检索结果-内蒙古大学图书馆

生物技术通报 2009年第11期25卷 89-91,97页

作者：郭荫广陈全朱大冕重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学基础医学院免疫学教研室重庆400016

构建与增强型绿色荧光蛋白基因相连的糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidylinositol,GPI)序列的真核表达质粒,并检测其在A549细胞中的表达。分离人外周血淋巴细胞,提取总RNA,以RT-PCR法扩增CD24基因的243bpGPI锚定序列,双酶切后定向... 详细信息

构建与增强型绿色荧光蛋白基因相连的糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidylinositol,GPI)序列的真核表达质粒,并检测其在A549细胞中的表达。分离人外周血淋巴细胞,提取总RNA,以RT-PCR法扩增CD24基因的243bpGPI锚定序列,双酶切后定向克隆入pEGFP-C1质粒中,构建并鉴定pEGFP-C1-GPI质粒。经脂质体介导转染A549细胞后,在荧光显微镜下观察目的蛋白在真核细胞内的表达情况。经酶切和测序鉴定证实,所克隆的CD24GPI序列正确,荧光显微镜观察pEGFP-C1-GPI质粒转染A549细胞可见围绕细胞膜的强绿色荧光,而对照pEGFP-C1质粒转染A549细胞仅见胞内均匀荧光。成功构建与EGFP相连的GPI真核表达质粒,且能在A549细胞膜上锚定表达EGFP-GPI融合蛋白,为构建锚定表达型肿瘤疫苗奠定基础。

关键词： GPI 真核表达载体 A549 绿色荧光蛋白

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肿瘤特异的sea基因真核表达质粒的构建及在肺癌细胞中的功能研究

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生物技术通报 2009年第5期25卷 109-112,121页

作者：朱大冕陈全李奕璇朱道银重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学基础医学院免疫学教研室重庆400016

构建Survivin启动子调控的葡萄球菌肠毒素A(SEA)的真核表达质粒,检测其在人肺腺癌A549细胞中的特异性表达以及表达产物的超抗原活性。以PCR法扩增sea基因,以含有Survivin启动子为调控序列的pGL-S-RED质粒为基础,构建pGL-S-SEA真核表达... 详细信息

构建Survivin启动子调控的葡萄球菌肠毒素A(SEA)的真核表达质粒,检测其在人肺腺癌A549细胞中的特异性表达以及表达产物的超抗原活性。以PCR法扩增sea基因,以含有Survivin启动子为调控序列的pGL-S-RED质粒为基础,构建pGL-S-SEA真核表达质粒。用脂质体转染A549细胞,以RT-PCR法检测sea基因表达水平。制备健康献血者PBMC,用pGL-S-SEA质粒转染A549细胞的上清液和细胞裂解液进行PBMC刺激试验,以MTT法检测其促细胞增殖效应。结果显示,成功构建Survivin启动子调控的真核表达质粒pGL-S-SEA。重组质粒在A549细胞中启动了sea基因的表达,其转录强度为内参(GADPH基因)的65.96%,在对照MRC-5细胞中无明显表达。该质粒转化A549细胞的裂解液具有促进人PBMC增殖活性、上清液无明显促PBMC增殖作用,裂解液组、上清液组和PHA阳性对照组的刺激指数分别为1.29、0.95和1.58。结论成功构建pGL-S-SEA质粒,其在A549细胞的表达产物具有诱导人PBMC增殖的超抗原活性,为下一步将其作为基因疫苗治疗肺癌奠定了基础。

关键词：葡萄球菌肠毒素A 肺癌基因治疗

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熊果酸抑制胶质瘤裸鼠移植瘤生长及其机制的初步探讨

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第三军医大学学报 2009年第11期31卷 1041-1044页

