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长链非编码RNA 1500026H17Rik对高糖培养的肾小球系膜细胞增殖的影响

中国细胞生物学学报 2018年第4期40卷 560-567页

作者：张亚娟孙艳彭睿彭惠民张政重庆医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室重庆400016 重庆医科大学基础医学院分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

为了探讨长链非编码RNA 1500026H17Rik对小鼠肾小球系膜细胞增殖的影响,采用qRT-PCR(quantitative Real-time PCR)检测1500026H17Rik在糖尿病肾病小鼠肾脏组织及在高糖和低糖条件下培养的肾小球系膜细胞中的表达水平;扩增小鼠1500026H17... 详细信息

为了探讨长链非编码RNA 1500026H17Rik对小鼠肾小球系膜细胞增殖的影响,采用qRT-PCR(quantitative Real-time PCR)检测1500026H17Rik在糖尿病肾病小鼠肾脏组织及在高糖和低糖条件下培养的肾小球系膜细胞中的表达水平;扩增小鼠1500026H17Rik的全长序列,将其克隆到pcDNA3.1(+)载体上,构建pcDNA3.1(+)-1500026H17Rik过表达质粒,并设计合成si RNA;将1500026H17Rik-si RNA和pcDNA(+)-1500026H17Rik过表达质粒分别转染至高糖或低糖培养的肾小球系膜细胞中,通过5-乙基-2′-脱氧尿嘧啶核苷(5-ethyny1-2′-doexyuridine,Ed U)检测肾小球系膜细胞的增殖能力。结果表明,在糖尿病肾病小鼠肾脏组织和高糖培养的系膜细胞中1500026H17Rik表达水平显著提高。在低糖培养的系膜细胞中转染pcDNA3.1(+)-1500026H17Rik过表达质粒后与低糖培养的系膜细胞或空质粒转染对照组相比,低糖1500026H17Rik过表达的肾小球系膜细胞的增殖能力明显提高。同时,将通过qRT-PCR筛选出的一条敲低效率最佳的1500026H17Rik-si RNA转染至高糖培养的系膜细胞后,与高糖培养的系膜细胞或si RNA转染对照组相比,1500026H17Rik敲低的肾小球系膜细胞的增殖能力明显减弱。lnc RNA-1500026H17Rik在糖尿病肾病小鼠肾脏组织中呈高表达,且影响高低糖培养的肾小球系膜增殖,提示1500026H17Rik可能参与了糖尿病肾病的发生。

关键词：糖尿病肾病长链非编码RNA 1500026H17Rik 肾小球系膜细胞增殖

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外源性TGF-β1诱导人乳腺癌MCF-7细胞的乙醛脱氢酶1 mRNA及蛋白表达

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复旦学报（医学版） 2011年第4期38卷 340-342页

作者：韩明利吴诚义莫志强彭琼乐王艺梦屈洪波重庆医科大学附属第一医院内分泌外科重庆400016 重庆医科大学基础医学院细胞生物学及遗传学教研室重庆400016 重庆医科大学基础医学院分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学附属第一医院急诊科重庆400016

目的本研究旨在探讨外源性TGF-β1诱导人乳腺癌MCF-7细胞对乙醛脱氢酶1(aldehyde dehydrogenase1,ALDH1)mRNA及蛋白表达的影响。方法用不同浓度(1、5ng/mL)的TGF-β1诱导体外培养的MCF-7细胞48h后,RT-PCR检测ALDH1mRNA的表达变化,Western blot检测ALDH1蛋白的表达变化。结果 TGF-β1(1、5ng/mL)诱导的MCF-7细胞的ALDH1mRNA及蛋白表达均高于未诱导的MCF-7亲本细胞,差异有统计学意义(P均<0.001);高浓度(5ng/mL)TGF-β1诱导的MCF-7细胞的ALDH1mRNA及蛋白表达均高于低浓度(1ng/mL)TGF-β1诱导的MCF-7细胞,差异有统计学意义(P均<0.001)。结论外源性TGF-β1可诱导人乳腺癌MCF-7细胞上调ALDH1mRNA及蛋白的表达,可能诱导ALDH1+乳腺癌肿瘤干细胞(cancer stemcell,CSC)的转化,并有一定的浓度依赖性。

