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乙型肝炎病毒x蛋白基因荧光真核表达质粒的构建及其对人正常肝细胞株L0_2增殖的影响

中国生物制品学杂志 2012年第2期25卷 157-160页

作者：钱冠华董君军段昌柱彭惠民重庆医科大学细胞生物学与遗传学教研室重庆400016 重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学基础医学实验教学中心重庆400016

目的构建乙型肝炎病毒x蛋白基因荧光真核表达质粒,并检测HBx对人正常肝细胞株L02细胞增殖的影响。方法以pcDNA3-HBV质粒为模板,PCR法扩增HBx基因编码区全长序列,将其克隆至pIRES2-EGFP荧光真核表达载体中,构建重组真核表达质粒pIRES2-EG... 详细信息

目的构建乙型肝炎病毒x蛋白基因荧光真核表达质粒,并检测HBx对人正常肝细胞株L02细胞增殖的影响。方法以pcDNA3-HBV质粒为模板,PCR法扩增HBx基因编码区全长序列,将其克隆至pIRES2-EGFP荧光真核表达载体中,构建重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-HBx,转染L02细胞,筛选稳定表达HBx的细胞,RT-PCR法检测细胞中HBx基因mRNA的转录水平;Western blot法检测细胞中HBx蛋白的表达水平;MTT法检测细胞的增殖活力。结果重组荧光真核表达质粒pIRES2-EGFP-HBx经双酶切和测序证明构建正确,转染该质粒的L02细胞可检测到HBx基因mRNA的转录及蛋白的表达,与空质粒pIRES2-EGFP转染的L02细胞相比,增殖活力明显提高。结论成功构建了HBx基因荧光真核表达质粒,并获得了能稳定表达HBx蛋白的L02细胞株,为进一步研究HBx对细胞周期调控通路的影响及探索HBx导致的与HBV相关的HCC的分子机制奠定了基础。

关键词：肝炎病毒乙型 x蛋白绿色荧光蛋白质类真核细胞基因表达 LO2细胞细胞增殖

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应用于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法

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第三军医大学学报 2006年第7期28卷 734-735页

作者：胡晓红刘昕黄正根彭惠民袁科程英高云重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室重庆400016 第三军医大学基础医学部分子遗传学教研室重庆400038

目的建立特异灵敏的适应于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法。方法于细菌样本离心所得沉淀中加入提取液(25%Chelex-100,0·5%NP40,TE配制,pH=9·0);56℃孵育30min;100℃水浴10min;离心后所得上清即为DNA。电泳、PCR及Real... 详细信息

目的建立特异灵敏的适应于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法。方法于细菌样本离心所得沉淀中加入提取液(25%Chelex-100,0·5%NP40,TE配制,pH=9·0);56℃孵育30min;100℃水浴10min;离心后所得上清即为DNA。电泳、PCR及Real-time PCR扩增评价该方法的特异性及灵敏度。结果本方法所提细菌DNA电泳条带清晰,未见假阳性,D(260)/D(280)=(1·79±0·03);PCR及Real-time PCR扩增未见假阳性及假阴性,灵敏度达101/ml细菌浓度。结论本研究细菌DNA提取方法特异灵敏,适应于PCR及Real-time PCR。

关键词： PCR 实时荧光定量PCR DNA提取

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乳腺癌前病变组织原代成纤维细胞生物学特征初步研究

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第三军医大学学报 2012年第1期34卷 16-19页

作者：孙艳彭琼乐王黎阳赵浏阳袁泉李俊柳满然重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室 400016 基础医学院细胞生物学及遗传学教研室重庆400016