作者：刘琼叶秀峰张徽重庆医科大学神经科学研究中心重庆400016 重庆医科大学基础医学院病理学教研室重庆400016

目的观察熊果酸对恶性胶质瘤裸鼠移植瘤细胞外信号调节激酶ERK1及核内因子C-Jun、C-Myc、Cyclin D1表达的影响,探讨熊果酸抗胶质瘤生长的机制。方法皮下注射技术复制恶性胶质瘤细胞株C6裸鼠皮下移植瘤模型,然后将其分为3组:①空白对照组... 详细信息

目的观察熊果酸对恶性胶质瘤裸鼠移植瘤细胞外信号调节激酶ERK1及核内因子C-Jun、C-Myc、Cyclin D1表达的影响,探讨熊果酸抗胶质瘤生长的机制。方法皮下注射技术复制恶性胶质瘤细胞株C6裸鼠皮下移植瘤模型,然后将其分为3组:①空白对照组,②熊果酸组(50 ***-1.d-1,共20 d),③PD98059组(2 ***-1.d-1,共7 d),观察处理后动物生存、移植瘤生长状况及移植瘤组织病理学形态变化;用免疫组化技术检测移植瘤组织ERK1、C-Jun、C-Myc、Cyclin D1蛋白表达变化;用原位杂交技术观察ERK1 mRNA变化。结果熊果酸组和PD98059组移植瘤生长缓慢,其肿瘤体积及质量明显低于对照组(P<0.05)。熊果酸组和PD98059组ERK1、C-Jun、C-Myc、Cyclin D1蛋白及ERK1 mRNA表达明显低于对照组(P<0.05)。结论熊果酸具有抑制恶性胶质瘤裸鼠移植瘤生长的作用,其机制可能与下调ERK1、C-Jun、C-Myc、Cyclin D1表达有关。

关键词：熊果酸移植瘤 ERK1 C—Jun C—Myc Cyclin D1 ERK1 mRNA

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布洛芬对肝癌细胞HepG2增殖及wnt/β-catenin信号通路的影响

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生物技术通报 2009年第2期25卷 132-137页

作者：马骏飞赵迎泽李青岭吴明军冯涛分子医学与肿瘤研究中心重庆医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室重庆400016

研究非甾类抗炎药布洛芬对肝癌细胞增殖和β-catenin信号通路的影响,探讨布洛芬影响肝癌细胞增殖的可能机制。体外培养HepG2细胞,MTT法检测不同浓度布洛芬分别作用24、48和96h后细胞增殖情况;应用RT-PCR检测布洛芬处理HepG248h后β-cate... 详细信息

研究非甾类抗炎药布洛芬对肝癌细胞增殖和β-catenin信号通路的影响,探讨布洛芬影响肝癌细胞增殖的可能机制。体外培养HepG2细胞,MTT法检测不同浓度布洛芬分别作用24、48和96h后细胞增殖情况;应用RT-PCR检测布洛芬处理HepG248h后β-catenin、cyclinD1和c-myc转录水平的变化;western blotting检测布洛芬对HepG2中β-catenin1蛋白表达量的影响;免疫细胞化学法观察布洛芬处理组HepG2细胞β-catenin的亚细胞定位。结果表明0.7mmol/L的布洛芬处理细胞48h后能明显见到细胞增殖受到抑制,抑制率达到53.8%,且抑制作用有时间、剂量依赖性;经布洛芬处理后细胞的β-catenin、cyclinD1和c-myc转录也受到显著抑制;布洛芬处理组细胞β-catenin蛋白表达低于对照组;布洛芬处理后β-catenin在胞核中定位减少,胞浆定位增多。因此,布洛芬能抑制肝癌细胞的增殖,且随着处理时间和药物浓度的增加,其抑制作用逐渐增强,其抑制作用可能与调控β-catenin信号通路,影响β-catenin的表达和定位,调节下游相关靶基因的转录有关。

关键词：布洛芬肝癌细胞 HepG2 细胞增殖 β-catenin

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miRNA-451表达质粒的构建及其对iNOS基因表达的抑制

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重庆医科大学学报 2009年第12期34卷 1617-1621页

作者：李春蕾何晓燕彭琼乐张政武卫华彭惠民重庆医科大学基础医学院细胞生物学及遗传学教研室重庆400016 重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学实验教学管理中心重庆400016

