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软骨同源蛋白1(CART1)敲低诱导MDA-MB-231乳腺癌细胞S期阻滞并抑制其侵袭和迁移

细胞与分子免疫学杂志 2016年第4期32卷 474-478页

作者：管停宏苏琳茜易永芬重庆医科大学基础医学院病理学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的运用外源性RNA干扰技术,敲低MDA-MB-231乳腺癌细胞中软骨同源蛋白1(CART1)基因的表达,研究CART1基因沉默后对MDA-MB-231细胞生物学行为的影响。方法采用人工合成的针对CART1基因的siRNA,用转染试剂RNAi MAX将CART1-siRNA转染MDA-MB-... 详细信息

目的运用外源性RNA干扰技术,敲低MDA-MB-231乳腺癌细胞中软骨同源蛋白1(CART1)基因的表达,研究CART1基因沉默后对MDA-MB-231细胞生物学行为的影响。方法采用人工合成的针对CART1基因的siRNA,用转染试剂RNAi MAX将CART1-siRNA转染MDA-MB-231细胞。实时定量PCR检测转染后CART1 mRNA水平,Western blot法检测转染后CART1蛋白水平,TranswellTM侵袭实验检测MDA-MB-231细胞侵袭、CCK-8法检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞周期的变化。结果 CART1-siRNA能有效沉默CART1在MDA-MB-231细胞中的表达,CART1沉默后MDA-MB-231细胞侵袭和增殖能力明显下降,S期细胞的比率增高而G2/M细胞比率减少。结论下调MDA-MB-231细胞CART1的表达,可降低其侵袭和增殖能力、诱导S期阻滞。

关键词：乳腺癌 CART1 RNA干扰侵袭增殖周期

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GM130对胃癌细胞O-糖基化及细胞粘附能力的影响

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重庆医科大学学报 2016年第6期41卷 563-568页

作者：苏琳茜冯阳阳管停宏张婉玉易永芬重庆医科大学基础医学院病理学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的:初步探讨沉默高尔基体基质蛋白130(golgi matrix protein 130,GM130)基因对胃癌细胞MKN-45 O-糖基化及细胞粘附能力的影响。方法:通过si RNA干扰胃癌细胞中GM130的表达水平,用Lipofectamine 2000将GM130-si RNA转染入MKN-45细胞。... 详细信息

目的:初步探讨沉默高尔基体基质蛋白130(golgi matrix protein 130,GM130)基因对胃癌细胞MKN-45 O-糖基化及细胞粘附能力的影响。方法:通过si RNA干扰胃癌细胞中GM130的表达水平,用Lipofectamine 2000将GM130-si RNA转染入MKN-45细胞。实验分为GM130-si RNA组、阴性对照组和空白对照组。分别用q RT-PCR和Western blot检测转染后各组中GM130、N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(polypeptide N-acetylgalactosaminyl transferase 2,pp Gal NAc-T2)、核心1β3半乳糖基转移酶(core 1 synthase,glycoprotein-N-acetylgalactosamine 3-β-galactosyltransferase1,C1Gal-T1)、β-半乳糖α-2,3-唾液酸转移酶1(beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase,ST3Gal-1)m RNA和蛋白表达的变化。应用凝集素流式细胞术检测3组细胞中α2,3唾液酸残基糖链结构的表达水平。肿瘤细胞与内皮细胞粘附实验及基质胶粘附实验检测细胞粘附能力。结果:q RT-PCR和Western blot结果显示GM130基因与蛋白水平明显受到抑制,表明转染成功;GM130-Si RNA组C1Gal-T1、ST3Gal-1的m RNA和蛋白表达水平均明显降低(P均<0.05),pp Gal NAc-T2在3组中无明显变化(P>0.05),α2,3唾液酸糖链结构的表达量降低(P<0.05),细胞粘附能力下降(P<0.05)。结论:在MKN-45细胞中,下调GM130后,可能通过下调C1Gal-T1、ST3Gal-1的表达影响胃癌细胞O-糖基化,降低肿瘤细胞粘附能力。