关键词： TGF-β1 乙醛脱氢酶1 乳腺癌上皮-间质转化肿瘤干细胞

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miR-451调控早期糖尿病肾病小鼠肾小球肥大的机制

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重庆医科大学学报 2014年第11期39卷 1584-1589页

作者：彭睿周吉李天驹孙艳尹频彭惠民张政重庆医科大学基础医学院生物信息学教研室重庆400016 重庆医科大学基础医学院细胞生物学及遗传学教研室重庆400016 重庆医科大学第一附属医院感染科重庆400016 重庆医科大学实验教学中心重庆400331

目的:观察mi R-451对早期糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)db/db小鼠肾脏形态学影响,探讨mi R-451在DN发病机制中的作用。方法:采用24只7周龄雄性db/db小鼠和8只正常对照db/m小鼠依次分为未处理组、空质粒组、mi R-451组及对照组。... 详细信息

目的:观察mi R-451对早期糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)db/db小鼠肾脏形态学影响,探讨mi R-451在DN发病机制中的作用。方法:采用24只7周龄雄性db/db小鼠和8只正常对照db/m小鼠依次分为未处理组、空质粒组、mi R-451组及对照组。腹腔注射法进行质粒注射处理2周后,光镜下观察肾小球形态学变化,实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测肾脏组织mi R-451的表达水平,Western blot和激光共聚焦检测肾脏组织中mi R-451的靶基因酪氨酸-3单氧化酶/色氨酸单氧化酶活化蛋白(tyrosine3-monooxy-genase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein,Ywhaz)及其相关的丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途径中p38丝裂原激活的蛋白激酶(p38MAPK)及其上游激酶MKK3(MAPK kinase3)的表达水平。结果:7周龄db/db小鼠未处理组相比对照组出现高血糖且尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate,UAE)增加,提示进入早期DN阶段,给予30 mg/(kg·d)质粒注射实验2周。光镜观察和肾小球直径测量发现,mi R-451处理组肾小球形态减小(P=0.000)。Real-time PCR检测显示mi R-451组小鼠肾脏组织中mi R-451的表达水平增高1.79倍(P=0.002),Western blot和激光共聚焦结果显示,mi R-451组较未处理组和空质粒组肾脏组织Ywhaz的表达受到下调,同时p38MAPK及上游激酶MKK3蛋白表达水平减少(P均=0.000)。结论:mi R-451可能通过直接靶向Ywhaz基因,调控MAPK途径中关键蛋白p38MAPK、MKK3的表达,从而抑制肾小球肥大,在DN发病机制中可能起着重要的作用。

关键词：糖尿病肾病微小RNA 酪氨酸-3单氧化酶/色氨酸单氧化酶活化蛋白 p38丝裂原激活的蛋白激酶

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应用于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法

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第三军医大学学报 2006年第7期28卷 734-735页

作者：胡晓红刘昕黄正根彭惠民袁科程英高云重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室重庆400016 第三军医大学基础医学部分子遗传学教研室重庆400038

目的建立特异灵敏的适应于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法。方法于细菌样本离心所得沉淀中加入提取液(25%Chelex-100,0·5%NP40,TE配制,pH=9·0);56℃孵育30min;100℃水浴10min;离心后所得上清即为DNA。电泳、PCR及Real... 详细信息

目的建立特异灵敏的适应于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法。方法于细菌样本离心所得沉淀中加入提取液(25%Chelex-100,0·5%NP40,TE配制,pH=9·0);56℃孵育30min;100℃水浴10min;离心后所得上清即为DNA。电泳、PCR及Real-time PCR扩增评价该方法的特异性及灵敏度。结果本方法所提细菌DNA电泳条带清晰,未见假阳性,D(260)/D(280)=(1·79±0·03);PCR及Real-time PCR扩增未见假阳性及假阴性,灵敏度达101/ml细菌浓度。结论本研究细菌DNA提取方法特异灵敏,适应于PCR及Real-time PCR。

关键词： PCR 实时荧光定量PCR DNA提取

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乳腺癌前病变组织原代成纤维细胞生物学特征初步研究

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第三军医大学学报 2012年第1期34卷 16-19页

作者：孙艳彭琼乐王黎阳赵浏阳袁泉李俊柳满然重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室 400016 基础医学院细胞生物学及遗传学教研室重庆400016

