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中国生物制品学杂志 2013年第10期26卷 1445-1448,1453页

作者：廖刚王子卫张能董浦江汤为学重庆医科大学附属第一医院胃肠外科重庆400016 云南省第一人民医院普通外科云南昆明650032 重庆医科大学附属第一医院实验研究中心重庆400016 重庆医科大学基础医学院病理生理学教研室重庆400016

目的探讨人表皮生长因子受体显性负性突变体(dominant negative epidermal growth factor receptor,DNEGFR)对人胃癌细胞体外生长能力的影响及其分子机制。方法用质粒pEGFPN1-DNEGFR转染人胃癌NCI-N87和SGC-7901细胞,并筛选稳定转染细胞... 详细信息

目的探讨人表皮生长因子受体显性负性突变体(dominant negative epidermal growth factor receptor,DNEGFR)对人胃癌细胞体外生长能力的影响及其分子机制。方法用质粒pEGFPN1-DNEGFR转染人胃癌NCI-N87和SGC-7901细胞,并筛选稳定转染细胞株;采用MTT法检测人胃癌细胞体外生长能力,末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记[terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)mediated deoxyuridine triphosphate(dUTP)nick-end labeling,TUNEL]法检测细胞凋亡情况,ELISA法检测胞浆中活性caspase-3蛋白水平,Western blot法检测ser 9位点磷酸化糖原合成激酶-3β[phosphorylated glycogen synthase kinase-3 beta,pGSK-3β(ser 9)]蛋白表达水平。结果成功筛选出4株稳定转染细胞株;质粒pEGFPN1-DNEGFR分别转染的NCI-N87和SGC-790细胞体外生长能力均降低,凋亡指数(apoptotic index,AI)均升高,胞浆中活性caspase-3蛋白水平均升高,pGSK-3β(ser 9)蛋白水平均降低,与对应的空质粒转染组及未转染组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 DNEGFR通过caspase相关的凋亡信号转导通路及糖原合成激酶-3β(GSK-3β)促凋亡作用诱导胃癌细胞凋亡,使其体外生长能力明显降低,为DNEGFR在胃癌生物治疗中的深入研究提供了部分理论依据,为胃癌的生物治疗提供了新思路。

关键词：人表皮生长因子受体显性负性突变体胃癌细胞凋亡

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人EGFR显性负性突变体抑制胃癌细胞促血管形成能力

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中国组织化学与细胞化学杂志 2013年第3期22卷 179-184页

作者：廖刚王子卫张能董浦江汤为学重庆医科大学附属第一医院胃肠外科重庆400016 云南省第一人民医院普通外科昆明650032 重庆医科大学附属第一医院实验研究中心重庆医科大学基础医学院病理生理学教研室重庆400016

目的探讨人表皮生长因子显性负性突变体(dominant negative epidermal growth factor receptor,DNEGFR))对胃癌细胞促血管形成能力的影响及其分子机制,并检测其对裸鼠皮下移植瘤生长的影响。方法选用2株人胃癌细胞,分为如下6组:SGC-7901... 详细信息

目的探讨人表皮生长因子显性负性突变体(dominant negative epidermal growth factor receptor,DNEGFR))对胃癌细胞促血管形成能力的影响及其分子机制,并检测其对裸鼠皮下移植瘤生长的影响。方法选用2株人胃癌细胞,分为如下6组:SGC-7901及NCI-N87细胞未转染组(US组,UN组),SGC-7901及NCI-N87细胞pEGFP-N1质粒转染组(ES组,EN组),SGC-7901及NCI-N87细胞pEGFPN1-DNEGFR质粒转染组(DS组,DN组)。采用人脐静脉内皮细胞(humanumbilical vein endothelial cell,HUVEC)管腔结构形成实验检测体外促血管形成能力,采用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定细胞培养液中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的水平,建立人胃癌细胞裸鼠移植瘤模型,标本微血管密度(microvessel density,MVD)检测体内促血管形成能力,标本体积检测其对裸鼠皮下移植瘤生长的影响。结果转染pEGFPN1-DNEGFR质粒的人胃癌细胞株出现HUVEC管腔结构形成抑制,培养液中VEGF水平降低,MVD计数降低,裸鼠皮下移植瘤体积变小。结论 DNEGFR可能通过下调VEGF分泌抑制胃癌细胞体外及裸鼠体内促血管形成能力,最终抑制裸鼠皮下移植瘤生长。

