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瞬时受体电位香草酸亚型1激活通过抑制线粒体通透性转换孔开放保护急性心肌梗死小鼠的心肌细胞抗凋亡

中国生物化学与分子生物学报 2017年第5期33卷 514-520页

作者：周波刘启辰张羿雷寒杨雅莹黄玮重庆医科大学附属第一医院心血管内科重庆400016 重庆医科大学基础医学院病理教研室分子医学诊断中心重庆400016

瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)在心肌缺血激活后可传导心绞痛信号,释放神经肽,减轻心肌梗死后的心肌细胞凋亡。目前,TRPV1激活抑制心肌梗死后细胞凋亡的具体机制尚不清楚。线粒体通透性转换孔(MPTP)的开放与心肌细胞缺血再灌注损伤密... 详细信息

瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)在心肌缺血激活后可传导心绞痛信号,释放神经肽,减轻心肌梗死后的心肌细胞凋亡。目前,TRPV1激活抑制心肌梗死后细胞凋亡的具体机制尚不清楚。线粒体通透性转换孔(MPTP)的开放与心肌细胞缺血再灌注损伤密切相关,抑制其开放可保护心肌缺血后的心肌细胞抗凋亡。本研究证明,TRPV1激活通过抑制MPTP开放而减少心肌细胞凋亡。首先,本研究利用左冠状动脉前降支结扎术建立了TRPV1基因敲除(TRPV1-/-)和野生型(WT)小鼠心肌梗死模型,辅以环孢素A(CSA)预处理抑制MPTP开放,比较观察TRPV1、MPTP在心肌梗死中的作用。心肌组织切片氯化三苯基四氮唑(TTC)染色显示,心肌缺血24 h,TRPV1-/-小鼠的心肌梗死面积明显大于WT型小鼠。而经CSA预处理的TRPV1-/-小鼠比TRPV1-/-小鼠梗死面积明显减小。TUNEL检测心肌细胞凋亡指数(AI)揭示,WT型心肌梗死小鼠的AI明显低于TRPV1-/-心肌梗死小鼠,而CSA预处理明显降低TRPV1-/-小鼠心肌细胞的AI。Western印迹检测胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶9、Bcl-2、Bax、p53和细胞色素C(Cyt-C)水平。结果证明,TRPV1的激活可抑制MPTP的开放,减少线粒体Cyt-C的外溢,降低胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3的表达。GENMEN光度法检测MPTP开放实验显示,激活的TRPV1明显抑制了MPTP的开放。本研究证实,急性心肌梗死后的TRPV1激活可能通过抑制MPTP开放而抵抗心肌细胞凋亡,对心肌起保护作用。

关键词：瞬时受体电位香草酸亚型1 线粒体通透性转换孔心肌梗死凋亡

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U0126通过下调p-ERK1/2和GM130的表达对人胃癌细胞MKN-45的影响

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基因组学与应用生物学 2017年第9期36卷 3492-3497页

作者：张婉玉彭豆豆易永芬重庆医科大学基础医学院病理学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

探讨ERK1/2通路抑制剂U0126对人胃癌MKN-45细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力的影响及机制。首先用CCK-8法测定U0126对MKN-45细胞增殖的影响并筛选药物作用的最适浓度和时间用于后续实验,并将实验分为药物处理组,阴性对照组和空白对照组... 详细信息

探讨ERK1/2通路抑制剂U0126对人胃癌MKN-45细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力的影响及机制。首先用CCK-8法测定U0126对MKN-45细胞增殖的影响并筛选药物作用的最适浓度和时间用于后续实验,并将实验分为药物处理组,阴性对照组和空白对照组。然后通过流式细胞术、Transwell迁移实验和Matrigel侵袭实验分别检测细胞凋亡、迁移和侵袭能力,RT-q PCR检测各组GM130的m RNA水平的变化,Western blotting检测ERK1/2、p-ERK1/2、MMP-9、MMP-2、GM-130的蛋白水平的变化。实验发现10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L浓度的U0126均能抑制MKN-45细胞的增殖,其中20μmol/L浓度作用48 h效果最强(p<0.05),且该药物作用条件下MKN-45细胞凋亡增加,迁移和侵袭作用减弱(p<0.05)。Western blotting结果显示,药物处理组ERK1/2蛋白水平不变,而p-ERK1/2、MMP-9、MMP-2、GM-130的蛋白水平均明显低于阴性对照组和空白对照组(p<0.05)。RT-q PCR结果显示,药物处理组GM130的m RNA水平明显低于阴性对照组和空白对照组(p<0.05)。以上研究结果均表明U0126可促进MKN-45细胞凋亡,降低细胞体外增殖、迁移和侵袭的能力,其机制可能与p-ERK1/2和GM130的表达被抑制有关。

