检索结果-内蒙古大学图书馆

中国生物制品学杂志 2012年第7期25卷 877-880页

作者：朱小影王东李身锋张利军钟梁冯文莉重庆医科大学检验医学院临床血液学教研室临床检验诊断学教育部重点实验室重庆400016

目的原核表达抗慢性粒细胞白血病(Chronic myelogenous leukemia,CML)细胞人源化单链抗体(Humanized sin-gle-chain variable fragment,hscFv),并检测其抗原结合活性。方法从重组质粒pUC57-hscFv中扩增hscFv基因,插入含6×His标签的原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a-hscFv,转化*** BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组融合蛋白经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,SDS-PAGE分析其纯度;Western blot分析其反应原性;间接免疫荧光试验检测其抗原结合活性。结果重组表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约为46 000,表达量约占菌体总蛋白的37%,主要以可溶性形式存在;纯化的重组融合蛋白纯度为94%,可与鼠抗6×His单抗及K562细胞表面抗原特异性结合。结论成功原核表达并纯化了抗CML细胞hscFv,为其进一步应用于CML的临床分子诊断和生物靶向治疗奠定了基础。

关键词：慢性粒细胞白血病人源化抗体原核细胞基因表达纯化

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探讨多聚胞嘧啶结合蛋白E2诱骗RNA对32D-BCR／ABL细胞增殖的影响

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肿瘤 2009年第6期29卷 518-522页

作者：王雅珍曾建明袁颖魏容彭智肖青刘钉宾黄世峰陈新敏冯文莉重庆医科大学临床血液学教研室临床检验诊断学教育部重点实验室重庆400016 重庆医科大学临床医学系重庆400016 重庆医科大学临床学院血液科重庆400016

目的:在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)由慢性期向急性期的过渡阶段伴随有多聚胞嘧啶结合蛋白E2[poly(rC)-binding protein E2,hnRNP E2]的异常表达。本研究初步探讨hnRNP E2诱骗RNA(decoy RNA)对32D-BCR/ABL细胞增殖的影响及其可能的分子机制。方法:用电转染方法将hnRNP E2诱骗RNA野生序列和突变序列的表达载体(pGD和pGM)转入32D-BCR/ABL细胞,用G418筛选出稳定表达诱骗RNA的细胞。锥虫蓝染色法和克隆形成实验检测细胞的增殖能力。FCM分析细胞周期,RT-PCR和Western印迹法检测下游CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer-bindingproteinα,C/EBPα)和c-Myc的表达。结果:筛选出稳定表达野生型和突变型诱骗RNA的32DP210-pGD细胞和32DP210-pGM细胞。野生型32DP210-pGD细胞与未转染32D-BCR/ABL细胞相比,其细胞增殖抑制率为(69.48±5.21)%,克隆形成能力明显减弱,细胞周期由G0/G1期向S期进展受阻;C/EBPαmRNA水平无改变,但在蛋白水平上42 ku-C/EBPα的表达增加(43.83±4.91)%;c-Myc mRNA水平下降(35.67±6.64)%,蛋白水平降低(30.91±3.84)%。突变型32DP210-pGM细胞与未转染32D-BCR/ABL的细胞相比,其上述各指标无明显差异。结论:hnRNP E2诱骗RNA能够抑制32D-BCR/ABL细胞的增殖,其机制可能是诱骗RNA阻断hnRNP E2和C/EBPαmRNA的结合,引起42 ku-C/EBPα表达增加,进而引起其下游靶基因c-Myc下调。

关键词：白血病髓样慢性多聚嘧啶区结合蛋白质 CCAAT增强子结合蛋白α 细胞增殖诱骗RNA

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靶向激活蛋白激酶PKR对白血病K562细胞增殖的影响及机制

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癌症 2007年第10期26卷 1058-1063页

作者：赵世巧冯文莉曾建明白卫君王小中温健萍曹唯希罗云萍黄宗干重庆医科大学医学检验系临床血液学教研室 Canadian Blood Services HamiltonON L8S 1H8Canada 重庆医科大学临床学院血液科重庆400016

