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人参皂苷Rg1诱导人红白血病K562细胞株衰老与p16-Rb信号通路的相关性

中国生物制品学杂志 2012年第10期25卷 1310-1314页

作者：蔡世忠刘俊周玥刘典锋杨斌姜蓉王亚平重庆医科大学干细胞与组织工程研究室组织学与胚胎学教研室重庆400016

目的探讨人参皂苷Rg1(以下简称Rg1)诱导人红白血病K562细胞株衰老与p16-Rb信号通路的相关性。方法以不同浓度的Rg1(0、5、10、20、40和80μmol/L)作用于K562细胞不同时间(24、48、72 h),MTT法筛选Rg1抑制K562细胞增殖的最佳作用浓度及... 详细信息

目的探讨人参皂苷Rg1(以下简称Rg1)诱导人红白血病K562细胞株衰老与p16-Rb信号通路的相关性。方法以不同浓度的Rg1(0、5、10、20、40和80μmol/L)作用于K562细胞不同时间(24、48、72 h),MTT法筛选Rg1抑制K562细胞增殖的最佳作用浓度及作用时间,以该浓度干预K562细胞不同时间,流式细胞术检测细胞的细胞周期;以最佳浓度Rg1干预K562细胞最佳时间,集落培养法检测细胞集落形成能力;衰老相关-β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测阳性细胞百分率;透射电镜观察细胞的超微结构;Southern blot检测细胞的端粒长度;Western blot检测细胞中P16和RB蛋白的表达。结果 Rg1在体外可明显抑制K562细胞增殖,其最佳作用浓度及作用时间分别为20μmol/L和48 h;经20μmol/L Rg1诱导48 h的K562细胞与常规培养对照组相比,细胞出现G2/M期阻滞(P<0.05),集落形成能力明显减弱(P<0.05),SA-β-Gal染色阳性率增加(P<0.01),细胞体积增大,且溶酶体,线粒体体积增大,数目增多,端粒缩短加速(P<0.05),P16和RB蛋白表达上调(P<0.05)。结论 Rg1能诱导人红白血病K562细胞株衰老,可能与Rg1激活了p16-Rb信号通路有关。

关键词：人参皂苷Rg1 人红白血病 K562细胞株细胞衰老 p16-Rb信号通路

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中医气虚血虚模型与造血干／祖细胞衰老

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激光杂志 2012年第4期33卷 88-89页

作者：刘典锋周王月蔡世忠何轩耿珊张琛孙可王亚平重庆医科大学组织学与胚胎学教研室干细胞与组织工程研究室重庆400016

目的:构建中医"气虚血虚"模型,探讨造血干/祖细胞(HSC/HPC)衰老及检测相关生物学指标,为阐释中医"气虚血虚"的现代生物学机理和探讨"补气生血"药物的作用提供理论与实验依据。方法:6.5Gy的x射线一次性全... 详细信息

目的:构建中医"气虚血虚"模型,探讨造血干/祖细胞(HSC/HPC)衰老及检测相关生物学指标,为阐释中医"气虚血虚"的现代生物学机理和探讨"补气生血"药物的作用提供理论与实验依据。方法:6.5Gy的x射线一次性全身辐射C57小鼠,辐射6h内腹腔注射盐酸苯肼40mg/kg,建立"气虚血虚"模型(即骨髓抑制与贫血模型),分别在第3、7、14、28d观察小鼠的行为学变化、外周血象、骨髓单个核细胞总数、免疫磁性分选法分离鉴定小鼠Sca-1+HSC/HPC、检测骨髓单个核细胞数(MNCs)与造血干/祖细胞(Sca-1+HSC/HPC)数量、衰老SA-β-半乳糖苷酶染色检测Sca-1+HSC/HPC阳性率、Sca-1+HSC/HPC细胞周期分布、脾指数与脾脏病理变化。结果:与对照组相比,在各时间段上模型组小鼠均表现出精神萎靡,行为迟缓,进食量下降等中医"气虚血虚"症候、外周血象各项指标降低,MNCs数下降,Sca-1+HSC/HPC数下降、SA-β-半乳糖苷酶染色阳性百分率(11.82±3.24)%,高于对照组〔(2.07±2.21)%,P<0.05〕、细胞周期G1期阻滞,G0/G1期比例为(86.70±3.79)%,高于对照组〔(69.31±3.07)%,P<0.05〕,S期比例减少、脾指数降低和脾脏退行性变化显著。结论:辐射和盐酸苯肼并用法可成功的建立中医"气虚血虚"动物模型,并导致造血干/祖细胞衰老。