关键词： U0126 GM130 胃肿瘤增殖侵袭

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GRASP65的表达对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

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重庆医科大学学报 2017年第12期42卷 1614-1619页

作者：易永芬张婉玉彭豆豆罗祎重庆医科大学基础医学院病理学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学附属第一医院妇产科重庆400016

目的:探讨高尔基体堆叠蛋白65(Golgi reassembly stacking protein 65,GRASP65)在体外对人胃癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响。方法:首先,通过Western blot和RT-qRCR鉴别低分化胃癌细胞MKN-45、中分化胃癌细胞SGC-7901、高分化... 详细信息

目的:探讨高尔基体堆叠蛋白65(Golgi reassembly stacking protein 65,GRASP65)在体外对人胃癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响。方法:首先,通过Western blot和RT-qRCR鉴别低分化胃癌细胞MKN-45、中分化胃癌细胞SGC-7901、高分化胃癌细胞MKN-28和正常胃黏膜细胞GES-1中GRASP65蛋白和mRNA的表达量。然后,用si RNA干扰技术通过Lipofectamine 2000瞬时转染下调和MKN-45细胞中GRASP65的表达量。用qRT-PCR和Western blot检测转染后各组细胞中GRASP65的蛋白和mRNA表达量以证实转染成功。最后,用CCK-8、流式细胞术、Transwell迁移和侵袭实验检测转染后的各组胃癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的改变。结果:Western blot和qRT-RCR结果显示MKN-45细胞和SGC-7901细胞中GRASP65的蛋白和mRNA表达量明显高于MKN-28细胞和GES-1细胞中GRASP65蛋白和mRNA表达量(P<0.05),故选择低分化胃癌细胞MKN-45作为实验细胞株来下调GRASP65的表达量。qRT-PCR和Western blot结果证明转染成功,转染组GRASP65的mRNA和蛋白表达量与阴性对照组和空白对照组对比有统计学意义(P<0.05)。CCK-8、流式细胞术、Transwell迁移和侵袭实验均证明,下调MKN-45细胞的GRASP65的表达量可抑制胃癌细胞MKN-45体外增殖、迁移和侵袭能力,并促进细胞凋亡。结论:下调GRASP65的表达可明显减弱胃癌细胞的体外增殖能力,同时促进胃癌细胞的凋亡、体外侵袭和迁移。

关键词： GRASP65 siRNA 增殖凋亡迁移侵袭

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敲低高尔基体α甘露糖苷酶2(GM2)增强BGC-823人胃癌细胞的黏附及机制

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细胞与分子免疫学杂志 2017年第6期33卷 789-794页

作者：曾波曾珍刘畅杨雅莹重庆医科大学附属永川医院消化内科重庆永川402160 重庆医科大学基础医学院病理教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆医科大学分子医学检测中心重庆渝中400016

目的通过敲低高尔基体α甘露糖苷酶2(GM2)基因的表达,探讨其对BGC-823人胃癌细胞黏附能力的影响。方法设计并构建3个针对GM2基因的短发卡RNA(shRNA)质粒表达载体,同时合成阴性对照载体,并将其转染至BGC-823细胞,实时定量PCR和Western b... 详细信息

目的通过敲低高尔基体α甘露糖苷酶2(GM2)基因的表达,探讨其对BGC-823人胃癌细胞黏附能力的影响。方法设计并构建3个针对GM2基因的短发卡RNA(shRNA)质粒表达载体,同时合成阴性对照载体,并将其转染至BGC-823细胞,实时定量PCR和Western blot法检测转染后BGC-823细胞GM2 mRNA及蛋白表达水平,筛选出敲低效果最佳的质粒;再分别运用同质细胞黏附试验、细胞-基质黏附实验、内皮细胞黏附实验观察GM2基因敲低后对BGC-823细胞黏附能力的影响;同时采用Western blot法检测GM2基因敲低后上皮钙黏素(E-cadherin)、CD44v6、细胞间黏附分子1(ICAM-1)及P选择素(P-selectin)等黏附分子的蛋白水平。结果与空白对照组及转染GM2-shRNA-NC组相比较,GM2-shRNA-2质粒可有效敲低GM2基因的表达;敲低GM2表达水平后,BGC-823细胞同质细胞之间黏附数目明显增加,而与基质和血管内皮细胞之间的黏附数目明显减少。敲低GM2基因表达后E-cadherin蛋白表达明显增加,P-selectin蛋白表达明显降低,而CD44v6和ICAM-1表达水平未见明显变化。结论敲低GM2基因表达水平后,胃癌BGC-823细胞间的黏附能力增强,而与细胞外基质和血管内皮细胞之间的黏附能力减弱,可能与敲低GM2后E-cadherin表达上调,而P-selectin的表达下调有关。