目的比较乳腺导管不典型增生成纤维细胞(atypical intraductal hyperplasia fibroblasts,AFs)与正常乳腺成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)、乳腺癌肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)在生物学特征上的差异。方法采用Ⅰ型胶原酶法分离并培养AFs、NFs和CAFs,免疫细胞荧光化学检测其粘连蛋白(fibronectin,FN)表达以鉴定细胞纯度。比较3种细胞的细胞生长曲线、细胞周期和周期蛋白cyclin D1、p21waf1及p53的变化。结果获得并鉴定了NFs、AFs、CAFs;其生长速度依次增加(P<0.05),细胞周期S期百分比(8.24±2.47)、(16.94±4.77)、(33.31±7.90)依次增大(P<0.05);与NFs相比,AFs周期蛋白cyclin D1表达增加(P<0.05),p21waf1和p53蛋白表达降低(P<0.05);与CAFs相比,AFs的周期蛋白cyclin D1没有升高(P<0.05),p21waf1蛋白和p53蛋白表达更强(P<0.05)。结论 AFs相对于NFs和CAFs,细胞生长增殖具有特异性,这种变化提示乳腺肿瘤的癌前病变阶段AFs可能是NFs逐步向CAFs转变的过渡阶段。

关键词：乳腺癌微环境成纤维细胞细胞周期

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斑马鱼红系造血缺陷突变体的正向遗传学筛选

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南方医科大学学报 2010年第5期30卷 931-935页

作者：霍中军温宗华刘靖王鹍黄志斌戴朝霞马宁颜广陈英华陈小辉刘伟马品芸罗伟豪赵颖樊淑赵嘉佳黄红辉温子龙张文清南方医科大学基础医学院细胞生物学教研室广东广州510515 南方医科大学基础医学院病理学教研室广东广州510515 南方医科大学基础医学院病组织胚胎学教研室广东广州510515 南方医科大学基础医学院医学遗传学教研室广东广州510515 香港科技大学生化系香港

目的化学遗传学方法大规模筛选并初步鉴定所获得具有不同红系造血缺陷表型的斑马鱼突变体。方法乙基亚硝基脲(ENU)诱导雄性斑马鱼突变(founder),将其与野生型AB雌性斑马鱼交配产生F1代,源自不同来源的founder的F1代杂交产生F2家族。在F... 详细信息

目的化学遗传学方法大规模筛选并初步鉴定所获得具有不同红系造血缺陷表型的斑马鱼突变体。方法乙基亚硝基脲(ENU)诱导雄性斑马鱼突变(founder),将其与野生型AB雌性斑马鱼交配产生F1代,源自不同来源的founder的F1代杂交产生F2家族。在F2代同家族内自交所产生的F3代胚胎中,用以βe1为探针,实施整体原位杂交实验,进行红系造血缺陷突变体筛选,并针对所筛选到的突变体在不同造血过程缺陷表型进行分类研究。结果和结论筛选得到4个βe1基因表达缺失突变体,其中2个为红系特异性造血缺陷突变体,另外2个突变体同时存在红系和淋系造血缺陷。

关键词：斑马鱼红系造血正向遗传学筛选 βe1-globin

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斑马鱼髓系造血细胞缺陷突变体的大规模遗传筛选

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南方医科大学学报 2010年第6期30卷 1230-1233页

作者：戴朝霞颜广陈英华刘伟霍中军温宗华刘靖王鹍黄志斌马宁陈小辉马品芸罗伟豪赵颖樊淑黄红辉温子龙张文清南方医科大学基础医学院细胞生物学教研室广东广州510515 南方医科大学基础医学院组织胚胎学教研室广东广州510515 南方医科大学基础医学院病理学教研室广东广州510515 南方医科大学基础医学院医学遗传学教研室广东广州510515 香港科技大学生化系

目的通过大规模化学遗传学方法筛选斑马鱼髓系造血缺陷突变体。方法利用化学诱变剂乙基亚硝基脲(ENU)将雄鱼精原母细胞诱变,通过与AB野生型雌性斑马鱼交配产生F1代,源自不同founder(F0)的F1代同胞之间交配产生F2家族,F3代来F2家族同胞... 详细信息