关键词：气虚血虚动物模型造血干/祖细胞衰老

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Tollip体外转染HepG2215细胞对HBsAg和HBeAg分泌的影响及其机制

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中国生物制品学杂志 2012年第12期25卷 1587-1590页

作者：陈维英施又丹唐俐李龙江王亚平余瑜汤为学重庆医科大学干细胞与组织工程研究室重庆400016 重庆医科大学病理生理教研室重庆400016 重庆医科大学药学院重庆400016

目的探讨Tollip转染人肝癌细胞系HepG2215细胞对HBsAg和HBeAg分泌的影响及其机制,为乙型肝炎的治疗寻找新的靶点。方法含HA标签的重组表达质粒pCMV-HA-Tollip经EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定后,采用脂质体LipofectamineTM2000转染HepG2215细... 详细信息

目的探讨Tollip转染人肝癌细胞系HepG2215细胞对HBsAg和HBeAg分泌的影响及其机制,为乙型肝炎的治疗寻找新的靶点。方法含HA标签的重组表达质粒pCMV-HA-Tollip经EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定后,采用脂质体LipofectamineTM2000转染HepG2215细胞,共设4个转染组:脂质体转染对照组(15μl脂质体)、空质粒转染对照组(6μg空质粒、15μl脂质体)、空质粒重组质粒共转染组(3μg空质粒、3μg pCMV-HA-Tollip、15μl脂质体)及重组质粒转染组(6μgpCMV-HA-Tollip、15μl脂质体),转染48 h后,收集细胞,经Western blot检测AKT、p-AKT、NF-κB以及HA标签蛋白的表达;收集上清,ELISA法检测HBsAg和HBeAg的水平。结果重组质粒pCMV-HA-Tollip经双酶切鉴定构建正确。空质粒重组质粒共转染组和重组质粒转染组均有HA标签蛋白的表达,而脂质体转染对照组和空质粒转染对照组无HA标签蛋白表达;与空质粒转染对照组比较,空质粒重组质粒共转染组和重组质粒转染组中NF-κB和p-AKT蛋白的表达明显降低(P<0.01),而AKT蛋白的表达无明显变化(P>0.05);空质粒重组质粒共转染组和重组质粒转染组细胞上清中HBsAg和HBeAg的含量明显低于空质粒转染对照组(P<0.01),对HBsAg的抑制率分别为24%和41%,对HBeAg的抑制率分别为13%和31%。结论 pCMV-HA-Tollip重组质粒在HepG2215细胞中能有效抑制HBsAg和HBeAg的分泌,其机制可能与抑制AKT的磷酸化和下调NF-κB的表达有关。

关键词： Tollip HepG2215细胞转染肝炎表面抗原,乙型肝炎e抗原,乙型

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乳腺癌MDA-MB-231细胞源Exosomes对内皮细胞增殖的影响及MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路的作用

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解放军医学杂志 2012年第11期37卷 1054-1058页

作者：隆霜沈宜谢莹珊范维珂姜蓉陈黎重庆医科大学基础医学院病理生理教研室干细胞与组织工程研究室400016

目的研究人乳腺癌MDA-MB-231细胞源Exosomes对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的促增殖作用,并初步探讨MAPK/ERK和PI3K/Akt信号转导通路在此过程中的作用。方法低温超速离心及密度梯度离心法提取乳腺癌MDA-MB-231细胞源Exosomes。采用MTT法分... 详细信息

目的研究人乳腺癌MDA-MB-231细胞源Exosomes对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的促增殖作用,并初步探讨MAPK/ERK和PI3K/Akt信号转导通路在此过程中的作用。方法低温超速离心及密度梯度离心法提取乳腺癌MDA-MB-231细胞源Exosomes。采用MTT法分别检测50、100、200、400μg/ml Exosomes对HUVECs促增殖作用的影响,流式细胞仪测定200μg/ml Exosomes对HUVECs细胞周期的影响,Western blotting检测200μg/ml Exosomes诱导下HUVECs细胞内细胞外调节蛋白激酶(ERK)和蛋白激酶B(Akt)蛋白的表达水平。结果乳腺癌MDA-MB-231细胞源Exosomes可促进HUVECs细胞增殖,且呈时间和剂量依赖性。200μg/ml Exosomes作用HUVECs细胞24h后,S期细胞比例(27.8%±3.37%)较对照组(15.34%±0.71%)增加(P<0.05),G1/S期细胞比例(2.22%±0.37%)与对照组(4.67%±0.47%)比较下降(P<0.05)。Western blotting结果显示,200μg/ml Exosomes作用HUVECs细胞24、48、72h后,磷酸化ERK表达(0.3378±0.0415,0.4967±0.0511,0.9205±0.0462)与磷酸化Akt蛋白表达(0.4091±0.0361,0.5484±0.0382,0.7496±0.0481)与对照组(磷酸化ERK 0.1836±0.0324,磷酸化Akt 0.2582±0.0215)相比有所增加(P<0.05)。结论乳腺癌MDA-MB-231细胞源Exosomes能促进HUVECs的增殖,其机制可能与细胞周期改变,以及MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路的持续活化有关。