关键词：胃肿瘤 α甘露糖苷酶(GM) 小干扰RNA(siRNA) 黏附 BGC-823细胞

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敲低小胶质细胞中过氧还原素6(PRDX6)降低氧糖剥夺再复氧神经元的存活

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细胞与分子免疫学杂志 2016年第8期32卷 1014-1020页

作者：谭丽赵涌姜蓓蓓杨波张徽重庆医科大学基础医学院病理学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的观察敲低小胶质细胞中过氧还原素6(PRDX6)对氧糖剥夺再复氧(OGD/R)神经元存活的影响。方法小胶质细胞采用PRDX6-siRNA慢病毒感染,同时培养基中加入非Ca2+依赖性磷脂酶A2(i PLA2)活性抑制剂MJ33,24 h后与原代神经元共培养,并进行OGD/... 详细信息

目的观察敲低小胶质细胞中过氧还原素6(PRDX6)对氧糖剥夺再复氧(OGD/R)神经元存活的影响。方法小胶质细胞采用PRDX6-siRNA慢病毒感染,同时培养基中加入非Ca2+依赖性磷脂酶A2(i PLA2)活性抑制剂MJ33,24 h后与原代神经元共培养,并进行OGD/R处理。实验分为正常组、OGD/R组、阴性对照siRNA处理的OGD/R组、PRDX6-siRNA处理的OGD/R组、PRDX6-siRNA联合MJ33处理的OGD/R组。Western blot法检测小胶质细胞PRDX6蛋白的表达,实时定量PCR检测小胶质细胞PRDX6 mRNA的表达。ELISA检测i PLA2活性;MTS、乳酸脱氢酶(LDH)法检测神经元的存活率;采用比色法检测超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量以反映神经元的氧化应激水平。结果与OGD/R组比较,PRDX6-siRNA处理的神经元存活率降低,MDA增加、SOD降低、氧化应激损伤加重;与PRDX6-siRNA组比较,同时加入i PLA2活性抑制剂MJ33组神经元存活率增加,MDA降低、SOD增加、氧化应激水平下降。结论小胶质细胞PRDX6对神经元氧糖剥夺损伤有保护作用,而i PLA2活性对PRDX6的作用有影响。

关键词：氧糖剥夺小胶质细胞神经元共培养过氧还原素6(PRDX6) 小干涉RNA(siRNA) MJ33

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软骨同源蛋白1(CART1)敲低诱导MDA-MB-231乳腺癌细胞S期阻滞并抑制其侵袭和迁移

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细胞与分子免疫学杂志 2016年第4期32卷 474-478页

作者：管停宏苏琳茜易永芬重庆医科大学基础医学院病理学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的运用外源性RNA干扰技术,敲低MDA-MB-231乳腺癌细胞中软骨同源蛋白1(CART1)基因的表达,研究CART1基因沉默后对MDA-MB-231细胞生物学行为的影响。方法采用人工合成的针对CART1基因的siRNA,用转染试剂RNAi MAX将CART1-siRNA转染MDA-MB-... 详细信息

目的运用外源性RNA干扰技术,敲低MDA-MB-231乳腺癌细胞中软骨同源蛋白1(CART1)基因的表达,研究CART1基因沉默后对MDA-MB-231细胞生物学行为的影响。方法采用人工合成的针对CART1基因的siRNA,用转染试剂RNAi MAX将CART1-siRNA转染MDA-MB-231细胞。实时定量PCR检测转染后CART1 mRNA水平,Western blot法检测转染后CART1蛋白水平,TranswellTM侵袭实验检测MDA-MB-231细胞侵袭、CCK-8法检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞周期的变化。结果 CART1-siRNA能有效沉默CART1在MDA-MB-231细胞中的表达,CART1沉默后MDA-MB-231细胞侵袭和增殖能力明显下降,S期细胞的比率增高而G2/M细胞比率减少。结论下调MDA-MB-231细胞CART1的表达,可降低其侵袭和增殖能力、诱导S期阻滞。

