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Study of Transcription Activity of X-Box Binding Protein 1 Gene in Human Different Cell Lines

Journal of Genetics and Genomics 2007年第9期34卷 790-799页

作者：郭风劲宋方洲张静李婧唐勇重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室重庆400016 重庆医科大学生物化学及分子生物学教研室重庆400016 重庆医科大学基础医学研究所重庆400016

Human X-box binding protein 1 （XBP1）, an important transcription factor, participates in many signal transduction processes. To further investigate the biological function of XBP1, sequences of XBP1 promoter and its two deletion mutants were first determined using bioinformatic analysis. The report vectors containing XBP1 promoter and its deletion mutants were then constructed, namely, p1-XBPlp, p2-XBPlp, and p3-XBPlp. Each reporter vector was separately transfected into HepG2, L02, K562, SMMC-7721, HSF, and Lipocyte lto Cell line using FuGENE 6 transfection reagents. The activity of chloramphenicol acetyltransferase （CAT） in each group of transfected cells was detected by ELISA assay, which in turn reflects the transcription activity of the XBP1 gene promoter. The activity involving p3-XBPlp was the highest in HepG2, which was 12.4-fold of that of pCAT3-Basic. The activities of p3-XBPlp in K562 and SMMC-7721 were the second and the third highest, which were 10.9-fold and 10.0-fold of that of the pCAT3-Basic, respectively. The CAT activity in L02 was lower than that in the above-mentioned abnormal cell, and no reporter activity was detected in HSF and Ito Cell. The XBP1 transcription and expression in K562, HepG2 and SMMC-7721 were found to be higher than that in L02, HSF and Ito cells, based on the results of real-time RT-PCR and Western blot. The XBP1 transcription and expression in L02, HSF was lower, whereas that in Ito cells was totally lacking. The result was similar to that of CAT-ELISA. Therefore, the XBP1 gene promoter can drive its downstream gene expression and its activity is cell line-dependent. The core sequence of XBP1 promoter was found between -227bp and 66bp sequence. This sequence was closely associated with the transcriptional activity of XBP1 promoter.

关键词： transcription factor XBP1 promoter CAT ELISA transcription regulation

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过表达人RI抑制人膀胱癌T24细胞的侵袭、转移及EMT发生

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第三军医大学学报 2012年第23期34卷 2378-2383页

作者：姚雪熊冬梅舒静李林陈俊霞重庆医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的检测过表达人核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)基因的质粒pIRES2-EGFP-RI对人膀胱癌T24细胞侵袭转移及上皮细胞间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)现象的影响。方法将连有RI的质粒pIRES2-EGFP-RI稳定转染T24细胞后利用G418筛选出阳性克隆。根据转染的质粒不同分为3组:T24组(未转染组)、T24-0(转染pIRES2-EGFP质粒)和T24-RI组(转染pIRES2-EGFP-RI质粒)。RT-PCR检测T24细胞中RI的mRNA水平变化,细胞免疫荧光及Western blot检测RI蛋白的表达,利用HE染色观察其细胞形态的变化,Transwell方法检测细胞侵袭及转移能力的变化,Western blot检测侵袭转移及EMT相关蛋白Twist、MMP-9和Snail及E-cadherin的表达,构建移植瘤模型,利用HE染色观测肺组织切片癌细胞转移情况,组织免疫化学方法检测移植瘤中RI、Twist、Snail及E-cadherin的表达。结果 T24-RI组人RI的mRNA水平及蛋白表达显著升高(P<0.05);HE染色结果表明细胞铺展良好,核质比明显减小,细胞由间质形态向上皮形态转变;Transwell方法显示T24-RI组细胞的侵袭及转移能力较T24组、T24-0组明显下降;Western blot结果表明T24-RI组Twist、MMP-9和Snail较T24组、T24-0组显著降低(P<0.01),E-cadherin较T24组、T24-0组显著升高(P<0.01);HE染色肺组织切片显示T24-RI组较其他两组癌细胞转移降低,组织免疫化学结果表明T24-RI组RI、E-cadherin蛋白明显升高,而Twist、Snail显著降低。结论过表达人RI载体提高了RI蛋白的表达水平,并抑制了人膀胱癌T24细胞EMT的发生,从而抑制了膀胱癌T24细胞的侵袭、转移。

关键词：人核糖核酸酶抑制因子 T24细胞细胞转移细胞侵袭 EMT

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下调血管生成素对人膀胱癌T24细胞增殖、凋亡的影响

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第三军医大学学报 2014年第14期36卷 1460-1466页