目的比较乳腺导管不典型增生成纤维细胞(atypical intraductal hyperplasia fibroblasts,AFs)与正常乳腺成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)、乳腺癌肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)在生物学特征上的差异。方法采用Ⅰ型胶原酶法分离并培养AFs、NFs和CAFs,免疫细胞荧光化学检测其粘连蛋白(fibronectin,FN)表达以鉴定细胞纯度。比较3种细胞的细胞生长曲线、细胞周期和周期蛋白cyclin D1、p21waf1及p53的变化。结果获得并鉴定了NFs、AFs、CAFs;其生长速度依次增加(P<0.05),细胞周期S期百分比(8.24±2.47)、(16.94±4.77)、(33.31±7.90)依次增大(P<0.05);与NFs相比,AFs周期蛋白cyclin D1表达增加(P<0.05),p21waf1和p53蛋白表达降低(P<0.05);与CAFs相比,AFs的周期蛋白cyclin D1没有升高(P<0.05),p21waf1蛋白和p53蛋白表达更强(P<0.05)。结论 AFs相对于NFs和CAFs,细胞生长增殖具有特异性,这种变化提示乳腺肿瘤的癌前病变阶段AFs可能是NFs逐步向CAFs转变的过渡阶段。

关键词：乳腺癌微环境成纤维细胞细胞周期

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JNK在小鼠毛囊周期中的动态表达

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第三军医大学学报 2012年第22期34卷 2274-2277页

作者：王瑞敏星懿展郭海英何龙杨恬连小华查何彭惠民重庆医科大学基础医学院细胞生物学及遗传学教研室重庆400016 第三军医大学基础医学部细胞生物学教研室重庆400038 重庆大学生物工程学院重庆400030

目的研究JNK在生后小鼠背皮毛囊周期中的表达规律及探讨其对毛囊周期的调控作用。方法选择生后不同时期(1、7、14、16、21、31 d)C57BL/6J小鼠54只,采用RT-PCR技术,检测JNK mRNA在小鼠背皮毛囊周期中的表达情况;采用Western blot和免疫... 详细信息

目的研究JNK在生后小鼠背皮毛囊周期中的表达规律及探讨其对毛囊周期的调控作用。方法选择生后不同时期(1、7、14、16、21、31 d)C57BL/6J小鼠54只,采用RT-PCR技术,检测JNK mRNA在小鼠背皮毛囊周期中的表达情况;采用Western blot和免疫组化技术,进一步检测JNK蛋白在毛囊周期中的表达规律。结果 RT-PCR检测结果表明,在毛囊周期中,JNK1在生长早期(生后7、31 d)表达最强,退化期(生后16 d)和静止期(生后21 d)维持较弱的表达;JNK2在各时相点均有中等强度表达。单因素方差分析显示,JNK1的表达水平在生长早期(0.99±0.02)与静止期(0.30±0.01)间存在显著差异(P<0.05),JNK2在生长早期(0.77±0.01)与退化期(0.97±0.03)间存在显著差异(P<0.05)。Western blot与RT-PCR检测结果一致。免疫组化结果显示,在毛囊生长期,JNK主要表达于毛母质和外根鞘;进入退化期,JNK表达于外根鞘和上皮索;静止期毛囊中无表达。结论 JNK在毛囊周期中呈动态表达模式,生长期JNK可能通过影响毛母质细胞的增殖和/或分化来调节毛囊生长;退化期JNK可能涉及毛囊细胞的凋亡过程。

关键词： JNK 毛囊毛囊周期小鼠表达

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c-ski基因重组腺病毒质粒的构建及其对肿瘤相关成纤维细胞增殖的影响

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中国生物制品学杂志 2013年第12期26卷 1738-1742页

作者：王黎阳赵浏阳彭琼乐孙艳柳满然重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室重庆400016 重庆医科大学基础医学院细胞生物学及遗传学教研室重庆400016

目的构建携带c-ski基因的重组腺病毒质粒,并检测其对肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)增殖活力的影响。方法以pcDNA3-c-ski质粒为模板,PCR扩增c-ski基因,与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,构建重组穿梭质粒pAdT... 详细信息