目的通过大规模化学遗传学方法筛选斑马鱼髓系造血缺陷突变体。方法利用化学诱变剂乙基亚硝基脲(ENU)将雄鱼精原母细胞诱变,通过与AB野生型雌性斑马鱼交配产生F1代,源自不同founder(F0)的F1代同胞之间交配产生F2家族,F3代来F2家族同胞内交配,并分别以中性红和苏丹黑B染色筛选巨噬细胞和粒细胞缺陷突变体。结果我们筛选了350个F2家族,共1424对鱼。初步筛选到6个斑马鱼髓系造血系统的突变体,其中3个突变体为中性红染色异常,另3个突变体为苏丹黑染色异常,表明以上突变体可能存在巨噬细胞或粒细胞的发育障碍。结论 ENU化学诱变和中性红及苏丹黑B染色筛选斑马鱼髓系造血缺陷突变体是简单、价廉、有效的化学遗传学方法。通过保留突变体对后代进行进一步的研究分析,有望鉴定和克隆影响斑马鱼髓系造血新的基因或已知基因的新的调控途径。

关键词：斑马鱼髓系造血正向遗传学筛选苏丹黑中性红

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JNK在小鼠毛囊周期中的动态表达

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第三军医大学学报 2012年第22期34卷 2274-2277页

作者：王瑞敏星懿展郭海英何龙杨恬连小华查何彭惠民重庆医科大学基础医学院细胞生物学及遗传学教研室重庆400016 第三军医大学基础医学部细胞生物学教研室重庆400038 重庆大学生物工程学院重庆400030

目的研究JNK在生后小鼠背皮毛囊周期中的表达规律及探讨其对毛囊周期的调控作用。方法选择生后不同时期(1、7、14、16、21、31 d)C57BL/6J小鼠54只,采用RT-PCR技术,检测JNK mRNA在小鼠背皮毛囊周期中的表达情况;采用Western blot和免疫... 详细信息

目的研究JNK在生后小鼠背皮毛囊周期中的表达规律及探讨其对毛囊周期的调控作用。方法选择生后不同时期(1、7、14、16、21、31 d)C57BL/6J小鼠54只,采用RT-PCR技术,检测JNK mRNA在小鼠背皮毛囊周期中的表达情况;采用Western blot和免疫组化技术,进一步检测JNK蛋白在毛囊周期中的表达规律。结果 RT-PCR检测结果表明,在毛囊周期中,JNK1在生长早期(生后7、31 d)表达最强,退化期(生后16 d)和静止期(生后21 d)维持较弱的表达;JNK2在各时相点均有中等强度表达。单因素方差分析显示,JNK1的表达水平在生长早期(0.99±0.02)与静止期(0.30±0.01)间存在显著差异(P<0.05),JNK2在生长早期(0.77±0.01)与退化期(0.97±0.03)间存在显著差异(P<0.05)。Western blot与RT-PCR检测结果一致。免疫组化结果显示,在毛囊生长期,JNK主要表达于毛母质和外根鞘;进入退化期,JNK表达于外根鞘和上皮索;静止期毛囊中无表达。结论 JNK在毛囊周期中呈动态表达模式,生长期JNK可能通过影响毛母质细胞的增殖和/或分化来调节毛囊生长;退化期JNK可能涉及毛囊细胞的凋亡过程。

关键词： JNK 毛囊毛囊周期小鼠表达

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上调RI对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞EMT及转移的影响

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基础医学与临床 2016年第2期36卷 199-206页

作者：周宇箭潘湘阳陈俊霞重庆医科大学基础医学实验教学中心重庆400016 重庆医科大学细胞生物学与遗传学教研室重庆400016

目的研究核糖核酸酶抑制因子基因表达对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞EMT及转移的影响。方法构建RI真核表达质粒p IRES2-EGFP-RI,稳定转染B16-F10细胞。RT-PCR、Western blot和免疫荧光检测RI的表达;HE染色及相差显微镜观察细胞形态;FITC标... 详细信息