目的:探讨miRNA-451对肾小球系膜细胞中诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)基因表达的影响。方法:依据miRBase数据库中mmu-miR-451序列,设计两条寡核苷酸片段,退火处理后克隆至pGenesil-1质粒,构建pGenesil-1-miRNA-451质粒及阴性对照质粒pGenesil-1-control。将pGenesil-1-miRNA-451及pGenesil-1-control质粒分别转染小鼠肾小球系膜细胞,经G418筛选,建立稳定表达pGenesil-1-miRNA-451及pGenesil-1-control的细胞株。采用MTT比色法检测活细胞数并绘制生长曲线;RT-PCR、Western blot及免疫细胞化学检测iNOS基因表达的差异。结果:经测序证实重组质粒构建成功,与未处理的小鼠肾小球系膜细胞和稳定表达pGenesil-1-control的细胞相比,在稳定表达pGenesil-1-miRNA-451的小鼠肾小球系膜细胞中,细胞增殖受到抑制,iNOS基因的蛋白表达明显受到抑制,而iNOS基因的mRNA水平无明显变化。结论:miRNA-451在翻译水平抑制了iNOS基因的表达,并对小鼠肾小球系膜细胞生长具有显著的抑制作用。

关键词： miRNA-45 1 iNOS基因肾小球系膜细胞基因表达

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CYP3A22稳定表达HepG_2细胞株的建立及其探针药物代谢活性鉴定

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第三军医大学学报 2009年第16期31卷 1552-1555页

作者：薛正楷魏泓商海涛杨根庆叶彬重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 第三军医大学基础医学部实验动物学教研室重庆400038 河南省新乡医学院第三附属医学院检验科河南新乡543003

目的建立稳定表达Bama小型猪细胞色素CYP3A22的HepG2细胞株。方法通过从Bama小型猪肝组织中提取tRNA、经RT-PCR得到Bama小型猪CYP3A22的基因,并将此基因克隆至亚克隆载体pMD18-T上得到重组质粒pMD-3A22;以测序确定的重组质粒pMD-3A22为... 详细信息

目的建立稳定表达Bama小型猪细胞色素CYP3A22的HepG2细胞株。方法通过从Bama小型猪肝组织中提取tRNA、经RT-PCR得到Bama小型猪CYP3A22的基因,并将此基因克隆至亚克隆载体pMD18-T上得到重组质粒pMD-3A22;以测序确定的重组质粒pMD-3A22为模板,采用PCR扩增CYP3A22基因并在其3′添加组氨酸标签,扩增产物经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切,将带有组氨酸标签的CYP3A22基因定向克隆至pcDNA3.1(+)中,测序表明,CYP3A22基因真核表达载体正确构建;将测序正确的CYP3A22基因通过脂质体转染至HepG2细胞,G418筛选10代,RT-PCR及Western blot分析,并用探针药物硝苯地平对重组细胞进行进行活性鉴定。结果与HepG2相比,HepG2-CYP3A22细胞株具有极显著的硝苯地平氧化活性。结论成功建立了稳定表达CYP3A22的HepG2细胞株,可用于相关的药物代谢研究。

关键词： Bama小型猪 Sus scrofa CYP3A22 HepG2 RT—PCR Western blot 探针药物

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维甲酸核受体RARα真核表达载体的构建、突变纠正及表达

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中国微生态学杂志 2009年第10期21卷 898-901页

作者：候艳陈全王瑜伟重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心基础医学院免疫学教研室重庆400016

目的构建维甲酸核受体RARα真核表达载体,并检测其在人肺腺癌细胞A549中表达。方法从小鼠巨噬细胞RAW264.7中提取总RNA,以RT-PCR法扩增RARαcDNA,克隆至真核表达载体pDsRed1-C1中,测序结果显示RARα第1040位A→G,导致其编码蛋白的氨基... 详细信息