背景与目的:由t(9;22)(q34;q11)导致的bcr-abl融合基因在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)发病中起着重要的作用。本研究运用CML特异的bcr/abl融合基因的mRNA与外源重组反义RNA形成双链RNA(double strand RNA,dsRNA)能激活双链RNA依赖性蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase,PKR)的策略,研究其对白血病K562细胞增殖的影响及可能的机制。方法:将dsRNA类似物聚肌苷酸-聚胞啶酸(Polyriboinosinic Polyribocytidylic Acid,polyIC)、含bcr/abl融合基因序列40bp的逆转录病毒载体RV-40AS、RV-40AS+2-氨基嘌呤(2-aminopurine,2AP)和含绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的逆转录病毒载体RV-GFP作用于K562细胞,并以ECV304细胞作对照细胞株。通过细胞计数、MTT法和半固体集落形成实验检测其对细胞生长增殖的影响,用流式细胞仪检测处理前后细胞周期的变化,用Western blot法检测细胞内PKR、磷酸化PKR(phosphated PKR,p-PKR)、真核翻译启始因子2α(eukaryotic initiation factor-2α,eIF2α)、磷酸化eIF2α(phosphated eIF2α,peIF2α)蛋白表达的变化,用3H-亮氨酸掺入实验检测细胞总蛋白合成水平的变化。结果:polyIC对K562细胞和ECV304细胞生长和增殖均具有非特异性抑制作用,而RV-40AS仅对K562细胞具有特异性的抑制效应。PKR抑制剂能阻断RV-40AS对K562细胞的抑制效应。polyIC和RV-40AS作用K562细胞24h后,S期细胞减少[polyIC组(37.26±2.35)%,未处理组(58.53±5.42)%,P<0.05;RV-40AS组(31.48±3.65)%,未处理组(58.53±5.42)%,P<0.05],G0/G1期细胞增多[polyIC组(50.97±2.18)%,未处理组(36.44±4.20)%,P<0.05;RV-40AS组(57.47±3.61)%,未处理组(36.44±4.20)%,P<0.05]。polyIC处理K562细胞组、ECV304细胞组以及RV-40AS处理K562细胞组的p-PKR和p-eIF2α蛋白表达显著上调,且总蛋白合成水平下降[RV-40AS处理的K562细胞组(3.5±1.9)cpm/ng,未处理组(26.8±2.6)cpm/ng,P<0.05]。结论:外源重组反义RNA与bcr/abl融合基因的mRNA形成的dsRNA可通过激活PKR而抑制K562细胞的生长增殖,其机制是通过活化的PKR使蛋白合成启始因子eIF2α磷酸化,从而阻断细胞内蛋白合成的启动,及阻止细胞周期进程来实现。

关键词：白血病蛋白激酶 K562细胞细胞增殖

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HnRNP E2诱骗RNA对白血病K562细胞增殖的影响及其可能机制

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癌症 2006年第7期25卷 793-797页

作者：陈新敏冯文莉赵世巧曾建明白卫君王小中黄宗干重庆医科大学医学检验系临床血液学教研室临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室重庆400016 重庆医科大学临床学院血液科重庆400016

背景与目的:BCR/ABL诱导多聚胞嘧啶结合蛋白E2[poly(rC)-bindingproteinE2,hnRNPE2]的异常表达在慢性粒细胞白血病(chronicmyeloidleukemia,CML)急变中起着重要作用。本研究探讨hnRNPE2诱骗RNA(decoyRNA)对人白血病细胞K562增殖的影响,并初步探讨其可能的分子机制。方法:构建能转录出hnRNPE2诱骗RNA的质粒载体,将其经阳离子脂质体介导转染K562细胞,用G418筛选出稳定表达的细胞,台盼蓝法检测细胞的增殖能力,流式细胞仪分析细胞周期,并用RT-PCR和Westernblot方法检测下游CCAAT增强子结合蛋白!(CCAAT/enhancer-bindingprotein!,C/EBPα)和c-myc的表达。结果:稳定表达诱骗RNA的K562细胞增殖受抑,增殖抑制率为(62.73±12.92)%;细胞周期阻滞于S期[稳定表达诱骗RNA细胞组(55.59±4.67)%,对照组(44.70±4.21)%,P<0.05];C/EBPαmRNA无改变,但在蛋白水平42ku-C/EBPα表达升高了(49.72±5.58)%;c-mycmRNA下降了(58.27±7.23)%,蛋白水平降低了(57.26±6.52)%。结论:hnRNPE2诱骗RNA能抑制K562细胞的增殖,其机制可能与诱骗RNA阻断hnRNPE2和C/EBPαmRNA的结合后,引起42ku-C/EBPα表达升高有关。