目的研究核糖核酸酶抑制因子基因表达对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞EMT及转移的影响。方法构建RI真核表达质粒p IRES2-EGFP-RI,稳定转染B16-F10细胞。RT-PCR、Western blot和免疫荧光检测RI的表达;HE染色及相差显微镜观察细胞形态;FITC标记的鬼笔环肽染色,激光共聚焦观察细胞骨架;黏附实验、划痕实验和Transwell法检测细胞黏附、迁移和侵袭能力的变化;Western blot检测EMT及转移相关蛋白的表达;分别将各组B16-F10细胞眼眶静脉注射到c57/BL小鼠,建立肺转移动物模型,注射3周后处死小鼠。取肺称重,在解剖镜下计数肺转移结节数;肺组织切片HE染色观察肿瘤细胞转移;免疫组化检测肺转移瘤组织中转移及EMT相关蛋白的表达。结果 RI表达上调后,细胞由间质型向上皮型转换,细胞骨架重排;B16-F10-RI细胞组黏附、迁移和侵袭能力下降;与对照组相比,B16-F10-RI细胞中MMP2、MMP9、snail、slug、vimentin、twist和N-cadherin的表达明显降低,而E-cadherin,nm23-H1蛋白的表达明显增加(P<0.01或P<0.01)。实验组与对照组比小鼠肺的转移结节明显减少,同时EMT及转移相关蛋白在瘤组织中表达与体外细胞一致。结论上调核糖核酸酶抑制因子能够显著抑制B16-F10细胞EMT及侵袭、转移,RI可望作为治疗黑色素瘤的靶蛋白。

关键词：核糖核酸酶抑制因子 EMT B16-F10细胞转移

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c-ski基因重组腺病毒质粒的构建及其对肿瘤相关成纤维细胞增殖的影响

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中国生物制品学杂志 2013年第12期26卷 1738-1742页

作者：王黎阳赵浏阳彭琼乐孙艳柳满然重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室重庆400016 重庆医科大学基础医学院细胞生物学及遗传学教研室重庆400016

目的构建携带c-ski基因的重组腺病毒质粒,并检测其对肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)增殖活力的影响。方法以pcDNA3-c-ski质粒为模板,PCR扩增c-ski基因,与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,构建重组穿梭质粒pAdT... 详细信息

目的构建携带c-ski基因的重组腺病毒质粒,并检测其对肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)增殖活力的影响。方法以pcDNA3-c-ski质粒为模板,PCR扩增c-ski基因,与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,构建重组穿梭质粒pAdTrack-c-ski,经PmeⅠ线性化后,转化感受态大肠埃希菌BJ5183,获得重组腺病毒质粒,经PacⅠ线性化后,转染HEK-293细胞,获得重组腺病毒,经扩增及纯化后测定病毒滴度。将纯化的重组腺病毒感染乳腺癌CAFs,采用Western blot法检测感染细胞中c-Ski蛋白的表达水平;MTT法和细胞计数法检测重组腺病毒对CAFs细胞增殖活力的影响。结果重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切鉴定证明构建正确;转染HEK-293细胞48 h后可见大量绿色荧光蛋白的表达,纯化的重组腺病毒的滴度为3.11×1010IFU/ml;感染重组腺病毒的乳腺癌CAFs中c-Ski蛋白的表达水平明显高于空病毒组和空白对照组(P<0.001),且增殖活力明显高于空白对照组(P<0.05)。结论成功构建了表达c-ski基因的重组腺病毒质粒,其可明显促进CAFs的增殖,为进一步研究c-Ski对CAFs增殖分化等生物学功能的影响及作用机制提供了实验依据。

关键词： c-ski基因腺病毒成纤维细胞细胞增殖

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喉癌颈淋巴结抗肿瘤免疫状态的研究

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中华耳鼻咽喉科杂志 2004年第4期39卷 223-226页

作者：张杰武徐晋赵雪松贾深汕哈尔滨医科大学附属肿瘤医院头颈外科 150040 哈尔滨医科大学基础医学院医学遗传学与细胞生物学教研室

目的　通过对肿瘤引流淋巴结中增生性滤泡反应和树突状细胞 (dendriticcell,DC)浸润密度进行定量分析 ,探讨其在喉癌患者抗肿瘤免疫反应中的作用。方法　重新制备 4 7例行选择性颈淋巴结清扫术的喉癌患者的 15 7枚颈淋巴结石蜡切片 ,用... 详细信息