关键词： Exosomes 胞外信号调节激酶蛋白激酶B 增殖乳腺癌

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人参皂苷Rg_1诱导人白血病K562细胞复制性衰老的机制

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解剖学报 2012年第4期43卷 473-478页

作者：李建平蔡世忠刘俊周玥刘典锋王亚平顾恒伟重庆医科大学组织学胚胎学教研室干细胞与组织工程学研究室重庆400016

目的探讨人参皂苷Rg1(Rg1)诱导人白血病K562细胞复制性衰老特征性变化。方法四甲基偶氮唑盐(MTT)法筛选Rg1对K562细胞增殖抑制的最佳浓度及时间,以此浓度和作用时间诱导K562细胞衰老。流式细胞术检测Rg1对细胞增殖周期的影响;衰老相关β... 详细信息

目的探讨人参皂苷Rg1(Rg1)诱导人白血病K562细胞复制性衰老特征性变化。方法四甲基偶氮唑盐(MTT)法筛选Rg1对K562细胞增殖抑制的最佳浓度及时间,以此浓度和作用时间诱导K562细胞衰老。流式细胞术检测Rg1对细胞增殖周期的影响;衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测阳性细胞百分率;Southern blotting检测端粒长度;Western blotting检测复制性衰老信号通路相关P21、P53与Rb蛋白表达;透射电镜观察人白血病K562细胞衰老超微形态学改变。结果 Rg1在体外能明显抑制K562细胞增殖,其最佳作用浓度为20μmol/L,时间为48h;诱导后的K562细胞阻滞于G2/M期;SA-β-Gal染色阳性细胞百分率增加(P<0.05);复制性衰老通路相关蛋白P21、P53和Rb表达上调(P<0.05);端粒长度缩短加速(P<0.05);经诱导细胞呈现胞体增大,溶酶体体积增大、数目增多,线粒体体积增大等衰老形态学变化。结论 Rg1可能经由p53-p21-Rb信号通路诱导K562细胞呈现复制性衰老特征。

关键词：人参皂苷Rg1 白血病 K562细胞株复制性衰老衰老相关β-半乳糖苷酶染色四甲基偶氮唑盐法

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去上皮羊膜及其浸提液体外诱导骨髓间充质干细胞的分化

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中国生物制品学杂志 2012年第9期25卷 1147-1151页

作者：段江洁田静姜蓉汪维伟重庆医科大学基础医学院组织胚胎学教研室干细胞与组织工程研究室重庆400016

目的观察去上皮羊膜及其浸提液体外诱导骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向上皮细胞的分化,并探讨其机制。方法从胎儿四肢长骨分离BMSCs,扩增后采用流式细胞术分析第3代(P3)细胞表面抗原(CD29、CD34、CD71和... 详细信息

目的观察去上皮羊膜及其浸提液体外诱导骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向上皮细胞的分化,并探讨其机制。方法从胎儿四肢长骨分离BMSCs,扩增后采用流式细胞术分析第3代(P3)细胞表面抗原(CD29、CD34、CD71和HLA-DR)的表达,并用4,6-乙酰基-2-苯基吲哚(DAPI)标记第4代BMSCs(P4-BMSCs)。机械法去除正常胎盘羊膜上皮,制成去上皮羊膜,并制备去上皮羊膜浸提液。将DAPI标记的BMSCs接种于羊膜上,设加或不加表皮细胞生长因子(Epidermal growth factor,EGF)、类胰岛素1号生长因子(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)、羊膜浸提液诱导组及细胞爬片对照组,体外诱导培养后,采用免疫荧光组织(细胞)化学染色学法检测各组细胞角蛋白(Cytokeratin,CK)、EGF-R和IGF-1-R的表达,并于诱导后第10天计算CK阳性细胞率。结果原代BMSCs呈典型旋涡状生长,P3细胞表达CD29和CD71,不表达CD34和HLA-DR。羊膜组和细胞爬片组BMSCs在加入EGF或IGF-1诱导后,表达EGF-R和IGF-1-R的时间较未加生长因子的对照组提前2～4 d,表达CK的时间提前2～6 d,单用羊膜组或羊膜浸提液组的表达时间差异无统计学意义(P>0.05);诱导第10天,单用羊膜或羊膜浸提液诱导组的CK阳性细胞表达率明显高于细胞爬片对照组(P<0.05);羊膜与EGF、IGF-1联合诱导组高于单用羊膜组(P<0.05);EGF诱导组高于IGF-1诱导组(P<0.05)。结论羊膜及羊膜浸提液、外源性EGF和IGF-1在体外均可诱导BMSCs向上皮细胞分化,羊膜可能主要通过其所含的细胞因子诱导BMSCs向上皮分化。