作者：舒静田文琳李林刘玉林陈俊霞重庆医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室、分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的构建人血管生成素（angiogenin,ANG）基因siRNA干扰质粒,检测其对膀胱癌T24细胞增殖、凋亡的影响。方法将针对人ANG基因siRNA表达质粒和无同源性的对照质粒稳定转染T24细胞后经G418筛选出阳性克隆。根据转染质粒不同分为3组：T24组... 详细信息

目的构建人血管生成素（angiogenin,ANG）基因siRNA干扰质粒,检测其对膀胱癌T24细胞增殖、凋亡的影响。方法将针对人ANG基因siRNA表达质粒和无同源性的对照质粒稳定转染T24细胞后经G418筛选出阳性克隆。根据转染质粒不同分为3组：T24组（未转染组）、T24-NC组（转染阴性对照质粒组）、T24-siANG组（转染干扰质粒组）。通过RT-PCR检测T24细胞中ANG的mRNA表达水平,Western blot检测ANG蛋白的表达;MTT法检测细胞增殖活力;流式细胞术、TUNEL及Hochest 33342检测细胞凋亡;Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3的表达;构建BALB/c裸鼠[4-6周龄,体质量（20±3）g]移植瘤模型,组织HE染色和免疫荧光CD31检测微血管变化;组织免疫化学方法检测移植瘤中ANG、Bax、Caspase-3、Bcl-2的表达。结果酶切和测序结果证明重组质粒构建成功;T24-siANG组ANG的mRNA水平及蛋白表达水平显著降低（P〈0.05）;T24-siANG组细胞增殖活力明显下降（P〈0.05）;流式细胞仪检测结果显示：与T24-NC组和T24细胞组相比,T24-siANG组细胞的凋亡率明显升高（P〈0.01）;TUNEL检测结果显示：T24-siANG组出现大量凋亡细胞;Hochest检测结果显示：T24-siANG组出现典型的凋亡形态特征如染色质凝集、核碎裂和明亮的蓝色荧光等;Western blot结果显示,在T24-siANG组中,Bcl-2的表达明显降低（P〈0.01）,而Bax和激活的Caspase-3的表达明显升高（P〈0.05）;组织HE染色和组织免疫荧光显示：T24-siANG组肿瘤微血管生成较T24与T24-NC组明显减少（P〈0.01）;组织免疫化学结果也表明：T24-siANG组ANG、Bcl-2蛋白显著降低,而Bax、活化的Caspase-3蛋白明显升高。结论成功构建的干扰质粒通过降低ANG的表达、抑制膀胱癌T24细胞的增殖、调节凋亡关键蛋白的表达,从而促进膀胱癌T24细胞的凋亡。

关键词：血管生成素膀胱癌增殖凋亡

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上调核糖核酸酶抑制因子对小鼠黑色素瘤B16细胞生长和凋亡的影响

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第三军医大学学报 2015年第13期37卷 1331-1337页

作者：潘湘阳彭源陈俊霞重庆医科大学基础医学院:细胞生物学与遗传学教研室重庆400016 重庆医科大学基础医学院第一临床学院重庆400016

目的研究核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)基因表达对小鼠黑色素瘤B16细胞生长和凋亡的影响。方法构建RI真核表达质粒p IRES2-EGFP-RI稳定转染B16细胞,未转染和空质粒作对照组(p IRES2-EGFP组),经G418筛选出阳性克隆。RT-... 详细信息