关键词：沉默高尔基体基质蛋白130 RNA干扰胃癌糖基化粘附

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人子宫颈癌肿瘤相关巨噬细胞浸润与T细胞亚型及临床病理特征的相关性分析

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基因组学与应用生物学 2016年第12期35卷 3235-3240页

作者：沈依帆徐曼王欣汪涛刘慧重庆医科大学基础医学院病理教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

为了探讨肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAMs)在人子宫颈癌微环境内的分布与T细胞亚型和临床病理特征的相关性,本研究应用S-P免疫组化法检测TAMs在60例子宫颈癌组织、10例高级别鳞状上皮内病变组织及10例子宫颈组织的... 详细信息

为了探讨肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAMs)在人子宫颈癌微环境内的分布与T细胞亚型和临床病理特征的相关性,本研究应用S-P免疫组化法检测TAMs在60例子宫颈癌组织、10例高级别鳞状上皮内病变组织及10例子宫颈组织的分布情况;间接免疫荧光双标法分析浸润的FOXP3^+Treg细胞数量、CD8^+T细胞数量及其粒酶B分泌情况。统计学分析TAMs数量与癌间质浸润的FOXP3^+Treg、CD8^+T数量和临床病理特征的相关性。结果显示TAMs在子宫颈癌微环境的数量均显著多于高级别鳞状上皮内病变和子宫颈组织(p<0.01,p<0.01),同时高级别鳞状上皮内病变组织阳性细胞数也明显多于子宫颈组织(p<0.01);TAMs数量与宫颈癌间质内浸润的FOXP3^+T细胞数量呈正相关性(p<0.05),且与淋巴结转移和癌栓相关(p<0.05,p<0.05),但与CD8^+T细胞浸润数量无明显相关性(p>0.05)。本实验发现TAMs在宫颈癌微环境内大量分布,且与肿瘤局部免疫抑制及淋巴结转移和癌栓有关。

关键词：肿瘤相关巨噬细胞宫颈癌 FOXP3^+Tregs CD8^+T 淋巴结转移

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下调MDA-MB-231乳腺癌细胞骨硬化蛋白(SOST)可增加间接共培养的MG-63成骨细胞的成骨作用

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细胞与分子免疫学杂志 2016年第11期32卷 1481-1485页

作者：程俊雄郭丹陈茜王婷黄佳祎重庆医科大学基础医学院病理生理学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学第二附属医院乳腺外科重庆400016

目的构建靶向抑制骨硬化蛋白(SOST)基因的小干扰RNA(siRNA)腺病毒,感染MDA-MB-231乳腺癌细胞并与MG-63成骨细胞共培养,检测对成骨相关分子表达的影响。方法针对SOST基因RNA序列设计带3个干扰片段的2对引物,以p B2B为模板,扩增"背靠... 详细信息

目的构建靶向抑制骨硬化蛋白(SOST)基因的小干扰RNA(siRNA)腺病毒,感染MDA-MB-231乳腺癌细胞并与MG-63成骨细胞共培养,检测对成骨相关分子表达的影响。方法针对SOST基因RNA序列设计带3个干扰片段的2对引物,以p B2B为模板,扩增"背靠背"排列的H1和U6启动子。两个PCR产物以Gibson DNA Assembly的方式同时连接腺病毒穿梭质粒p Ad Trace-OK,经同源重组、HEK293细胞包装获得SOST-siRNA腺病毒。感染MDA-MB-231乳腺癌细胞,实时定量PCR检测SOST mRNA的表达水平,ELISA检测SOST蛋白水平。将转染该腺病毒的MDA-MB-231细胞与MG-63成骨细胞间接共培养,实时定量PCR检测护骨因子(OPG)、骨钙蛋白(OCN)、整合素结合涎蛋白(IBSP)、核因子κB受体激活蛋白配体(RANKL)的表达情况。结果成功获得带3个干扰片段的腺病毒穿梭质粒,经同源重组和包装后,获得AdR-si SOST腺病毒。用该病毒感染MDA-MB-231细胞后,明显抑制SOST的表达。在乳腺癌骨转移体外模型中感染Ad-si SOST腺病毒,能导致MG-63细胞的OPG、OCN、IBSP mRNA表达上升,RANKL mRNA降低。结论在乳腺癌骨转移体外模型中感染Ad-si SOST腺病毒,能促进MG-63细胞的成骨分化,提高OPG/RANKL的比例。

