

关键词：微RNA let-7a 肺癌 k-Ras 基因表达

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NO信号通过I-kappaB磷酸化激活人肝细胞内源凝血因子Ⅷ重表达的调控作用

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吉林大学学报（医学版） 2014年第6期40卷 1155-1160页

作者：温泉何玉霞周云飞王娟张军重庆医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的:建立一氧化氮(NO)前体化合物L-精氨酸激活人肝细胞L02内源凝血因子Ⅷ(FⅧ)重表达的分子细胞生物学模型,探讨NO信号激活L02中内源FⅧ重表达的调控通路及分子基础。方法:取对数生长期L02细胞随机分为对照组、加药组(L-精氨酸)、抑制... 详细信息

目的:建立一氧化氮(NO)前体化合物L-精氨酸激活人肝细胞L02内源凝血因子Ⅷ(FⅧ)重表达的分子细胞生物学模型,探讨NO信号激活L02中内源FⅧ重表达的调控通路及分子基础。方法:取对数生长期L02细胞随机分为对照组、加药组(L-精氨酸)、抑制剂组(L-NAME和L-精氨酸)和抑制剂对照组(L-NAME),分别培养12、24、36、48和60h,采用流式细胞术检测作用48h后L02中人FⅧ蛋白的表达,Griess法检测不同时间点L02细胞内NO水平,RT-PCR法检测L02中人FⅧ基因、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因、核转录因子(NF-κB1)基因和核因子κB(免疫球蛋白κ轻链基因增强子)抑制蛋白α亚基(I-κB alpha)基因的转录水平,Western blotting法检测L02中人磷酸化I-kappaB(磷酸化I-κB)表达水平。结果:流式细胞术检测,加L-精氨酸培养48h后L02中出现人FⅧ蛋白的表达。Griess法检测,加药组L02在3、6和12h内NO表达水平显著增加(P<0.05),随后又基本恢复到正常水平,正常组、抑制剂组和抑制剂对照组L02细胞内NO水平无变化;RT-PCR检测,加药组L02中人FⅧmRNA转录;对照组、抑制剂组和抑制剂对照组均无人FⅧmRNA的转录,加药组iNOS、NF-κB1和I-κB alpha转录水平均上升(P<0.05),对照组、抑制剂组和抑制剂对照组上述基因转录水平均无明显变化。Western blotting法检测,加入L-精氨酸后,磷酸化I-κB表达水平明显增加(P<0.05),其他组则无此变化。结论:L-精氨酸通过NO信号通路进而激活I-κB磷酸化,导致人FⅧ基因启动子上游调控相关的转录因子NF-κB1进入胞核从而激活人离体肝细胞L02中内源人FⅧ的表达。

关键词：人凝血因子Ⅷ L-精氨酸一氧化氮信号通路磷酸化 human coagulation factor Ⅷ

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整合素连接激酶基因沉默对膀胱癌BIU-87细胞增殖能力的影响及其机制

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中国生物制品学杂志 2011年第7期24卷 785-790页

作者：高娟朱军潘湘阳李红彦陈俊霞重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室重庆400016 重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的构建整合素连接激酶(Integrin linked kinase,ILK)基因siRNA干扰质粒,探讨ILK基因沉默对膀胱癌BIU-87细胞增殖能力及糖原合成酶激酶3(Glycogen synthase kinase 3,GSK3)、β-环连蛋白(β-catenin)表达的影响。方法构建针对人ILK基因... 详细信息

目的构建整合素连接激酶(Integrin linked kinase,ILK)基因siRNA干扰质粒,探讨ILK基因沉默对膀胱癌BIU-87细胞增殖能力及糖原合成酶激酶3(Glycogen synthase kinase 3,GSK3)、β-环连蛋白(β-catenin)表达的影响。方法构建针对人ILK基因的2个特异性siRNA表达质粒和1个无同源性的阴性对照质粒,在脂质体介导下转染膀胱癌BIU-87细胞,通过RT-PCR及Western blot检测ILK基因mRNA和蛋白的表达水平,筛选出1个干扰效果较强的质粒用于后续试验,Western blot检测细胞GSK3和β-catenin蛋白的表达,Am-blue法检测细胞的增殖活力,流式细胞术检测细胞周期的分布。结果经酶切和测序证明重组干扰质粒构建正确;稳定转染pGenesil-1 siRNA1和pGenesil-1 siRNA2质粒的BIU-87细胞ILK基因mRNA和蛋白表达水平较BIU-87细胞组(未转染组)分别下降了69%、52%和70%、55%,选择pGenesil-1 siRNA1为最有效干扰序列;BIU-87siRNA1组GSK3的表达水平较阴性对照组和BIU-87细胞组分别升高了41.87%和30.12%,β-catenin的表达水平较阴性对照组和BIU-87细胞组分别降低了38.67%和48.05%;BIU-87 siRNA1组细胞增殖活力明显下降;BIU-87 siRNA1组G0-G1期细胞比例明显增加,S期减少。结论已成功构建ILK基因siRNA表达质粒,其可明显抑制膀胱癌BIU-87细胞的增殖,机制可能为ILK基因通过介导GSK3、β-catenin信号分子促进膀胱癌BIU-87细胞的增殖。