目的构建维甲酸核受体RARα真核表达载体,并检测其在人肺腺癌细胞A549中表达。方法从小鼠巨噬细胞RAW264.7中提取总RNA,以RT-PCR法扩增RARαcDNA,克隆至真核表达载体pDsRed1-C1中,测序结果显示RARα第1040位A→G,导致其编码蛋白的氨基酸发生改变。通过二次PCR将其纠正,重组载体RedC1-RARα转化大肠埃希菌Top10,筛选阳性克隆做酶切及测序鉴定。脂质体瞬时转染A549细胞,在荧光显微镜下观察RARα的表达。RT-PCR法检测RARα的mRNA水平表达。结果通过RT-PCR及二次PCR得到RARαcDNA,构建其真核表达载体,脂质体瞬时转染A549细胞得到了成功表达,RARα基因产物定位于细胞核内。结论成功构建维甲酸核受体RARα真核表达载体,且证实RARα编码蛋白定位于细胞核内,本研究结果为进一步探讨结核分枝杆菌固有免疫机制奠定了基础。

关键词：维甲酸核受体细胞内病原体抗性基因1 二次PCR 突变纠正转染

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HBX基因重组腺病毒载体的构建

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重庆医科大学学报 2004年第3期29卷 273-275,278页

作者：冯涛何通川宋文鑫重庆医科大学基础医学院生物化学教研室重庆400016 芝加哥大学医学中心分子肿瘤研究室美国60637

目的 :构建携HBX基因的腺病毒载体 ,为进一步研究HBX基因的功能 ,为阐明HBV感染导致肝癌的机制研究建立基础。方法 :采用PCR技术从HBV全基因组DNA中扩增HBX基因 ;将HBX基因亚克隆至质粒 pHAHA ,构建质粒 pHAHA-HBX ,酶切pHAHA -HBX质粒 ... 详细信息

目的 :构建携HBX基因的腺病毒载体 ,为进一步研究HBX基因的功能 ,为阐明HBV感染导致肝癌的机制研究建立基础。方法 :采用PCR技术从HBV全基因组DNA中扩增HBX基因 ;将HBX基因亚克隆至质粒 pHAHA ,构建质粒 pHAHA-HBX ,酶切pHAHA -HBX质粒 ,将HAHA -HBX片段克隆到腺病毒载体 pAd -Track -CMV中 ,得到 pAdTrack -CMV -HBX ,同时与 pAdEasy - 1共转染 2 93细胞 ,确定转染效率。检测培养上清病毒中HBX的存在。结果 :将PCR扩增HBX片段成功克隆到腺病毒载体中 ,并经序列分析证实 ;建立了产病毒细胞株 ,证实重组病毒中含有HBX基因。结论

关键词：基因 HHX HBV 腺病毒载体乙型肝炎

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Wnt/β-连环蛋白信号途径活性的分析系统的建立

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重庆医科大学学报 2004年第4期29卷 413-416页

作者：冯涛周兰何通川重庆医科大学基础医学院生物化学教研室重庆医科大学生物医学工程系重庆4000163 芝加哥大学医学中心分子肿瘤研究室

目的 :建立Wnt/ β -连环蛋白信号途径功能活性的分析系统。方法 :首先构建一个表达 β -连环蛋白 -绿色荧光蛋白的融合蛋白的载体 ,pCMV -bcGFP ;再用之转染HEK2 93细胞 ,用G4 18和LiCl筛选出稳定表达该融合蛋白的细胞 ,克隆建株并鉴... 详细信息

目的 :建立Wnt/ β -连环蛋白信号途径功能活性的分析系统。方法 :首先构建一个表达 β -连环蛋白 -绿色荧光蛋白的融合蛋白的载体 ,pCMV -bcGFP ;再用之转染HEK2 93细胞 ,用G4 18和LiCl筛选出稳定表达该融合蛋白的细胞 ,克隆建株并鉴定。结果 :成功获得稳定表达该融合蛋白的细胞株 ,即 2 93-bc -GFP细胞株 ;在荧光显微镜下以及蛋白质印迹分析证实 :所获得的 2 93-bc -GFP细胞株表达该融合蛋白的基础水平极低 ;用Wnt1和LiCl处理后可以明显地使该融合蛋白在细胞内的水平升高。结论 :上述结果提示该分析系统是以Wnt依赖的方式、受 β -连环蛋白调节的。该分析系统可以用作一个功能报告系统 ,以鉴定肿瘤发生中导致 β-连环蛋白信号途径失调的潜在的上游因子 ,也同样可以用于筛选那些特异抑制人类肿瘤中