目的　通过对肿瘤引流淋巴结中增生性滤泡反应和树突状细胞 (dendriticcell,DC)浸润密度进行定量分析 ,探讨其在喉癌患者抗肿瘤免疫反应中的作用。方法　重新制备 4 7例行选择性颈淋巴结清扫术的喉癌患者的 15 7枚颈淋巴结石蜡切片 ,用抗S 10 0、CD4 5RO和CD2 0单克隆抗体免疫组化抗生物素生物素过氧化物酶复合物 (avidin biotinperoxidase,ABC)法显示DC和增生性滤泡的分布并检测其密度。根据增生性滤泡反应的特点进行分型研究。结果　增生型滤泡反应的程度与类型和DC浸润密度有明显的相关性。术后生存 5年以上的患者淋巴结中滤泡计数和DC浸润密度明显多于生存期少于 5年者 (P <0 0 0 1)。无淋巴结转移组患者淋巴结中的滤泡计数和DC浸润密度较有转移组亦有明显增加 (P <0 0 0 1)。具有T细胞增生型滤泡反应的患者比T细胞非增生型患者有较高的 5年生存率 (P <0 0 1)和较低的淋巴结转移率 (P <0 0 5 )。结论　颈淋巴结中增生性滤泡反应和树突状细胞的浸润反映了机体免疫系统的抗肿瘤潜能。树突状细胞的浸润密度和增生性滤泡反应的程度及分型反映了该患者的抗肿瘤免疫状态 ,可以共同作为预后判定的重要指标。

关键词：喉癌颈淋巴结转移免疫学预后树突状细胞增生性滤泡反应

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lncRNA-Gm4419对高糖培养的肾小球系膜细胞增殖和纤维化的影响

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第三军医大学学报 2017年第3期39卷 216-222页

作者：易红彭睿孙艳罗勇军彭惠民李爱玲张政重庆医科大学基础医学院细胞生物学及遗传学教研室重庆400016 重庆医科大学基础医学院生物信息学教研室重庆400016 第三军医大学高原军事医学系军事医学地理学教研室重庆400038 重庆医科大学基础医学院实验教学中心重庆400016

目的探讨长链非编码Gm4419对高糖培养的小鼠肾小球系膜细胞增殖和纤维化的影响。方法荧光定量PCR检测Gm4419在糖尿病肾病肾脏组织及高糖培养的肾小球系膜细胞中的表达水平。设计合成Gm4419 siRNA,同时构建pcDNA3.1(+)-Gm4419过表达质粒... 详细信息

目的探讨长链非编码Gm4419对高糖培养的小鼠肾小球系膜细胞增殖和纤维化的影响。方法荧光定量PCR检测Gm4419在糖尿病肾病肾脏组织及高糖培养的肾小球系膜细胞中的表达水平。设计合成Gm4419 siRNA,同时构建pcDNA3.1(+)-Gm4419过表达质粒,并将Gm4419 siRNA和pcDNA3.1(+)-Gm4419过表达质粒分别转染至高低糖培养的肾小球系膜细胞,Ed U法检测转染后细胞的增殖能力;Western blot检测肾脏纤维标记蛋白的表达水平情况。结果 Gm4419在糖尿病肾病肾脏组织及高糖培养的肾小球系膜细胞中的表达水平较正常组及低糖组显著增高(P<0.01)。荧光定量PCR筛选出一条最佳干扰Gm4419的siRNA,转染高糖组后,与高糖mock组或对照组比较,高糖Gm4419 knockdown组细胞增殖能力减弱、纤维化标记蛋白表达减少(P<0.05)。此外,将酶切和测序结果证实构建成功的pcDNA3.1(+)-Gm4419过表达质粒转染至低糖组细胞,与低糖mock组或对照组相比,低糖Gm4419过表达组细胞增殖能力增强、纤维化标记蛋白表达水平增高(P<0.05)。结论lnc RNA-Gm4419参与糖尿病肾小球系膜增生和纤维化的调节。

关键词：长链非编码RNA Gm4419 肾小球系膜细胞增殖纤维化

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