关键词：整合素连接激酶 RNA干扰膀胱肿瘤细胞增殖

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转录因子XBP1S对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响

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肿瘤 2011年第1期31卷 11-16页

作者：林建炜刘平向廷秀李祥柱赵文君郭风劲重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室重庆400016 重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学附属第一医院分子肿瘤及表观遗传学实验室重庆400016

目的:探讨人剪接型X盒结合蛋白1(X-box binding protein1spliced,XBP1S)对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响。方法:应用衣霉素(tunicamycin,Tm)和毒胡萝卜素(thapsigargin,Tg)建立HepG2细胞的内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)模型。将XBP1S真核表达载体pcDNA3.1(-)-XBP1S和靶向XBP1S的RNA干扰质粒pSUPER-XBP1S转染HepG2细胞,MTT法检测细胞的增殖能力,荧光显微镜下观察细胞的形态学变化,FCM法检测细胞凋亡率,Western印迹法检测caspase12的表达。结果:转染pSUPER-XBP1S可有效抑制细胞增殖,而转染pcDNA3.1(-)-XBP1S可促进细胞增殖。荧光显微镜下可见Tm处理组细胞出现细胞凋亡的形态学改变,进一步下调XBP1S的表达可使这一改变增强。对照组、Tm组、Tm+pSUPER-XBP1S转染组和Tm+pcDNA3.1(-)-XBP1S转染组细胞的凋亡率分别为5.21%、41.51%、52.15%和35.87%,差异有统计学意义(P<0.05)。HepG2细胞中caspase12的表达,Tm组高于对照组,Tm+pSUPER-XBP1S转染组高于Tm组,Tm+pcDNA3.1(-)-XBP1S转染组低于Tm组。结论:XBP1S可以促进肝癌HepG2细胞增殖,抑制或促进XBP1S表达可调节ERS介导的细胞凋亡。

关键词：肝肿瘤 X盒结合蛋白1 内质网应激细胞增殖细胞凋亡细胞,HepG2

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NIRF蛋白的原核表达及纯化

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中国生物制品学杂志 2011年第1期24卷 56-60页

作者：杨艳金方敏钱冠华段昌柱重庆医科大学细胞生物学与遗传学教研室重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的原核表达NIRF基因,并纯化NIRF蛋白。方法 PCR扩增全长NIRF基因,克隆入原核表达质粒pGEX-4T-1中,转化*** BL21(DE3),IPTG诱导表达,并用GST 4B球珠亲和纯化目的蛋白。结果重组表达质粒pGST-NIRF经酶切鉴定证明构建正确。22℃条件下... 详细信息

目的原核表达NIRF基因,并纯化NIRF蛋白。方法 PCR扩增全长NIRF基因,克隆入原核表达质粒pGEX-4T-1中,转化*** BL21(DE3),IPTG诱导表达,并用GST 4B球珠亲和纯化目的蛋白。结果重组表达质粒pGST-NIRF经酶切鉴定证明构建正确。22℃条件下培养,菌体A600值达1.8时,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导7 h,能使GST-NIRF在上清中大量表达;纯化的重组GST-NIRF蛋白纯度达85%以上,可与GST抗体和NIRF抗体发生特异性结合。结论已成功在大肠杆菌中表达了GST-NIRF蛋白,纯化的蛋白可用于NIRF的生物功能活性研究。

关键词： NIRF GST标签原核细胞基因表达纯化

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人FBP17基因重组真核表达质粒的构建及其在LO2细胞中的表达

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中国生物制品学杂志 2012年第1期25卷 32-35页