关键词：白血病诱骗RNA K562细胞多聚胞嘧啶结合蛋白E2

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Bmi-1介导的K562/ADR细胞多药耐药机制

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中国实验血液学杂志 2020年第3期28卷 758-766页

作者：赵宝霞刘思琪董思聪井如男孟秀香大连医科大学检验医学院临床血液学教研室辽宁大连116044 徐州医学院附属市立医院检验科江苏徐州221005

目的:观察Bmi-1基因沉默对白血病耐药细胞株K562/ADR耐药性的影响并初步探讨其机制。方法:将2种序列的Bmi-1小干扰RNA SiRNA转染到耐药细胞K562/ADR,检测Bmi-1基因m RNA和蛋白的表达以确定转染效果。检测Bmi-1基因沉默后耐药蛋白P-gp及... 详细信息

目的:观察Bmi-1基因沉默对白血病耐药细胞株K562/ADR耐药性的影响并初步探讨其机制。方法:将2种序列的Bmi-1小干扰RNA SiRNA转染到耐药细胞K562/ADR,检测Bmi-1基因m RNA和蛋白的表达以确定转染效果。检测Bmi-1基因沉默后耐药蛋白P-gp及其编码基因MDR1的表达情况,并采用流式细胞术检测细胞内阿霉素蓄积情况。检测Bmi-1基因沉默后NF-κB蛋白的表达变化;应用NF-κB抑制剂PDTC处理K562/ADR细胞抑制NF-κB活性后,检测P-gp蛋白的表达及其功能的变化。检测Bmi-1基因沉默后PTEN、AKT和p-AKT蛋白表达的变化。应用PI3K/AKT通路抑制剂LY294002处理K562/ADR细胞抑制p-AKT表达后,检测NF-κB和P-gp蛋白的表达。应用PTEN抑制剂BPV(phen)处理Bmi-1基因沉默后的细胞,检测AKT、p-AKT、NF-κB和P-gp蛋白的表达。以上mRNA表达用RT-PCR法检测,蛋白表达用Western blot法检测。结果:在mRNA水平和蛋白水平2种序列的小干扰RNA均使K562/ADR细胞Bmi-1基因表达降低。MDR1/P-gp在Bmi-1 siRNA干扰细胞中的表达明显低于在K562/ADR细胞的表达(P<0.05);干扰后细胞内阿霉素蓄积增多。Bmi-1基因沉默后,细胞NF-κB活性降低;NF-κB抑制剂抑制NF-κB活性后,K562/ADR细胞P-gp蛋白表达及药物泵出功能被抑制。Bmi-1基因沉默后PTEN蛋白表达增高,而p-AKT蛋白表达明显降低(P<0.05)。PI3K/AKT通路抑制剂LY294002抑制p-AKT表达后,NF-κB活性和P-gp蛋白表达明显下降(P<0.05)。PTEN抑制剂BPV(phen)处理Bmi-1基因沉默细胞后,NF-κB活性和P-gp蛋白表达得到重塑。结论:Bmi-1在MDR1/P-gp介导的K562/ADR细胞多药耐药中起关键作用,这种作用可能是通过激活PTEN/AKT途径调控NF-κB完成。

关键词： Bmi-1 P-糖蛋白 NF-κB K562/ADR

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负荷渐增式训练对老年小鼠骨骼肌卫星细胞AMPK磷酸化的影响

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医用生物力学 2021年第4期36卷 612-617页

作者：陈艳华卜凡舒彬杨忠重庆医科大学第四临床学院康复中心重庆401121 重庆医科大学附属康复医院中医康复科重庆400016 陆军军医大学药学与检验医学系临床血液学教研室重庆400038

目的探讨负荷渐增式训练对老年小鼠骨骼肌卫星细胞腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)磷酸化的影响。方法实验小鼠分为3组:青年对照组(YC组,n=12)、老年对照组(OC组,n=12)与老年运动组(OT组,n=12)。OT组进行负荷渐... 详细信息

目的探讨负荷渐增式训练对老年小鼠骨骼肌卫星细胞腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)磷酸化的影响。方法实验小鼠分为3组:青年对照组(YC组,n=12)、老年对照组(OC组,n=12)与老年运动组(OT组,n=12)。OT组进行负荷渐增式训练,流式细胞分选技术分离CD45-/CD31-/Sca1-/VCAM(CD106)+细胞群体,分选细胞通过desmin、Myod肌原性染色以及成肌分化诱导培养进行肌卫星细胞鉴定,免疫组化结合Western blotting方法检测肌卫星细胞p-AMPK水平。结果YC组骨骼肌卫星细胞AMPK及p-AMPK表达水平显著高于OC组(P<0.05);OT组与OC组AMPK表达无明显变化(P>0.05),而OT组p-AMPK表达水平显著高于OC组(P<0.05)。结论负荷渐增式训练可促进老年小鼠骨骼肌卫星细胞AMPK磷酸化,改善老年小鼠骨骼肌能量代谢。