目的研究核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)基因表达对小鼠黑色素瘤B16细胞生长和凋亡的影响。方法构建RI真核表达质粒p IRES2-EGFP-RI稳定转染B16细胞,未转染和空质粒作对照组(p IRES2-EGFP组),经G418筛选出阳性克隆。RT-PCR、免疫印迹和免疫荧光检测RI的表达;MTT检测细胞的增殖;流式细胞术、TUNEL及Hochest33342检测细胞周期及凋亡;Western blot检测凋亡相关的蛋白及ILK/PI3K/AKT信号通路关键分子的表达;分别注射各组B16细胞到C57/BL小鼠建立移植瘤模型,观察肿瘤的生长及肿瘤微血管的变化,进一步分析ILK/PI3K/AKT信号通路蛋白在肿瘤组织中的表达。结果转染RI细胞组的RI mRNA和蛋白表达水平显著升高;MTT结果显示B16-RI细胞较对照组增殖能力明显降低,流式细胞结果显示B16-RI细胞的S期明显增加,表明RI表达上调后细胞生长停滞于S期(P<0.05);Hochest 33342、TUNEL及Annexin V和PI双染色流式法细胞凋亡检测结果证实,B16-RI细胞与对照组相比出现大量凋亡细胞(P<0.01)及典型凋亡形态特征:染色质凝集,核碎裂和明亮的蓝色荧光等;Western blot结果显示,与对照组相比,B16-RI细胞中ILK、p-Akt、p-GSK3β、Bcl-2及β-catenin的表达明显降低,而活化的Caspase-3和Bax蛋白的表达显著增加(P<0.01);动物的移植瘤实验结果显示,转RI组的小鼠的瘤重显著降低(P<0.01),瘤组织中的血管密度明显减少,同时ILK、p-Akt、p-GSK3β、β-catenin在瘤组织中表达减少。TUNEL肿瘤组织凋亡检测结果与体外细胞一致。结论过表达RI可能通过调节ILK/PI3K/AKT信号通路显著抑制了小鼠黑色素瘤B16细胞的生长并诱导了B16细胞的凋亡。

关键词：核糖核酸酶抑制因子 B16细胞增殖凋亡 ILK/PI3K/AKT信号通路

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核糖核酸酶抑制因子过表达抑制B16细胞的侵袭和转移

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第三军医大学学报 2012年第4期34卷 284-289页

作者：潘湘阳李红彦姚雪熊冬梅陈俊霞重庆医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的构建人核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)真核表达载体,检测其对B16细胞侵袭和转移能力的影响。方法提取人7703细胞中的总RNA,RT-PCR特异性扩增RI编码区序列,利用基因重组技术将其克隆到载体pIRES2-EGFP中,稳定转染B1... 详细信息

目的构建人核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)真核表达载体,检测其对B16细胞侵袭和转移能力的影响。方法提取人7703细胞中的总RNA,RT-PCR特异性扩增RI编码区序列,利用基因重组技术将其克隆到载体pIRES2-EGFP中,稳定转染B16细胞以后,经G418筛选出阳性克隆。根据转染质粒不同分别命名为B16细胞组(未转染组)、空质粒对照组(pIRES2-EGFP组)和实验组(pIRES2-EGFP-RI组)。RT-PCR检测B16细胞中RI mRNA水平的表达,并通过Western blot和细胞免疫化学检测RI蛋白水平的表达;HE染色观察细胞形态的改变,黏附实验、划痕实验和Transwell法检测细胞黏附、迁移和侵袭能力的变化;Western blot检测MMP-2、MMP-9和nm23-H1以及E-cadherin的表达;建立C57BL/6小鼠肺转移模型,观察肺上肿瘤转移灶的变化。结果酶切和测序结果证明重组质粒构建成功,实验组细胞RI的mRNA和蛋白的表达较B16细胞组和空质粒对照组显著升高(P<0.05);HE染色结果显示,细胞铺展良好,核质比减小;转染pIRES2-EGFP-RI质粒的实验组细胞的黏附、迁移及侵袭能力明显降低(P<0.05);与两对照组相比,实验组细胞MMP-2和MMP-9的表达水平明显降低,nm23-H1和E-cadherin的表达水平明显升高(P<0.05);动物实验结果显示与对照组相比,实验组的肺转移灶明显减少。结论成功构建的RI真核表达质粒能升高RI基因及蛋白水平的表达,显著抑制了B16细胞的转移和侵袭能力。

关键词：核糖核酸酶抑制因子 B16黑色素瘤细胞细胞黏附细胞运动肿瘤转移肿瘤侵润

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核糖核酸酶抑制因子与血管生成素的相互作用

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第三军医大学学报 2014年第14期36卷 1454-1459页

作者：李林舒静刘玉林陈俊霞重庆医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室、分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的探讨核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)与血管生成素(angiogenin,ANG)的相互作用。方法利用免疫荧光标记结合共聚焦显微镜技术来确立RI与ANG蛋白在细胞内的共定位。利用激光共聚焦显微镜的荧光共振能量转移(fluorescen... 详细信息