作者：王蕴红张乾英朱重阳李鑫张军重庆医科大学分子医学及肿瘤学研究中心重庆400016 重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室重庆400016

目的构建人FBP17基因重组真核表达质粒,并检测其在人正常肝细胞LO2中的表达及对细胞存活率的影响。方法用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切pEGFP-C1-FBP17质粒,胶回收FBP17基因片段,与p3XFLAG-CMV-10载体连接,构建重组真核表达质粒p3XFLAG-CMV-10/F... 详细信息

目的构建人FBP17基因重组真核表达质粒,并检测其在人正常肝细胞LO2中的表达及对细胞存活率的影响。方法用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切pEGFP-C1-FBP17质粒,胶回收FBP17基因片段,与p3XFLAG-CMV-10载体连接,构建重组真核表达质粒p3XFLAG-CMV-10/FBP17,LipofectamineTM法转染人正常肝细胞LO2,RT-PCR和Western blot法检测转染细胞中FBP17基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平,XTT法检测其对转染细胞增殖的影响。结果重组表达质粒p3XFLAG-CMV-10/FBP17经双酶切及测序证实构建正确;转染该重组质粒的LO2细胞FBP17基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均明显增高,且该质粒转染对细胞存活率无影响。结论成功构建了FBP17基因重组真核表达质粒,其可在LO2细胞中表达,且对细胞的存活率无影响,为进一步研究FBP17相互作用蛋白及其功能奠定了基础。

关键词： FBP17基因 LO2细胞细胞骨架

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X盒结合蛋白1-u的原核表达及纯化

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中国生物制品学杂志 2009年第4期22卷 323-326,330页

作者：李婧林建炜张静郭风劲重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学细胞生物学与遗传学教研室重庆400016

目的构建X盒结合蛋白1-u(XBP1-u)基因原核表达质粒,表达并纯化XBP1-u蛋白。方法利用RT-PCR技术从肝癌细胞HepG2中扩增XBP1-u基因,先插入中间载体pGEM-Teasy,再将其克隆至原核表达载体pET32a,构建重组原核表达质粒pET32a-XBP1-u,转化***2... 详细信息

目的构建X盒结合蛋白1-u(XBP1-u)基因原核表达质粒,表达并纯化XBP1-u蛋白。方法利用RT-PCR技术从肝癌细胞HepG2中扩增XBP1-u基因,先插入中间载体pGEM-Teasy,再将其克隆至原核表达载体pET32a,构建重组原核表达质粒pET32a-XBP1-u,转化***21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA树脂柱亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定。结果测序分析证实,克隆入pET32a的XBP1-u序列与GenBank中登录的XBP1-ucDNA序列一致。IPTG的最佳诱导浓度为0.5mmol/L,最佳诱导时间为6h。目的蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约为33000。纯化的蛋白经SDS-PAGE分析显示单一条带,且具有良好的反应原性。结论已成功构建了XBP1-u基因原核表达质粒,表达并纯化了XBP1-u蛋白,为XBP1-u在肿瘤发病中的作用机制及在应激性疾病临床治疗中的研究奠定了基础。

关键词： X盒结合蛋白1-u 原核表达纯化

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特异性ILK siRNA对膀胱癌移植瘤生长及p-Akt、p-GSK3β表达的影响

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第三军医大学学报 2011年第18期33卷 1947-1950页

作者：高娟朱军潘湘阳李红彦陈俊霞重庆医科大学细胞生物学与遗传学教研室重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的探讨应用整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)特异siRNA沉默ILK基因的表达对膀胱癌裸鼠移植瘤生长及p-Akt、p-GSK3β表达的影响。方法实验分3组:BIU-87细胞组(正常BIU-87细胞)、BIU-87-NC组(转染阴性对照质粒的BIU-87细胞)... 详细信息