关键词： SOST siRNA 腺病毒乳腺癌骨转移

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乳腺癌异常表达B7-H4对T细胞分泌细胞因子和凋亡的影响

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中国免疫学杂志 2016年第6期32卷 867-870,874页

作者：沈依帆黄文炼徐曼苏新良王欣汪涛重庆医科大学基础医学院病理教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学附属第一医院内分泌乳腺外科重庆400016

目的:探讨B7-H4在乳腺癌中的表达及其对外周血T细胞分泌细胞因子及增殖、凋亡的影响。方法:应用SP免疫组化法检测B7-H4在乳腺浸润性癌、癌旁组织和纤维腺瘤的表达。流式细胞术分析B7-H4对乳腺癌患者外周血活化T细胞增殖和凋亡的作用。EL... 详细信息

目的:探讨B7-H4在乳腺癌中的表达及其对外周血T细胞分泌细胞因子及增殖、凋亡的影响。方法:应用SP免疫组化法检测B7-H4在乳腺浸润性癌、癌旁组织和纤维腺瘤的表达。流式细胞术分析B7-H4对乳腺癌患者外周血活化T细胞增殖和凋亡的作用。ELISA芯片检测T细胞培养上清液细胞因子的含量。结果:B7-H4在乳腺浸润性癌的阳性表达率为84.62%(44/52),显著高于癌旁组织和纤维腺瘤组织(P<0.01,P<0.01)。体外淋巴细胞混合培养结果显示,与空白组比较,B7-H4对乳腺癌患者外周血活化T细胞的增殖指数Ki67无明显影响;但B7-H4诱导CD8^+T细胞凋亡的作用强于CD4^+T细胞。B7-H4组FOXP3^+T/CD4^+T也高于空白组(P<0.05)。B7-H4组较空白组细胞培养上清液中TGF-β1、IL-17含量均显著增高(P<0.05,P<0.05)。结论:乳腺浸润性癌异常表达B7-H4。B7-H4在体外能促进CD8^+T细胞凋亡、促进T细胞分泌TGF-β1和IL-17。B7-H4在削弱乳腺癌微环境的抗肿瘤细胞免疫中发挥一定作用。

关键词： B7-H4 乳腺癌 CD8^+T细胞细胞凋亡 TGF-β1 IL-17

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抑制GM130表达对胃癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响

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第三军医大学学报 2015年第12期37卷 1217-1221页

作者：冯阳阳陈婕牟玲苏琳茜易永芬重庆医科大学基础医学院病理学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的分析GM130在不同分化人胃癌细胞系的差异表达,利用小干扰RNA技术来沉默GM130基因,研究其对胃癌细胞生物学行为的影响。方法体外培养3株不同分化程度胃癌细胞系(高分化MKN-28、中分化SGC-7901、低分化MKN-45),Western blot和RT-PCR... 详细信息

目的分析GM130在不同分化人胃癌细胞系的差异表达,利用小干扰RNA技术来沉默GM130基因,研究其对胃癌细胞生物学行为的影响。方法体外培养3株不同分化程度胃癌细胞系(高分化MKN-28、中分化SGC-7901、低分化MKN-45),Western blot和RT-PCR筛选出高表达的GM130细胞株MKN-45、SGC-7901,设计并化学合成、转染、筛选出针对GM130的小干扰RNA片段。通过MTT、Transwell、Matrigel侵袭实验,观测下调GM130后对胃癌细胞株的生物学行为影响,Western blot检测细胞中MMP-2、MMP-9蛋白的变化。结果 Western blot和RT-PCR检测结果显示,在MKN-45、SGC-7901细胞中GM130蛋白和mRNA水平呈现高表达水平。Western blot和qRT-PCR结果显示在低分化胃癌MKN-45细胞中,GM130-siRNA-519转染组GM130基因的表达水平显著抑制(P<0.05)。与对照组相比,抑制转染组细胞的增殖、迁移能力明显下降,穿膜细胞数明显减少,MMP-2、MMP-9的蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论抑制GM130基因的表达下调可显著降低胃癌细胞的增殖和体外侵袭转移能力。