关键词：骨骼肌卫星细胞负荷渐增式训练腺苷酸活化蛋白激酶磷酸化

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腺病毒介导的AIF及其突变体对K562细胞凋亡的影响

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基础医学与临床 2015年第11期35卷 1453-1459页

作者：代安亚王方冯文莉重庆医科大学检验医学院临床血液学教研室临床检验诊断学教育部重点实验室重庆400016

目的构建凋亡诱导因子(Ad-AIF)及其突变体的重组腺病毒(Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF),观察其对白血病K562细胞凋亡的影响。方法扩增AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF片段,分别克隆至p Ad-TrackCMV-HA质粒中,经过PCR、双酶切和测序鉴定后,分别与p A... 详细信息

目的构建凋亡诱导因子(Ad-AIF)及其突变体的重组腺病毒(Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF),观察其对白血病K562细胞凋亡的影响。方法扩增AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF片段,分别克隆至p Ad-TrackCMV-HA质粒中,经过PCR、双酶切和测序鉴定后,分别与p Ad-Easy1质粒重组得到腺病毒质粒,经包装和扩增后得到腺病毒,以无外源序列的腺病毒作为空载腺病毒。Western blot验证重组腺病毒在K562细胞中的表达,免疫共沉淀检测AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF是否与HSP70相结合,Hoechst33258染色和流式细胞术检测AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF对K562细胞凋亡的影响。结果重组腺病毒构建成功,能够在K562细胞中表达;AIF和DMLS-AIF与HSP70相结合,DHBD-AIF不结合HSP70;Ad-DHBD-AIF引起K562细胞染色质凝集,而Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF处理的K562细胞染色质分布均匀;Ad-DHBD-AIF引起K562细胞凋亡数明显高于Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF(P<0.05)。结论成功构建了腺病毒Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF,其中Ad-DHBD-AIF对K562细胞的凋亡影响明显高于Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF,为K562细胞凋亡受阻的进一步研究奠定了基础。

关键词：凋亡诱导因子细胞凋亡腺病毒载体 K562细胞

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野生型p53基因对白血病K562细胞增殖抑制作用及机制

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第四军医大学学报 2008年第21期29卷 1955-1958页

作者：王宏斌冯文莉黄世峰田文君曹唯希黄宗干重庆医科大学医学检验系临床血液学教研室重庆400016 重庆医科大学临床学院血液科重庆400016

目的:研究重组腺病毒介导的野生型p53基因(Ad5wtp53)对人慢性粒细胞白血病K562细胞增殖的影响及其可能机制.方法:分别将含有Ad5wtp53,突变型p53基因(Ad5mtp53)和绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒表达载体(Ad5GFP),联合阳离子多聚季胺(polyb... 详细信息

目的:研究重组腺病毒介导的野生型p53基因(Ad5wtp53)对人慢性粒细胞白血病K562细胞增殖的影响及其可能机制.方法:分别将含有Ad5wtp53,突变型p53基因(Ad5mtp53)和绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒表达载体(Ad5GFP),联合阳离子多聚季胺(polybrene)共感染K562细胞,经RT-PCR和Western Blot检测p53mRNA和P53蛋白的表达后,应用流式细胞术分析K562细胞周期、DNA含量的变化.WesternBlot检测P21蛋白、核磷蛋白(NPM)、磷酸化核磷蛋白(Thr199-NPM)的表达情况.结果:Ad5wtp53和Ad5mtp53能在K562细胞中表达p53mRNA和P53蛋白.Ad5wtp53感染K562细胞48,72h后分别有(74.45±12.09)%和(69.80±11.70)%的细胞周期出现G0/G1期阻滞,DNA含量分别下降了32.25%和38.13%;同时P21蛋白的表达升高,核磷蛋白的表达无改变,磷酸化核磷蛋白(Thr199)表达下降.而Ad5mtp53感染组和Ad5GFP感染组未见相应改变.结论:野生型P53蛋白可能通过上调P21的表达,阻滞细胞周期于G0/G1期,抑制S期DNA的合成,降低核磷蛋白第199位苏氨酸残基的磷酸化来抑制K562细胞的增殖.