目的探讨核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)与血管生成素(angiogenin,ANG)的相互作用。方法利用免疫荧光标记结合共聚焦显微镜技术来确立RI与ANG蛋白在细胞内的共定位。利用激光共聚焦显微镜的荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术验证RI和ANG蛋白的相互作用。构建原核表达质粒pGEX-4T-RI,转化*** BL21大肠杆菌(DE3)表达,并经谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(glutathione sepharose4B)纯化GST-RI蛋白,考马斯亮蓝染色和免疫印迹鉴定表达情况,利用GST蛋白沉降技术检测RI与ANG蛋白在体外的结合作用。应用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)实验检测两蛋白在真核细胞内的结合作用。结果细胞内免疫荧光标记的RI和ANG蛋白在激光共聚焦显微镜观察下存在共定位现象。FRET结果显示RI与ANG在细胞内存在相互作用。另外酶切和测序结果证明原核表达质粒pGEX-4T-RI构建成功,GST-RI蛋白诱导表达正确,GST蛋白沉降结果显示RI和ANG蛋白在原核细胞反应体系中存在相互作用。结论 RI和ANG蛋白在原核细胞反应体系和真核细胞中均存在相互结合作用。

关键词：核糖核酸酶抑制因子血管生成素相互作用

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miR-449a通过Trim11影响高糖培养的肾小球系膜细胞增殖

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第三军医大学学报 2019年第16期41卷 1520-1526页

作者：陈雯韵孙艳彭睿彭惠民张政重庆医科大学基础医学院:细胞生物学及遗传学教研室重庆400016 重庆医科大学基础医学院:分子肿瘤研究中心重庆400016

目的探讨在高糖培养的系膜细胞中miR-449a与Trim11结合对细胞增殖的调控作用。方法 RT-qPCR检测miR-449a在高糖(25 mmol/L)和低糖(5.5 mmol/L)培养的系膜细胞中的表达;EdU检测miR-449a及Trim11对系膜细胞增殖的影响;生物信息学预测miR-4... 详细信息

目的探讨在高糖培养的系膜细胞中miR-449a与Trim11结合对细胞增殖的调控作用。方法 RT-qPCR检测miR-449a在高糖(25 mmol/L)和低糖(5.5 mmol/L)培养的系膜细胞中的表达;EdU检测miR-449a及Trim11对系膜细胞增殖的影响;生物信息学预测miR-449a与Trim11的结合位点;双荧光素酶验证miR-449a与Trim11靶向作用;Western blot检测上调、下调miR-449a后Trim11蛋白的变化。结果与低糖组比较,miR-449a在高糖培养的系膜细胞中的表达显著降低(P<0.01);双荧光素酶证实miR-449a直接靶向Trim11,过表达miR-449a后,细胞增殖减少,Trim11蛋白水平显著降低(P<0.01);沉默miR-449a,细胞增殖增加,Trim11蛋白水平显著上调(P<0.01);沉默Trim11后,抑制miR-449a对于细胞增殖促进作用被阻止。结论 miR-449a可抑制系膜细胞增殖,其机制可能与抑制靶基因Trim11的表达有关,可能是糖尿病肾病的重要保护性因子。

关键词：肾小球系膜细胞 miR-449a Trim11 细胞增殖

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荧光二氧化硅纳米颗粒的制备、修饰及细胞成像分析

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化学学报 2011年第8期69卷 967-972页

作者：孙艳华扎拉嘎胡张金利关丛笑郑琳李韡乔建军天津大学化工学院天津300072 天津医科大学基础医学院天津300070 天津武警医学院细胞生物学与医学遗传学教研室天津300162

在微乳液体系中合成荧光二氧化硅纳米颗粒(FSNPs),然后对其表面进行氨基修饰,之后再连接抗体,应用高分辨透射电镜(HR-TEM),原子力显微镜(AFM),Zeta-电位分析仪,IR,荧光显微镜及激光共聚焦显微镜等多种表征工具对合成的颗粒和后续的修饰... 详细信息

在微乳液体系中合成荧光二氧化硅纳米颗粒(FSNPs),然后对其表面进行氨基修饰,之后再连接抗体,应用高分辨透射电镜(HR-TEM),原子力显微镜(AFM),Zeta-电位分析仪,IR,荧光显微镜及激光共聚焦显微镜等多种表征工具对合成的颗粒和后续的修饰进行了系统分析.研究表明,FSNPs在溶液中呈现单分散状态,但是在表面修饰了氨基之后(NH2-FSNPs),由于表面平均电位以及氨基间氢键的形成,致使颗粒严重聚集;适当的pH环境可以改善颗粒的分散状态;利用氨基修饰的荧光二氧化硅纳米颗粒(NH2-FSNPs)连接抗体识别脐血来源的间充质干细胞(MSCs)表面的蛋白CD44,从而实现对间充质干细胞荧光成像分析.结果表明,识别效果良好,为荧光二氧化硅纳米颗粒在干细胞领域的应用奠定了基础.