关键词：羊膜骨髓间充质干细胞诱导细胞分化

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Maspin在动情周期及早孕小鼠子宫内膜的表达规律

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解剖学杂志 2012年第2期35卷 161-164页

作者：黄燕姜蓉崔文慧杨戎重庆医科大学生殖生理学教研室重庆400016 重庆医科大学干细胞与组织工程学研究室重庆400016

目的：初步探讨Maspin基因在动情周期及早孕小鼠子宫内膜的表达规律。方法：采用实时荧光定量PCR和免疫组织化学分别检测动情前期、动情期、动情后期、动情间期及孕2、4、5、7d小鼠子宫内膜Maspin基因mRNA及蛋白的时空表达规律。结果：... 详细信息

目的：初步探讨Maspin基因在动情周期及早孕小鼠子宫内膜的表达规律。方法：采用实时荧光定量PCR和免疫组织化学分别检测动情前期、动情期、动情后期、动情间期及孕2、4、5、7d小鼠子宫内膜Maspin基因mRNA及蛋白的时空表达规律。结果：动情周期中动情期Maspin mRNA和蛋白表达较强，与其他3期相比差异有统计学意义，其他3期表达较弱，无差异。早孕小鼠子宫内膜组织Maspin基因mRNA和蛋白的表达高于未妊娠小鼠，且随着妊娠天数的增加呈逐渐增强的趋势，到妊娠第5天达到最高。结论：Maspin在动情周期及早孕小鼠子宫内膜呈规律性表达，说明其可能在胚泡着床过程中发挥着重要的作用。

关键词： Maspim子宫内膜动情周期早孕胚泡着床

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骨髓源性神经组织干细胞的分离、培养及鉴定

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中国生物制品学杂志 2012年第4期25卷 506-509页

作者：李琳张兴秀王健姜容郑敏重庆医科大学干细胞与组织工程研究室组织学与胚胎学教研室重庆400016 重庆医科大学附属第二医院神经内科重庆400016

目的分离、培养并鉴定SD大鼠骨髓中神经组织干细胞(Neural tissue committed stem cells,NTCSCs)。方法采用DMEM/F12(1∶1)无血清神经干细胞条件培养液,从大鼠骨髓中分离、培养克隆生长的NTCSCs,采用免疫组化法对骨髓NTCSCs及其分化进... 详细信息

目的分离、培养并鉴定SD大鼠骨髓中神经组织干细胞(Neural tissue committed stem cells,NTCSCs)。方法采用DMEM/F12(1∶1)无血清神经干细胞条件培养液,从大鼠骨髓中分离、培养克隆生长的NTCSCs,采用免疫组化法对骨髓NTCSCs及其分化进行鉴定,RT-PCR法检测骨髓NTCSCs中Nestin、CXCR4、CD31、βⅢ-Tubulin、GFAP基因mRNA的转录。结果分离培养获得悬浮生长的细胞球,该细胞球表达神经干细胞标志Nestin及CXCR4,分化后表达神经元标志βⅢ-Tubulin和神经胶质细胞标志GFAP;该细胞中有Nestin、CXCR4、CD31、βⅢ-Tubulin、GFAP基因mRNA转录。结论在骨髓中成功分离到NTCSCs,其具有神经生物学特征,可作为种子细胞,在临床中枢神经系统疾病的治疗及创伤的修复中具有广阔的应用前景。

关键词：骨髓神经组织干细胞细胞增殖细胞分化

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人参多糖对K562细胞凋亡与细胞周期的影响及其机制

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第三军医大学学报 2012年第12期34卷 1181-1184页

作者：刘艺陈地龙何轩姜蓉王建伟左国伟魏强赵亮李静重庆医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室干细胞与组织工程研究室重庆400016