关键词：慢性粒细胞白血病 p53基因中心体

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CTP-OD-HA融合蛋白的原核表达及其活性鉴定

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中国生物制品学杂志 2009年第2期22卷 115-119页

作者：刘钉宾黄世峰曾建明袁颖陶昆温健萍曹唯希黄宗干冯文莉重庆医科大学医学检验系临床血液学教研室临床检验诊断学教育部重点实验室重庆400016 重庆医科大学临床医学系重庆400016 Canadian Blood Services Canada 重庆医科大学临床学院血液科重庆400016

目的构建CTP-OD-HA融合基因原核表达质粒,表达并纯化融合蛋白,并检测其在人慢性粒细胞白血病(CML)K562细胞株中的转导活性及胞浆定位。方法分别将胞浆转导肽(CTP)、寡聚化区域(OD)基因和流感病毒血凝素抗原表位(HA)片段依次连接入pET32a... 详细信息

目的构建CTP-OD-HA融合基因原核表达质粒,表达并纯化融合蛋白,并检测其在人慢性粒细胞白血病(CML)K562细胞株中的转导活性及胞浆定位。方法分别将胞浆转导肽(CTP)、寡聚化区域(OD)基因和流感病毒血凝素抗原表位(HA)片段依次连接入pET32a(+)质粒,构建重组原核表达质粒pCTP-OD-HA,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经亲和纯化、Western blot验证、肠激酶切割、目的蛋白回收和FITC标记后,将FITC-CTP-OD-HA融合蛋白作用于K562细胞,观察其转导活性及细胞定位。结果重组原核表达质粒pCTP-OD-HA经酶切及测序鉴定,证明构建正确。37℃,1 mmol/LIPTG诱导4h,目的蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的35%,纯化后纯度达95%以上。FITC-CTP-OD-HA融合蛋白在K562细胞中具有高转导活性和显著的胞浆定位特性。结论已成功构建CTP-OD-HA融合基因原核表达质粒,并高效表达了目的蛋白,为进一步研究其在CML信号转导通路中的作用,阐明CML的发病机制及探讨蛋白肽在CML中的治疗策略奠定了基础。

关键词：胞浆转导肽寡聚化区域血凝素慢性粒细胞白血病原核表达转导活性胞浆定位

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慢性粒细胞白血病bcr／abl的糖基化磷脂酰肌醇锚定修饰及在COS-7细胞膜上的表达

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第三军医大学学报 2008年第8期30卷 717-720页

作者：陶崑王东曾建明黄世峰陈新敏黄宗干冯文莉重庆医科大学基础医学院免疫学教研室重庆400016 重庆医科大学临床血液学教研室临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室重庆400016 重庆医科大学附属第一医院血液科重庆400016

目的构建与糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol,GPI)锚定序列相连的bcr/abl真核表达质粒,并检测其在COS-7细胞中基因和膜蛋白的表达。方法以编码慢性粒细胞白血病bcr/abl融合蛋白全长序列的migP210质粒为模板,通过PCR扩... 详细信息

目的构建与糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol,GPI)锚定序列相连的bcr/abl真核表达质粒,并检测其在COS-7细胞中基因和膜蛋白的表达。方法以编码慢性粒细胞白血病bcr/abl融合蛋白全长序列的migP210质粒为模板,通过PCR扩增获得654 bp的bcr/abl融合基因片段,双酶切后定向插入真核表达载体pBudCE4.1中,经鉴定获得重组质粒pBB。同时用RT-PCR扩增人外周血淋巴细胞CD24分子中的GPI获得约243 bp的锚定序列,双酶切后克隆入pBB质粒中与bcr/abl基因下游羧基端相连,获得重组质粒pBBG。在多聚阳离子介导下将pBBG质粒转染COS-7细胞,采用RT-PCR和Western blot检测bcr/abl融合基因和蛋白的表达。结果经酶切和测序鉴定证实,由GPI锚定连接的bcr/abl融合基因插入片段正确;RT-PCR检测到转染细胞中有bcr/abl融合基因,Western blot检测到转染细胞膜上有bcr/abl融合蛋白的表达。结论成功构建由GPI锚定修饰的bcr/abl重组质粒pBBG,并能在COS-7细胞膜上表达出bcr/abl融合蛋白。

关键词： bcr/abl融合基因 GPI 真核表达慢性粒细胞白血病

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