关键词：荧光二氧化硅纳米颗粒氨基修饰分散性 CD44

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稳定表达HBx的肝前体细胞株的构建及其对增殖的影响

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细胞与分子免疫学杂志 2013年第3期29卷 256-260页

作者：芦永良申利红李红丽胡代曦张锡峰胡斌冯涛黄佳祎重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学细胞生物学遗传学教研室重庆400016 重庆医科大学基础医学院病理生理学教研室重庆400016

目的构建稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的肝前体细胞株,检测对肝前体细胞增殖,细胞周期及Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法重组质粒pSEB-Flag-HBx与包装质粒pAmpho共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,包装获得携带HBx基因的重组... 详细信息

目的构建稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的肝前体细胞株,检测对肝前体细胞增殖,细胞周期及Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法重组质粒pSEB-Flag-HBx与包装质粒pAmpho共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,包装获得携带HBx基因的重组逆转录病毒,并感染小鼠肝前体细胞HP14.5,稻瘟菌素(blasticidin)筛选出稳定表达HBx基因的细胞克隆并扩大培养(HP14.5/HBx组),设HP14.5/Rv(空质粒pSEEB-Flag感染组)及空细胞组HP14.5组为对照组。MTS比色法检测各组细胞的增殖活力,流式细胞术检测细胞周期中各时相所占的比例,荧光定量PCR检测cyclin D1和c-myc mRNA的表达量,Western blot法检测HBx、GSK3β、p-GSK3β(ser-9)、β-catenin、cyclin D1以及c-myc等蛋白的表达。结果 RT-PCR和Westernblot法检测到HBx基因和蛋白阳性表达,与对照组相比,HP14.5/HBx细胞增殖活力显著增加(P<0.05);G1细胞比例明显减少(P<0.05),S期和G2细胞比例显著升高(P<0.05);cyclin D1和c-myc mRNA的表达量显著升高(P<0.05);GSK3β蛋白水平表达无明显变化(P>0.05),p-GSK3β、β-catenin、cyclin D1和c-myc蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)。结论成功筛选出稳定表达HBx的肝前体细胞株,HBx通过活化Wnt/β-catenin信号途径促进肝前体细胞的增殖。

关键词：乙型肝炎病毒X蛋白肝前体细胞细胞增殖 wnt β-catenin信号途径

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L-精氨酸对人肝细胞中内源凝血因子Ⅷ表达的激活作用

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中国生物制品学杂志 2012年第10期25卷 1303-1306页

作者：朱重阳李鑫温泉张军重庆医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室重庆400016 重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的探讨L-精氨酸对人肝细胞LO2中内源凝血因子Ⅷ(Coagulation factorⅧ,FⅧ)表达的激活作用。方法将LO2细胞分为试验组和对照组,试验组加入L-精氨酸(终浓度为10 mmol/L)分别培养24、36、48和60 h,对照组用等体积的灭菌水取代L-精氨酸... 详细信息

目的探讨L-精氨酸对人肝细胞LO2中内源凝血因子Ⅷ(Coagulation factorⅧ,FⅧ)表达的激活作用。方法将LO2细胞分为试验组和对照组,试验组加入L-精氨酸(终浓度为10 mmol/L)分别培养24、36、48和60 h,对照组用等体积的灭菌水取代L-精氨酸培养。采用RT-PCR法检测LO2细胞中人FⅧ基因mRNA的转录水平并测序鉴定,一期法检测细胞培养上清液中人FⅧ的促凝活性(FⅧ∶C),Western blot检测24、48 h时相点LO2细胞中人FⅧ蛋白的表达,免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜观察L-精氨酸作用48 h后LO2细胞中人FⅧ的表达。结果加入L-精氨酸培养36、48、60 h后,LO2细胞中有人FⅧ基因mRNA的转录,而对照组未出现人FⅧ基因mRNA的转录;各时相点两组细胞培养上清液中人FⅧ∶C的水平差异均无统计学意义(P>0.05);Western blot及激光共聚焦均观察到加L-精氨酸培养48 h后LO2细胞中出现人FⅧ的表达,而对照组细胞中均无人FⅧ的表达。结论 L-精氨酸可激活人正常肝细胞中内源FⅧ的表达。

关键词： L-精氨酸肝细胞凝血因子Ⅷ 转录表达

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