目的探讨人参多糖(ginseng polysaccharide,GPS)诱导白血病细胞K562凋亡和周期阻滞的机制。方法取对数生长期的K562细胞,调整密度为7×108/L,空白对照组予以常规培养;GPS组加入400 mg/L GPS。流式细胞仪测定细胞的凋亡率及细胞周期... 详细信息

目的探讨人参多糖(ginseng polysaccharide,GPS)诱导白血病细胞K562凋亡和周期阻滞的机制。方法取对数生长期的K562细胞,调整密度为7×108/L,空白对照组予以常规培养;GPS组加入400 mg/L GPS。流式细胞仪测定细胞的凋亡率及细胞周期分布变化;RT-PCR检测细胞ERK表达的变化。免疫组化的方法检测细胞中p-ERK、NF-κB、Cyclin D1蛋白定位及表达量的变化。Western blot检测细胞中ERK、p-ERK、NF-κB、Cyclin D1蛋白的变化。结果与对照组比较,K562细胞在400 mg/L GPS的作用下,体外培养24、48、72 h后,GPS组细胞凋亡率显著增高(P<0.05),周期分布检测结果显示,与对照组相比,GPS组K562细胞G0/G1期细胞数量呈时间依赖性增多(P<0.05),G2+M、S期细胞数量则明显减少(P<0.05)。RT-PCR检测结果显示,400 mg/L GPS处理48 h组ERK mRNA的表达水平明显低于对照组(0.20vs 0.50,P<0.05)。免疫组化显示p-ERK、NF-κB、Cyclin D1主要分布在细胞核和细胞质,与对照组相比,GPS组K562细胞内p-ERK、NF-κB、Cyclin D1的表达明显减弱。Western blot检测结果显示,ERK总蛋白无明显变化(P>0.05),而p-ERK、NF-κB、Cyclin D1随时间变化有减少趋势,且在48 h减少明显,差异有统计学意义(P<0.05)。结论人参多糖GPS可促使K562细胞周期阻滞在G0/G1期,并诱导K562细胞凋亡,且均呈时间依赖性。GPS促进K562细胞凋亡、导致其细胞周期阻滞的机制可能是通过抑制ERK/NF-κB信号通路的激活,进而下调Cyclin D1来实现的。

关键词：人参多糖 K562细胞周期阻滞 ERK NF-κB CyclinD1

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脑缺血后移植骨髓神经组织定向干细胞的分布与分化

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解放军医学杂志 2012年第11期37卷 1031-1035页

作者：李琳张兴秀王健姜容郑敏重庆医科大学干细胞与组织工程研究室组织学与胚胎学教研室重庆400016 重庆医科大学附属第二医院神经内科重庆400016

目的观察骨髓神经组织定向干细胞(NTCSCs)经静脉移植后在脑缺血大鼠脑内的分布和分化情况。方法采用DMEM/F12(1:1)无血清神经干细胞条件培养基,从SD大鼠骨髓中分离、培养NTCSCs,应用免疫组化法对所获细胞及其分化情况进行鉴定,RT-PCR检... 详细信息

目的观察骨髓神经组织定向干细胞(NTCSCs)经静脉移植后在脑缺血大鼠脑内的分布和分化情况。方法采用DMEM/F12(1:1)无血清神经干细胞条件培养基,从SD大鼠骨髓中分离、培养NTCSCs,应用免疫组化法对所获细胞及其分化情况进行鉴定,RT-PCR检测Nestin、CXCR4、CD31、βⅢ-tubulin及GFAP mRNA的表达水平。采用改良Zea-Longa线栓法制作SD大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,造模成功24h后经尾静脉注射1ml DAPI标记的NTCSCs。移植后第1、3、5、7d处死大鼠,制备脑组织冰冻切片,荧光显微镜观察NTCSCs在脑组织的分布,激光共聚焦显微镜观察NTCSCs的分化情况。结果分离培养获得的NTCSCs在神经干细胞培养条件下形成神经球,并表达神经干细胞标志巢蛋白Nestin及SDF-1受体CXCR4,可分化成βⅢ-tubulin、GFAP阳性细胞;RT-PCR检测结果显示NTCSCs表达Nestin、CXCR4、CD31、βⅢ-tubulin、GFAP mRNA。静脉移植后NTCSCs能够进入大鼠脑内,移植后第3天观察到DAPI标记的NTCSCs主要分布在缺血损伤部位,第7天时有少量NTCSCs分化为GFAP阳性细胞。结论分离培养的NTCSCs具有神经干细胞特性,移植后可能进入缺血脑组织,部分细胞表达GFAP。

关键词：骨髓神经组织定向干细胞干细胞移植颅内栓塞

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