关键词：促血管形成能力显性负性突变体胃癌血管内皮生长因子表皮生长因子受体

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PARG基因沉默对大肠癌CT26细胞移植瘤生长与转移的影响

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复旦学报（医学版） 2012年第4期39卷 348-352,359页

作者：盛永涛王娅兰杨怡王洁琼重庆医科大学基础医学院病理学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的探讨聚腺苷二磷酸核糖水解酶[poly-(ADP-ribose)glycohydrolase,PARG]基因沉默经AKT途径对大肠癌细胞肝转移的影响及其可能机制。方法用未转染的CT26细胞、慢病毒空载体转染的CT26细胞和PARG-shRNA慢病毒载体转染的CT26细胞接种至BA... 详细信息

目的探讨聚腺苷二磷酸核糖水解酶[poly-(ADP-ribose)glycohydrolase,PARG]基因沉默经AKT途径对大肠癌细胞肝转移的影响及其可能机制。方法用未转染的CT26细胞、慢病毒空载体转染的CT26细胞和PARG-shRNA慢病毒载体转染的CT26细胞接种至BALB/c小鼠脾包膜下,建立相应的肝转移模型,比较各组脾脏移植瘤及肝脏转移瘤结节的差异。进一步用Western blot法检测各组脾脏移植瘤PARG、聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1[poly-(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1]、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,即AKT)、P-AKT473、核转录因子-κB p65(nuclear factor-kappaB p65,NF-κB p65)、血管内皮细胞生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF,即FGF-2)的表达。结果与对照组相比,PARG沉默组脾脏移植瘤体积较小(P<0.05),肝转移瘤结节数量减少(P<0.05);脾脏移植瘤的PARG、PARP-1、NF-κB p65、VEGF、FGF-2蛋白表达显著减弱(P均<0.05),P-AKT473的表达明显增强(P<0.05)。结论 CT26细胞系的PARG表达抑制后,可以抑制大肠癌CT26细胞移植瘤的生长与转移,这可能与PARG抑制使AKT磷酸化增强,从而降低了VEGF、FGF-2等血管生成相关因子的表达有关。

关键词：聚腺苷二磷酸核糖水解酶(PARG) 蛋白激酶B(AKT)磷酸化结肠癌肝转移

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RNA干扰ART1表达对小鼠结肠癌细胞增殖的影响及其机制探讨

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肿瘤 2012年第12期32卷 949-954页

作者：徐剑侠王娅兰唐怡熊薇重庆医科大学基础医学院病理学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的:通过短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰精氨酸特异性腺苷二磷酸核糖基化转移酶1(arginine-specific adenosinediphosphate-ribosyltransferase 1,ART1)基因的表达,研究沉默ART1基因对小鼠结肠癌CT26细胞增殖的影响及可能的机制。方法:细胞免疫荧光法检测ART1水平,以证实CT26细胞中有ART1的表达。用ART1-shRNA和阴性对照shRNA(negative control-shRNA,NC-shRNA)慢病毒感染CT26细胞后,分别采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测各组细胞中ART1mRNA和ART1、RhoA、c-myc及c-fos蛋白的表达;CCK-8(cell countingkit-8)法分析各组细胞增殖情况。结果:CT26细胞中有ART1的表达。ART1-shRNA和NC-shRNA慢病毒成功感染细胞,获得稳定低表达ART1基因的CT26细胞株。与感染NC-shRNA慢病毒和未感染的CT26细胞相比,感染ART1-shRNA慢病毒的CT26细胞中ART1mRNA表达水平及ART1、RhoA、c-myc和c-fos的蛋白表达水平均显著降低(P<0.01),而细胞增殖抑制率明显升高(P<0.01)。结论:干扰ART1表达可抑制CT26细胞增殖,提示ART1在肿瘤生长、增殖过程中发挥重要作用,其机制可能与ART1基因沉默后RhoA及其下游因子c-myc和c-fos的表达被抑制有关。