目的探讨应用整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)特异siRNA沉默ILK基因的表达对膀胱癌裸鼠移植瘤生长及p-Akt、p-GSK3β表达的影响。方法实验分3组:BIU-87细胞组(正常BIU-87细胞)、BIU-87-NC组(转染阴性对照质粒的BIU-87细胞)、BIU-87 siRNA(转染干扰质粒的BIU-87细胞)。将ILK特异性siRNA转染人膀胱癌BIU-87细胞,筛选稳定表达ILK siRNA的BIU-87细胞,将其注入裸鼠皮下,检测裸鼠移植瘤的大小和质量,HE染色观察移植瘤组织的形态学变化,利用免疫组化技术检测移植瘤组织中微血管的变化及p-Akt和p-GSK3β的表达。结果 BIU-87siRNA组较BIU-87与BIU-87-NC组,瘤体质量显著降低(P<0.01),抑瘤率分别为64.73%和66.73%。BIU-87 siRNA组癌细胞较BIU-87与BIU-87-NC组体积减小,核浆比例明显缩小,细胞核染色较浅,核分裂相显著减少,BIU-87 siRNA组微血管较BIU-87与BIU-87-NC组明显减少甚至无血管出现,BIU-87 siRNA组p-Akt和p-GSK3β的表达呈弱阳性反应。结论特异性ILK siRNA能抑制膀胱癌裸鼠移植瘤的生长,并通过降低p-Akt和p-GSK3β的表达抑制膀胱癌裸鼠移植瘤的增殖。

关键词：整合素连接激酶膀胱癌移植瘤生长

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小鼠微RNA miR-21真核表达质粒的构建及其在小鼠肾小球系膜细胞中的表达

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中国生物制品学杂志 2010年第7期23卷 708-710页

作者：张政彭惠民徐晓明何晓燕重庆医科大学基础医学院细胞生物学及遗传学教研室重庆400016 重庆医科大学分子医学及肿瘤研究中心重庆400016

目的构建小鼠微RNA miR-21真核表达质粒,并在小鼠肾小球系膜细胞中表达。方法人工合成小鼠miR-21基因序列,构建miR-21真核表达质粒pGenesil-miR-21。使用脂质体Lipofectamine2000转染小鼠肾小球系膜细胞后,G418筛选,获得稳定转染克隆,... 详细信息

目的构建小鼠微RNA miR-21真核表达质粒,并在小鼠肾小球系膜细胞中表达。方法人工合成小鼠miR-21基因序列,构建miR-21真核表达质粒pGenesil-miR-21。使用脂质体Lipofectamine2000转染小鼠肾小球系膜细胞后,G418筛选,获得稳定转染克隆,提取总RNA,通过实时荧光定量RT-PCR技术检测miR-21的表达。结果经酶切鉴定和测序证实,合成的miR-21基因序列完全正确,并已成功克隆到真核表达质粒pGenesil-1上。重组真核表达质粒转染小鼠肾小球系膜细胞后,筛选出的阳性克隆可稳定高表达miR-21。结论已成功构建miR-21真核表达质粒,并在小鼠肾小球系膜细胞中高效表达,为进一步探讨miR-21的生物学功能奠定了基础。

关键词：微RNA miR-21 真核细胞基因表达肾小球系膜细胞

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FNBP1参与HeLa细胞的形态控制与生长调控

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第三军医大学学报 2013年第19期35卷 2046-2050页

作者：李鑫温泉周云飞何玉霞张军重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室重庆400016

目的研究FNBP1在HeLa细胞形态控制及生长调控过程中的作用。方法运用RT-PCR、Western blot法在mRNA和蛋白水平验证FNBP1在HeLa细胞中的表达;运用RT-PCR、Western blot法检测靶向siRNA干扰HeLa细胞内源FNBP1的表达情况,并于完全沉默和表... 详细信息

目的研究FNBP1在HeLa细胞形态控制及生长调控过程中的作用。方法运用RT-PCR、Western blot法在mRNA和蛋白水平验证FNBP1在HeLa细胞中的表达;运用RT-PCR、Western blot法检测靶向siRNA干扰HeLa细胞内源FNBP1的表达情况,并于完全沉默和表达恢复2个时相点检测HeLa细胞在细胞形态、细胞周期等方面的变化。结果FNBP1在HeLa细胞中稳定表达;FNBP1表达沉默后,HeLa细胞形态发生纤维状转变;FNBP1表达恢复后,HeLa细胞形态恢复至上皮状;FNBP1表达沉默后,干扰组处于S期的细胞为30.36%,较正常组(25.45%)明显增多(P<0.05);而G2期干扰组细胞比例(9.28%)低于正常组(11.88%,P<0.05);HeLa细胞周期在S期出现阻滞。结论 FNBP1作为关键调控分子,为HeLa细胞的形态建成及维持所必需;FNBP1可能参与HeLa细胞周期调控相关过程。

关键词： FNBP1 HeLa细胞形态控制生长调控

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