关键词： GM130 RNA干扰胃肿瘤增殖侵袭迁移

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Sulfiredoxin-1通过调节peroxiredoxins表达提高大鼠星形胶质细胞抗氧化作用

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基础医学与临床 2014年第9期34卷 1193-1198页

作者：周杨周云川巫静娴喻姗姗赵涌重庆医科大学基础医学院病理学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的探讨内源性抗氧化小分子蛋白Sulfiredoxin-1（Srxn1）对H2O2诱导的星形胶质细胞的抗氧化作用以及对内源性氧化应激防御系peroxiredoxins的调节作用.方法 Srxn1干扰慢病毒载体转染体外培养的大鼠原代星形胶质细胞;构建H2O2氧化应激... 详细信息

目的探讨内源性抗氧化小分子蛋白Sulfiredoxin-1（Srxn1）对H2O2诱导的星形胶质细胞的抗氧化作用以及对内源性氧化应激防御系peroxiredoxins的调节作用.方法 Srxn1干扰慢病毒载体转染体外培养的大鼠原代星形胶质细胞;构建H2O2氧化应激模型,采用LDH方法检测细胞损伤程度,用超氧化物歧化酶（SOD）分析细胞内氧化应激状态;Western blot检测Srxn1的表达与Prdx Ⅰ～Ⅳ和Prdx-SO2/3H（过氧化Prdx）活性的关系.结果 1）ShSrxn1干扰后,Srxn1蛋白水平下调59.2％（P＜0.01）,基因水平下调63.6％（P＜0.01）.2）干扰Srxn1增加H2O2后LDH漏出率（P＜0.01）并使氧化应激损伤显著加重、使Prdx Ⅰ ～Ⅳ的表达降低,Prdx-SO2/3H的表达显著增高（P＜0.01或P＜0.05）.结论 Srxn1减轻H2O2诱导的星形胶质细胞的氧化应激损伤,并可能是通过调节Prdxs的活性来完成的.

关键词： Sulfiredoxin-1 干扰星形胶质细胞 H2O2 peroxiredoxin

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MIBG对人肝癌HepG2细胞增殖的影响

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基础医学与临床 2014年第9期34卷 1221-1225页

作者：刘逢秋管小琴王娅兰苏晏重庆医科大学基础医学院病理学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的探究间碘苄胍(MIBG)对肝癌细胞HepG2增殖的影响及其可能机制。方法细胞免疫荧光法检测HepG2细胞中精氨酸特异性单腺苷二磷酸核糖基化转移酶1(ART1)的表达。MTT比色实验检测肝癌细胞HepG2的生存率。流式细胞计数法检测细胞周期。West... 详细信息

目的探究间碘苄胍(MIBG)对肝癌细胞HepG2增殖的影响及其可能机制。方法细胞免疫荧光法检测HepG2细胞中精氨酸特异性单腺苷二磷酸核糖基化转移酶1(ART1)的表达。MTT比色实验检测肝癌细胞HepG2的生存率。流式细胞计数法检测细胞周期。Westrenblot检测ART1、RhoA、c-myc和cyclinA1的表达。结果ART1在HepG2细胞有表达。MIBG对HepG2细胞增殖抑制呈剂量依赖性(P<0.05),主要是将细胞阻滞在S期(P<0.05)。MIBG能降低ART1、RhoA、c-myc和cyclinA1的表达水平(P<0.05)。结论MIBG通过影响RhoA信号通路,下调c-myc蛋白和cyclinA1蛋白的表达,将细胞阻滞在S期,而抑制HepG2细胞的增殖。

关键词：肝癌细胞增殖单腺苷二磷酸核糖基化间碘苄胍

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过表达Wnt3基因抑制肝前体细胞凋亡

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南方医科大学学报 2014年第1期34卷 46-50页

作者：张锡峰胡代曦张超钟沁冯涛黄佳祎重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学基础医学院病理生理学教研室重庆400016