关键词：结肠肿瘤糖基转移酶类 RNA干扰细胞增殖 Rho因子 ART1

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姜黄素对转化生长因子-β1诱导的乳腺癌MDA-MB-231细胞基质金属蛋白酶-9表达及其侵袭能力的影响

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中国生物制品学杂志 2012年第10期25卷 1329-1335页

作者：磨娜曹友德蒋金李静重庆医科大学基础医学院病理教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的研究姜黄素对转化生长因子-β1(Transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)诱导的人乳腺癌MDA-MB-231细胞基质金属蛋白酶-9(Matrix metallopeptidase-9,MMP-9)表达及其侵袭能力的影响,探讨姜黄素在防治TGF-β1诱导的乳腺癌侵袭转移中可能的作用机制。方法采用CCK-8法检测姜黄素对MDA-MB-231细胞的细胞毒性作用。将MDA-MB-231细胞分为阴性对照组(无血清RPMI1640培养基/DMSO)、TGF-β1处理组(无血清RPMI1640培养基/DMSO+10 ng/ml TGF-β1),姜黄素+TGF-β1处理组(无血清RPMI1640培养基+5、7.5、10μmol/L姜黄素+10 ng/ml TGF-β1)。处理24 h后,采用侵袭小室试验观察细胞的侵袭能力;处理不同时间后,采用Western blot法检测细胞MMP-9、p-Smad2、p-ERK1/2以及p-p38的表达,明胶酶谱法检测各组细胞上清液中MMP-9的活性变化;以ERK特异性抑制剂PD98059、p38特异性抑制剂SB202580、姜黄素和/或TGF-β1处理细胞48 h,采用Western blot和明胶酶谱法检测MMP-9的表达。结果低浓度姜黄素(≤10μmol/L)对MDA-MB-231细胞无明显的细胞毒性作用;姜黄素呈剂量依赖性明显减少了TGF-β1诱导的细胞穿膜数量(P<0.001);姜黄素可显著抑制TGF-β1诱导的MDA-MB-231细胞MMP-9、p-Smad2、p-ERK1/2及p-p38蛋白的表达,且呈浓度、时间依赖性(P<0.05);姜黄素随浓度的增加,对TGF-β1诱导的MDA-MB-231细胞MMP-9活性的抑制作用明显增强(P<0.05);PD98059抑制MMP-9蛋白表达及活性的作用与姜黄素相似,而SB202580对MMP-9无明显影响。结论姜黄素可能通过TGF-β/Smad、TGF-β/ERK信号通路下调TGF-β1诱导的MMP-9的表达及其活性,从而抑制肿瘤的侵袭能力。

关键词：姜黄素乳腺癌转化生长因子-β1 基质金属蛋白酶-9 绝裂原活化的蛋白激酶肿瘤侵润

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过表达整合素连接激酶肺癌A549细胞的建立及生物学活性

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细胞与分子免疫学杂志 2012年第4期28卷 340-343页

作者：胡海艳陈全陈炎刘革力张璐渝重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学基础医学院免疫学教研室重庆400016

目的:建立稳定过表达整合素连接激酶(ILK)的肺癌A549细胞模型,探讨ILK过表达对肺癌A549细胞生物学活性的影响。方法:以RT-PCR法扩增人ILK基因,构建pEGFP-ILK重组质粒。经酶切及测序鉴定后,将pEGFP-ILK质粒用脂质体转染肺癌A549细胞,G41... 详细信息