关键词： Wnt/β-连环蛋白信号途径 β-连环蛋白-绿色荧光蛋白功能分析系统

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从病毒细胞遗传进化的生物循环选育到新基因识别与验证

从病毒细胞遗传进化的生物循环选育到新基因识别与验证

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2003年中国科协“生物信息学与进化计算”青年科学家论坛

作者：张德礼李衍达黄高升方福德季梁朱关福北京大学医学部公共卫生学院营养与食品卫生学系，北京大学人类疾病基因研究中心，北京，100083 清华大学信息科学与技术国家实验室生物信息学研究部，清华大学生物信息学研究所生物信息学教育部重点实验室，清清华大学信息科学与技术国家实验室生物信息学研究部，清华大学生物信息学研究所生物信息学教育部重点实验室，清华大学信息科学技术学院自动化系智能技术与系统国家重点实验室，北京，100084 第四军医大学基础部病理学教研室，西京医院病理科，中国癌症研究基金会肿瘤研究所，西安，710032 中国医学科学院基础医学研究所，中国协和医科大学基础医学院医学分子生物学国家重点实验室，北京，710032

初步建立了病毒细胞遗传进化的优劣环境交替性生物循环选育作用的理论与技术体系并得到实际应用。发现细小病毒超高增殖的交替选育规律又在不同实验体系基因与染色体水平分别得到验证，从而发现了病毒细胞遗传进化的优劣环境交替性生物... 详细信息

初步建立了病毒细胞遗传进化的优劣环境交替性生物循环选育作用的理论与技术体系并得到实际应用。发现细小病毒超高增殖的交替选育规律又在不同实验体系基因与染色体水平分别得到验证，从而发现了病毒细胞遗传进化的优劣环境交替性生物循环的选育规律，提出了相关选育机制与方法，初步建立了这种选育作用的理论与技术体系并得到实际应用，它正是联系高效水貂细小病毒疫苗研制、痘苗病毒重组质粒转染技术创新、细胞系致癌毒理学安全性评价、异类肿瘤在体实验转化现象确立与横纹肌样瘤起源之谜初步揭示的纽带与桥梁，具有广泛的科学指导和实用意义。实际应用：(1)安全高效的水貂肠炎病毒细胞培养灭活疫苗的首次研制成功和长期广泛应用;(2)在对痘苗病毒重组质粒转染技术的探索性研究中首次简化了基因转染技术;(3)恶性横纹肌样瘤(MRT)在模型动物体内的首次发现和成功复制，为阐明其起源之谜提供了机会。从染色体遗传变异角度初步阐明了MRT的发生、发展规律，从比较医学角度揭示了MRT的组织细胞起源;(4)解了传代细胞(CCL)致癌毒理实验的难题，揭示了遗传变异率与致癌(瘤)的关系。在基因识别新方法与功能基因分离方面取得重要进展。建立了从计算机软件分析、人工干预分析及与实验生物学相结合角度来发现人类新基因的方法，并证明它是加速基因克隆和鉴定的一条有效途径。电子克隆百余人类新基因(还用合作开发的软件计算机识别800个人类新基因候选对象)，部分基因编码序列已被实验证实和引用，其中几个新克隆基因已在动物实验中显示出明显的生物学功能活性。发现了美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因组注释项目公布的人类基因模式参考序列(REFSEQ)存在各种类型的多种/处错误，这一结果提示应慎重使用NCBI的REFSEQ数据库。

关键词：病毒细胞生物循环基因识别遗传进化

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