关键词：乳腺癌 CART1 RNA干扰侵袭增殖周期

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人子宫颈癌肿瘤相关巨噬细胞浸润与T细胞亚型及临床病理特征的相关性分析

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基因组学与应用生物学 2016年第12期35卷 3235-3240页

作者：沈依帆徐曼王欣汪涛刘慧重庆医科大学基础医学院病理教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

为了探讨肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAMs)在人子宫颈癌微环境内的分布与T细胞亚型和临床病理特征的相关性,本研究应用S-P免疫组化法检测TAMs在60例子宫颈癌组织、10例高级别鳞状上皮内病变组织及10例子宫颈组织的... 详细信息

为了探讨肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAMs)在人子宫颈癌微环境内的分布与T细胞亚型和临床病理特征的相关性,本研究应用S-P免疫组化法检测TAMs在60例子宫颈癌组织、10例高级别鳞状上皮内病变组织及10例子宫颈组织的分布情况;间接免疫荧光双标法分析浸润的FOXP3^+Treg细胞数量、CD8^+T细胞数量及其粒酶B分泌情况。统计学分析TAMs数量与癌间质浸润的FOXP3^+Treg、CD8^+T数量和临床病理特征的相关性。结果显示TAMs在子宫颈癌微环境的数量均显著多于高级别鳞状上皮内病变和子宫颈组织(p<0.01,p<0.01),同时高级别鳞状上皮内病变组织阳性细胞数也明显多于子宫颈组织(p<0.01);TAMs数量与宫颈癌间质内浸润的FOXP3^+T细胞数量呈正相关性(p<0.05),且与淋巴结转移和癌栓相关(p<0.05,p<0.05),但与CD8^+T细胞浸润数量无明显相关性(p>0.05)。本实验发现TAMs在宫颈癌微环境内大量分布,且与肿瘤局部免疫抑制及淋巴结转移和癌栓有关。

关键词：肿瘤相关巨噬细胞宫颈癌 FOXP3^+Tregs CD8^+T 淋巴结转移

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GM130对胃癌细胞O-糖基化及细胞粘附能力的影响

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重庆医科大学学报 2016年第6期41卷 563-568页

作者：苏琳茜冯阳阳管停宏张婉玉易永芬重庆医科大学基础医学院病理学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的:初步探讨沉默高尔基体基质蛋白130(golgi matrix protein 130,GM130)基因对胃癌细胞MKN-45 O-糖基化及细胞粘附能力的影响。方法:通过si RNA干扰胃癌细胞中GM130的表达水平,用Lipofectamine 2000将GM130-si RNA转染入MKN-45细胞。... 详细信息

目的:初步探讨沉默高尔基体基质蛋白130(golgi matrix protein 130,GM130)基因对胃癌细胞MKN-45 O-糖基化及细胞粘附能力的影响。方法:通过si RNA干扰胃癌细胞中GM130的表达水平,用Lipofectamine 2000将GM130-si RNA转染入MKN-45细胞。实验分为GM130-si RNA组、阴性对照组和空白对照组。分别用q RT-PCR和Western blot检测转染后各组中GM130、N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(polypeptide N-acetylgalactosaminyl transferase 2,pp Gal NAc-T2)、核心1β3半乳糖基转移酶(core 1 synthase,glycoprotein-N-acetylgalactosamine 3-β-galactosyltransferase1,C1Gal-T1)、β-半乳糖α-2,3-唾液酸转移酶1(beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase,ST3Gal-1)m RNA和蛋白表达的变化。应用凝集素流式细胞术检测3组细胞中α2,3唾液酸残基糖链结构的表达水平。肿瘤细胞与内皮细胞粘附实验及基质胶粘附实验检测细胞粘附能力。结果:q RT-PCR和Western blot结果显示GM130基因与蛋白水平明显受到抑制,表明转染成功;GM130-Si RNA组C1Gal-T1、ST3Gal-1的m RNA和蛋白表达水平均明显降低(P均<0.05),pp Gal NAc-T2在3组中无明显变化(P>0.05),α2,3唾液酸糖链结构的表达量降低(P<0.05),细胞粘附能力下降(P<0.05)。结论:在MKN-45细胞中,下调GM130后,可能通过下调C1Gal-T1、ST3Gal-1的表达影响胃癌细胞O-糖基化,降低肿瘤细胞粘附能力。

关键词：沉默高尔基体基质蛋白130 RNA干扰胃癌糖基化粘附

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下调MDA-MB-231乳腺癌细胞骨硬化蛋白(SOST)可增加间接共培养的MG-63成骨细胞的成骨作用