目的利用腺病毒载体转染体外培养的肝前体细胞,研究过表达Wnt3对肝前体细胞凋亡的影响。方法用携带Wnt3的腺病毒载体(Ad-Wnt3)转染肝前体细胞,同时设立空载体腺病毒转染组(Ad-GFP)为对照。转染72 h后,用荧光显微镜观察Hoechst33342染色... 详细信息

目的利用腺病毒载体转染体外培养的肝前体细胞,研究过表达Wnt3对肝前体细胞凋亡的影响。方法用携带Wnt3的腺病毒载体(Ad-Wnt3)转染肝前体细胞,同时设立空载体腺病毒转染组(Ad-GFP)为对照。转染72 h后,用荧光显微镜观察Hoechst33342染色后细胞凋亡情况;流式细胞术检测Annexin-PE/7-ADD法标记的细胞凋亡率;RT-PCR和Western blot分别检测细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Bcl-xl的mRNA及蛋白表达水平。结果 qRT-PCR和Western blot结果显示,Wnt3在肝前体细胞中特异性表达,表明腺病毒系统Ad-Wnt3能高效转染肝前体细胞。与对照组相比较,肝前体细胞转染Wnt3后,肝前体细胞的凋亡水平明显下降,凋亡相关蛋白Bcl-2和Bcl-xl的mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。Bax的mRNA及蛋白表达水平则明显下降(P<0.05)。结论在肝前体细胞中,Wnt3基因过表达能抑制肝前体细胞凋亡,其机制可能是通过Bcl-2家族起作用。

关键词：肝前体细胞抗凋亡 Wnt3

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shRNA抑制高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ基因的表达对胃癌细胞侵袭力的影响及机制

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重庆医科大学学报 2014年第3期39卷 310-317页

作者：张璐杨雅莹黄子洋易永芬重庆医科大学基础医学院病理学教研室、分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学附属第一医院老年科重庆400016

目的:初步分析高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(Golgi alpha-mannosidaseⅡ,GMⅡ)在低中不同分化人胃癌细胞系中的差异表达,以探讨GMⅡ在胃癌发生发展中的作用。方法:应用阳离子脂质体法将合成的靶向GMⅡ基因的pGPU6/GFP/Neo-GMⅡ-1406质粒载体... 详细信息

目的:初步分析高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(Golgi alpha-mannosidaseⅡ,GMⅡ)在低中不同分化人胃癌细胞系中的差异表达,以探讨GMⅡ在胃癌发生发展中的作用。方法:应用阳离子脂质体法将合成的靶向GMⅡ基因的pGPU6/GFP/Neo-GMⅡ-1406质粒载体,分别转染至低分化胃癌细胞MGC-803和中分化胃癌细胞SGC-7901中,然后荧光倒置显微镜观察并计算转染率,最后经过G418筛选出稳定转染的细胞株。应用RT-PCR和Western blot检测转染后GMⅡ和E-cadherin、α-catenin的mRNA及蛋白表达变化情况,同时利用细胞划痕实验和Transwell体外侵袭实验来测定GMⅡ被沉默后两株细胞侵袭能力的变化。结果:GMⅡ短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)转染胃癌MGC-803和SGC-7901细胞后GMⅡ的mRNA和蛋白表达明显抑制,而E-cadherin和α-catenin的2种因子检测结果明显升高(P<0.05);细胞划痕实验结果显示,转染重组质粒pGPU6/GFP/Neo-GMⅡ-1406组(GMⅡshRNA组)与对照组(空白对照组,阴性对照组)相比,GMⅡ被沉默后的胃癌细胞的侵袭能力降低(P<0.05);Transwell体外侵袭实验中GMⅡshRNA组胃癌细胞较空白对照组、阴性对照组细胞侵袭能力都明显降低,18 h穿过小室的细胞数分别为:(65±5)、(197±6)、(186±5),(72±4)、(178±4)、(184±5)个与对照组相比差别具有统计学意义(MGC-803:P=0.000,SGC-7901:P=0.000)。结论 :GMⅡ基因沉默后的胃癌细胞的侵袭能力下降,可能与上调E-cadherin、α-catenin的表达有关。

关键词：高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ 短发卡RNA 胃癌侵袭

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