目的:建立稳定过表达整合素连接激酶(ILK)的肺癌A549细胞模型,探讨ILK过表达对肺癌A549细胞生物学活性的影响。方法:以RT-PCR法扩增人ILK基因,构建pEGFP-ILK重组质粒。经酶切及测序鉴定后,将pEGFP-ILK质粒用脂质体转染肺癌A549细胞,G418压力筛选出稳定转染细胞克隆并扩大培养(A549/pEGFP-ILK组),设pEGFP-C1空质粒转染A549细胞(A549/pEGFP-C1组)及空白A549细胞对照组。用荧光显微镜观察EGFP-ILK融合蛋白的表达及细胞内定位,RT-PCR法检测各组细胞中ILK mRNA的转录水平,Western blot法检测各组细胞中ILK蛋白表达水平,MTT比色法检测各组细胞的增殖活力,流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况,HE染色观察细胞形态变化。结果:酶切及测序证实,pEGFP-ILK重组质粒构建成功。该质粒转染A549细胞、并经G418压力筛选后,获得了表达绿色荧光蛋白的稳定转染株,ILK基因表达产物主要定位于细胞质内。与对照组相比,A549/pEGFP-ILK细胞ILK的mRNA及蛋白表达水平明显升高,其过表达率分别为218.18%和245.45%(P<0.05);过表达ILK的A549细胞增殖活力显著增强(P<0.05);凋亡水平被显著抑制(P<0.05);过表达ILK的A549细胞的核分裂相增多。结论:成功建立过表达ILK肺癌细胞模型,ILK过表达可促进癌细胞增殖、抗凋亡及核分裂相增多。

关键词：整合素连接激酶过表达质粒肺癌细胞增殖细胞凋亡

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靶向SATB1基因的短发夹RNA诱导肺癌A549细胞凋亡

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肿瘤 2012年第7期32卷 501-506页

作者：蒋金曹友德磨娜莫显刚重庆医科大学基础医学院病理教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 贵阳医学院附属医院综合病房贵阳550004

目的:探讨靶向SATB1(special AT-rich sequence-binding protein-1)基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对肺癌A549细胞凋亡的影响及其可能的机制。方法:构建靶向SATB1基因的shRNA重组质粒SATB1-shRNA,采用脂质体法将其转染至A549细胞;分别采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测A549细胞中SATB1、Bcl-2、BaxmRNA和SATB1、Bcl-2、Bax、caspase3蛋白的表达水平;FCM检测A549细胞的凋亡率。结果:成功构建了SATB1-shRNA重组质粒;SATB1-shRNA转染A549细胞后,SATB1、Bcl-2 mRNA及其蛋白表达下调,Bax mRNA和Bax、caspase3蛋白表达上调(P<0.05)。SATB1-shRNA转染组细胞凋亡率[(14.18±1.59)%]较对照组[(1.84±0.57)%]明显增加(P<0.01)。结论:SATB1-shRNA可显著下调肺癌A549细胞中SATB1基因的表达水平并诱导细胞凋亡,其机制可能与下调Bcl-2基因表达所引起的级联效应有关。

关键词：肺肿瘤 RNA,小分子干扰细胞凋亡基因,SATB1

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靶向性抗肿瘤VEGF-α-Gal融合蛋白的原核表达、纯化及其体外活性

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中国生物制品学杂志 2012年第1期25卷 56-60页

作者：郑毅陈全蒋攀刘革力张路瑜重庆医科大学基础医学院免疫学教研室重庆400016 重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的原核表达、纯化靶向性抗肿瘤VEGF-α-Gal融合蛋白,并检测其体外靶向性和抗肿瘤效应。方法从人肺腺癌A549细胞中扩增VEGF-α-Gal融合基因,插入pQE30载体,构建重组表达质粒pQE30-VEGF-α-Gal,转化至大肠杆菌M15中,IPTG诱导表达,SDS-P... 详细信息