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细胞与分子免疫学杂志 2016年第11期32卷 1481-1485页

作者：程俊雄郭丹陈茜王婷黄佳祎重庆医科大学基础医学院病理生理学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学第二附属医院乳腺外科重庆400016

目的构建靶向抑制骨硬化蛋白(SOST)基因的小干扰RNA(siRNA)腺病毒,感染MDA-MB-231乳腺癌细胞并与MG-63成骨细胞共培养,检测对成骨相关分子表达的影响。方法针对SOST基因RNA序列设计带3个干扰片段的2对引物,以p B2B为模板,扩增"背靠... 详细信息

目的构建靶向抑制骨硬化蛋白(SOST)基因的小干扰RNA(siRNA)腺病毒,感染MDA-MB-231乳腺癌细胞并与MG-63成骨细胞共培养,检测对成骨相关分子表达的影响。方法针对SOST基因RNA序列设计带3个干扰片段的2对引物,以p B2B为模板,扩增"背靠背"排列的H1和U6启动子。两个PCR产物以Gibson DNA Assembly的方式同时连接腺病毒穿梭质粒p Ad Trace-OK,经同源重组、HEK293细胞包装获得SOST-siRNA腺病毒。感染MDA-MB-231乳腺癌细胞,实时定量PCR检测SOST mRNA的表达水平,ELISA检测SOST蛋白水平。将转染该腺病毒的MDA-MB-231细胞与MG-63成骨细胞间接共培养,实时定量PCR检测护骨因子(OPG)、骨钙蛋白(OCN)、整合素结合涎蛋白(IBSP)、核因子κB受体激活蛋白配体(RANKL)的表达情况。结果成功获得带3个干扰片段的腺病毒穿梭质粒,经同源重组和包装后,获得AdR-si SOST腺病毒。用该病毒感染MDA-MB-231细胞后,明显抑制SOST的表达。在乳腺癌骨转移体外模型中感染Ad-si SOST腺病毒,能导致MG-63细胞的OPG、OCN、IBSP mRNA表达上升,RANKL mRNA降低。结论在乳腺癌骨转移体外模型中感染Ad-si SOST腺病毒,能促进MG-63细胞的成骨分化,提高OPG/RANKL的比例。

关键词： SOST siRNA 腺病毒乳腺癌骨转移

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乳腺癌异常表达B7-H4对T细胞分泌细胞因子和凋亡的影响

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中国免疫学杂志 2016年第6期32卷 867-870,874页

作者：沈依帆黄文炼徐曼苏新良王欣汪涛重庆医科大学基础医学院病理教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学附属第一医院内分泌乳腺外科重庆400016

目的:探讨B7-H4在乳腺癌中的表达及其对外周血T细胞分泌细胞因子及增殖、凋亡的影响。方法:应用SP免疫组化法检测B7-H4在乳腺浸润性癌、癌旁组织和纤维腺瘤的表达。流式细胞术分析B7-H4对乳腺癌患者外周血活化T细胞增殖和凋亡的作用。EL... 详细信息

目的:探讨B7-H4在乳腺癌中的表达及其对外周血T细胞分泌细胞因子及增殖、凋亡的影响。方法:应用SP免疫组化法检测B7-H4在乳腺浸润性癌、癌旁组织和纤维腺瘤的表达。流式细胞术分析B7-H4对乳腺癌患者外周血活化T细胞增殖和凋亡的作用。ELISA芯片检测T细胞培养上清液细胞因子的含量。结果:B7-H4在乳腺浸润性癌的阳性表达率为84.62%(44/52),显著高于癌旁组织和纤维腺瘤组织(P<0.01,P<0.01)。体外淋巴细胞混合培养结果显示,与空白组比较,B7-H4对乳腺癌患者外周血活化T细胞的增殖指数Ki67无明显影响;但B7-H4诱导CD8^+T细胞凋亡的作用强于CD4^+T细胞。B7-H4组FOXP3^+T/CD4^+T也高于空白组(P<0.05)。B7-H4组较空白组细胞培养上清液中TGF-β1、IL-17含量均显著增高(P<0.05,P<0.05)。结论:乳腺浸润性癌异常表达B7-H4。B7-H4在体外能促进CD8^+T细胞凋亡、促进T细胞分泌TGF-β1和IL-17。B7-H4在削弱乳腺癌微环境的抗肿瘤细胞免疫中发挥一定作用。

关键词： B7-H4 乳腺癌 CD8^+T细胞细胞凋亡 TGF-β1 IL-17

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