目的构建携带c-ski基因的重组腺病毒质粒,并检测其对肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)增殖活力的影响。方法以pcDNA3-c-ski质粒为模板,PCR扩增c-ski基因,与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,构建重组穿梭质粒pAdTrack-c-ski,经PmeⅠ线性化后,转化感受态大肠埃希菌BJ5183,获得重组腺病毒质粒,经PacⅠ线性化后,转染HEK-293细胞,获得重组腺病毒,经扩增及纯化后测定病毒滴度。将纯化的重组腺病毒感染乳腺癌CAFs,采用Western blot法检测感染细胞中c-Ski蛋白的表达水平;MTT法和细胞计数法检测重组腺病毒对CAFs细胞增殖活力的影响。结果重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切鉴定证明构建正确;转染HEK-293细胞48 h后可见大量绿色荧光蛋白的表达,纯化的重组腺病毒的滴度为3.11×1010IFU/ml;感染重组腺病毒的乳腺癌CAFs中c-Ski蛋白的表达水平明显高于空病毒组和空白对照组(P<0.001),且增殖活力明显高于空白对照组(P<0.05)。结论成功构建了表达c-ski基因的重组腺病毒质粒,其可明显促进CAFs的增殖,为进一步研究c-Ski对CAFs增殖分化等生物学功能的影响及作用机制提供了实验依据。

关键词： c-ski基因腺病毒成纤维细胞细胞增殖

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miR-451靶向调控肾小球系膜细胞Ywhaz基因的表达

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中国生物制品学杂志 2013年第8期26卷 1107-1112页

作者：查何彭惠民马晶周吉王瑞敏尹频文利张政重庆医科大学分子医学及肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学基础医学实验教学中心重庆401331 重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室重庆400016

目的探讨miR-451对肾小球系膜细胞Ywhaz基因表达的靶向调控。方法应用生物信息学技术对miR-451的靶基因进行预测,PCR法扩增靶基因3′UTR全长片段,插入荧光素酶报告载体pmiR-RB-REPORTTMvector中,构建荧光素酶报告质粒pmiR-Ywhaz-3′UTR... 详细信息

目的探讨miR-451对肾小球系膜细胞Ywhaz基因表达的靶向调控。方法应用生物信息学技术对miR-451的靶基因进行预测,PCR法扩增靶基因3′UTR全长片段,插入荧光素酶报告载体pmiR-RB-REPORTTMvector中,构建荧光素酶报告质粒pmiR-Ywhaz-3′UTR。将miR-451 mimics和NC mimics分别转染高糖培养条件下的小鼠系膜细胞,将miR-451 inhibitor和NC inhibitor分别转染低糖培养条件下的小鼠系膜细胞,采用Real-time RT-PCR和Westernblot法检测miR-451和Ywhaz的表达水平;将miR-451 mimics和NC mimics分别与pmiR-Ywhaz-3′UTR共转染高糖培养条件下的小鼠系膜细胞,miR-451 inhibitor和NC inhibitor分别与pmiR-Ywhaz-3′UTR共转染低糖培养条件下的小鼠系膜细胞,检测各组细胞荧光素酶活性。结果 Ywhaz基因3′UTR区有11个碱基与miR-451种子序列匹配,其中7个碱基呈高度保守性;荧光素酶报告质粒经测序鉴定构建正确;miR-451在miR-451 mimics组呈高表达,在miR-451 inhibitor组表达降低;miR-451可抑制Ywhaz的蛋白表达;荧光素酶活性检测发现,miR-451可通过与Ywhaz3′UTR的结合,抑制Ywhaz的表达。结论 miR-451可直接靶向糖尿病相关基因Ywhaz,抑制其蛋白表达,为进一步研究miR-451调控早期糖尿病肾病发生发展的机制提供了依据。

关键词： miR-451 Ywhaz基因靶基因早期糖尿病肾病

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沉默整合素连接激酶基因对TCA8113舌癌细胞移植瘤生长的影响

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第三军医大学学报 2014年第19期36卷 1996-2000页

作者：幸宇齐进邓世雄陈俊霞重庆医科大学基础医学院法医生物信息学研究室重庆400016 细胞生物学及遗传学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆医科大学附属口腔医院牙体牙髓科重庆400015