目的原核表达、纯化靶向性抗肿瘤VEGF-α-Gal融合蛋白,并检测其体外靶向性和抗肿瘤效应。方法从人肺腺癌A549细胞中扩增VEGF-α-Gal融合基因,插入pQE30载体,构建重组表达质粒pQE30-VEGF-α-Gal,转化至大肠杆菌M15中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析重组融合蛋白的表达量及表达形式,Western blot分析重组蛋白的反应原性。经Ni-AgaroseHis标签蛋白纯化试剂盒纯化重组融合蛋白rVEGF-α-Gal,包涵体复性后,通过体外细胞黏附试验评价其VEGFR靶向性,血清杀伤试验分析其α-Gal模拟表位的体外抗肿瘤活性。结果重组表达质粒pQE30-VEGF-α-Gal经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约为18 000,诱导5 h表达量最高,约占菌体总蛋白的15%,主要以包涵体形式表达;重组融合蛋白可分别与抗VEGF、抗α-Gal抗体特异性结合;纯化的重组蛋白纯度约为90%,可黏附VEGFR+的A549细胞,且其α-Gal模拟表位在人新鲜血清的参与下,对A549细胞产生了明显的溶细胞效应。结论成功表达并纯化了重组融合蛋白rVEGF-α-Gal,该蛋白不但具有VEGFR靶向性,还兼具α-Gal表位功能,为研发新型靶向肿瘤生物制剂奠定了基础。

关键词：肿瘤靶向性血管内皮生长因子类 α-半乳糖重组融合蛋白质类抗肿瘤活性

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人肺癌ILK基因siRNA重组表达质粒的构建及其对A549细胞增殖的影响

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中国生物制品学杂志 2012年第10期25卷 1295-1298页

作者：陈炎胡海燕刘革力张璐渝陈全重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学基础医学院免疫学教研室重庆400016

目的构建人肺癌整合素连接激酶(Integrin-linked kinase,ILK)基因siRNA重组表达质粒,并检测其对人肺腺癌A549细胞增殖的影响。方法人工合成靶向ILK基因的siRNA干扰序列,克隆至载体pGenesil-1中,构建重组表达质粒pGenesil-1-ILK,利用脂... 详细信息

目的构建人肺癌整合素连接激酶(Integrin-linked kinase,ILK)基因siRNA重组表达质粒,并检测其对人肺腺癌A549细胞增殖的影响。方法人工合成靶向ILK基因的siRNA干扰序列,克隆至载体pGenesil-1中,构建重组表达质粒pGenesil-1-ILK,利用脂质体转染A549细胞,经G418稳定筛选后,采用RT-PCR和Western blot检测细胞中ILK基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平,MTT法检测细胞的增殖活力。结果重组表达质粒pGenesil-1-ILK经SalⅠ单酶切及测序证明构建正确,其转染A549细胞后,细胞ILK基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均明显降低(P<0.05),且细胞的增殖能力也显著降低(P<0.05)。结论成功构建了人ILK基因siRNA重组表达质粒,ILK基因沉默可显著抑制A549细胞增殖,为肺癌靶向基因治疗的研究提供了新的思路。

关键词：肺癌 ILK基因 RNA干扰 A549细胞细胞增殖

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过表达高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ对人胃癌BGC-823细胞凋亡的影响

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中国生物制品学杂志 2012年第7期25卷 829-833页

作者：李钒杨雅莹易永芬重庆医科大学基础医学院病理教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的探讨过表达高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(Golgiα-mannosidaseⅡ,GMⅡ)对人胃癌BGC-823细胞凋亡的影响。方法构建GMⅡ基因真核过表达质粒EX-E2372-M03,通过脂质体Lipofectamine 2000转染BGC-823细胞,用400 mg/LG418筛选稳定转染的细胞... 详细信息

目的探讨过表达高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(Golgiα-mannosidaseⅡ,GMⅡ)对人胃癌BGC-823细胞凋亡的影响。方法构建GMⅡ基因真核过表达质粒EX-E2372-M03,通过脂质体Lipofectamine 2000转染BGC-823细胞,用400 mg/LG418筛选稳定转染的细胞。采用RT-PCR和Western blot分别检测转染后细胞中GMⅡ基因mRNA的转录水平以及蛋白的表达水平,Hoechst 33258荧光染色法和流式细胞术(Annexin V/PI双染)检测过表达GMⅡ后细胞的凋亡情况。结果转染重组质粒EX-E2372-M03后,BGC-823细胞GMⅡ基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平明显增加(P<0.05);细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。结论过表达GMⅡ可能通过抑制胃癌细胞的凋亡,进而促进胃癌的发生发展。

关键词：高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ 胃癌细胞凋亡

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