目的研究沉默TCA8113舌癌细胞整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)基因的表达,对其下游底物Akt和GSK3β磷酸化状态及对移植瘤生长和自发性转移的影响。方法通过Lipofectamine 2000介导将特异性siILK表达载体和无同源性的对照载... 详细信息

目的研究沉默TCA8113舌癌细胞整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)基因的表达,对其下游底物Akt和GSK3β磷酸化状态及对移植瘤生长和自发性转移的影响。方法通过Lipofectamine 2000介导将特异性siILK表达载体和无同源性的对照载体,稳定转染人舌鳞癌TCA8113细胞,分为TCA8113组、TCA8113 vector组和TCA8113 siILK组,将3组细胞分别注入裸鼠皮下构建移植瘤模型,5周后检测瘤质量,对裸鼠肺及瘤组织形态学行常规病理学检查,使用免疫荧光技术检测体外和体内癌细胞p-Akt和p-GSK3β等的表达,并观察瘤组织内血管生成情况。结果 TCA8113组、TCA8113 vector组肺组织均发生自发性转移瘤,TCA8113 siILK组肺组织未发现自发性转移瘤;TCA8113 siILK组移植瘤细胞形态较其他2组体积减小,核分裂象较少,核浆比例缩小;TCA8113 siILK组在体内和体外实验中的p-Akt和p-GSK3β表达较其他2组均明显下降(P<0.05);TCA8113 siILK组移植瘤质量较其他2组显著降低(P<0.05),抑瘤率分别为84%和92%;TCA8113 siILK组移植瘤血管生成较其他2组也明显减少(P<0.05)。结论沉默TCA8113舌癌细胞ILK表达可抑制其下游信号传导分子Akt和GSK3β的磷酸化,并抑制移植瘤血管生成,从而抑制移植瘤的生长。

关键词：整合素连接激酶人舌鳞癌细胞移植瘤生长微血管

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lncRNA-Gm4419对高糖培养的肾小球系膜细胞增殖和纤维化的影响

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第三军医大学学报 2017年第3期39卷 216-222页

作者：易红彭睿孙艳罗勇军彭惠民李爱玲张政重庆医科大学基础医学院细胞生物学及遗传学教研室重庆400016 重庆医科大学基础医学院生物信息学教研室重庆400016 第三军医大学高原军事医学系军事医学地理学教研室重庆400038 重庆医科大学基础医学院实验教学中心重庆400016

目的探讨长链非编码Gm4419对高糖培养的小鼠肾小球系膜细胞增殖和纤维化的影响。方法荧光定量PCR检测Gm4419在糖尿病肾病肾脏组织及高糖培养的肾小球系膜细胞中的表达水平。设计合成Gm4419 siRNA,同时构建pcDNA3.1(+)-Gm4419过表达质粒... 详细信息

目的探讨长链非编码Gm4419对高糖培养的小鼠肾小球系膜细胞增殖和纤维化的影响。方法荧光定量PCR检测Gm4419在糖尿病肾病肾脏组织及高糖培养的肾小球系膜细胞中的表达水平。设计合成Gm4419 siRNA,同时构建pcDNA3.1(+)-Gm4419过表达质粒,并将Gm4419 siRNA和pcDNA3.1(+)-Gm4419过表达质粒分别转染至高低糖培养的肾小球系膜细胞,Ed U法检测转染后细胞的增殖能力;Western blot检测肾脏纤维标记蛋白的表达水平情况。结果 Gm4419在糖尿病肾病肾脏组织及高糖培养的肾小球系膜细胞中的表达水平较正常组及低糖组显著增高(P<0.01)。荧光定量PCR筛选出一条最佳干扰Gm4419的siRNA,转染高糖组后,与高糖mock组或对照组比较,高糖Gm4419 knockdown组细胞增殖能力减弱、纤维化标记蛋白表达减少(P<0.05)。此外,将酶切和测序结果证实构建成功的pcDNA3.1(+)-Gm4419过表达质粒转染至低糖组细胞,与低糖mock组或对照组相比,低糖Gm4419过表达组细胞增殖能力增强、纤维化标记蛋白表达水平增高(P<0.05)。结论lnc RNA-Gm4419参与糖尿病肾小球系膜增生和纤维化的调节。

关键词：长链非编码RNA Gm4419 肾小球系膜细胞增殖纤维化

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