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第三军医大学学报 2012年第23期34卷 2378-2383页

作者：姚雪熊冬梅舒静李林陈俊霞重庆医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的检测过表达人核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)基因的质粒pIRES2-EGFP-RI对人膀胱癌T24细胞侵袭转移及上皮细胞间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)现象的影响。方法将连有RI的质粒pIRES2-EGFP-RI稳定转染T24细胞后利用G418筛选出阳性克隆。根据转染的质粒不同分为3组:T24组(未转染组)、T24-0(转染pIRES2-EGFP质粒)和T24-RI组(转染pIRES2-EGFP-RI质粒)。RT-PCR检测T24细胞中RI的mRNA水平变化,细胞免疫荧光及Western blot检测RI蛋白的表达,利用HE染色观察其细胞形态的变化,Transwell方法检测细胞侵袭及转移能力的变化,Western blot检测侵袭转移及EMT相关蛋白Twist、MMP-9和Snail及E-cadherin的表达,构建移植瘤模型,利用HE染色观测肺组织切片癌细胞转移情况,组织免疫化学方法检测移植瘤中RI、Twist、Snail及E-cadherin的表达。结果 T24-RI组人RI的mRNA水平及蛋白表达显著升高(P<0.05);HE染色结果表明细胞铺展良好,核质比明显减小,细胞由间质形态向上皮形态转变;Transwell方法显示T24-RI组细胞的侵袭及转移能力较T24组、T24-0组明显下降;Western blot结果表明T24-RI组Twist、MMP-9和Snail较T24组、T24-0组显著降低(P<0.01),E-cadherin较T24组、T24-0组显著升高(P<0.01);HE染色肺组织切片显示T24-RI组较其他两组癌细胞转移降低,组织免疫化学结果表明T24-RI组RI、E-cadherin蛋白明显升高,而Twist、Snail显著降低。结论过表达人RI载体提高了RI蛋白的表达水平,并抑制了人膀胱癌T24细胞EMT的发生,从而抑制了膀胱癌T24细胞的侵袭、转移。

关键词：人核糖核酸酶抑制因子 T24细胞细胞转移细胞侵袭 EMT

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核糖核酸酶抑制因子过表达抑制B16细胞的侵袭和转移

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第三军医大学学报 2012年第4期34卷 284-289页

作者：潘湘阳李红彦姚雪熊冬梅陈俊霞重庆医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的构建人核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)真核表达载体,检测其对B16细胞侵袭和转移能力的影响。方法提取人7703细胞中的总RNA,RT-PCR特异性扩增RI编码区序列,利用基因重组技术将其克隆到载体pIRES2-EGFP中,稳定转染B1... 详细信息

目的构建人核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)真核表达载体,检测其对B16细胞侵袭和转移能力的影响。方法提取人7703细胞中的总RNA,RT-PCR特异性扩增RI编码区序列,利用基因重组技术将其克隆到载体pIRES2-EGFP中,稳定转染B16细胞以后,经G418筛选出阳性克隆。根据转染质粒不同分别命名为B16细胞组(未转染组)、空质粒对照组(pIRES2-EGFP组)和实验组(pIRES2-EGFP-RI组)。RT-PCR检测B16细胞中RI mRNA水平的表达,并通过Western blot和细胞免疫化学检测RI蛋白水平的表达;HE染色观察细胞形态的改变,黏附实验、划痕实验和Transwell法检测细胞黏附、迁移和侵袭能力的变化;Western blot检测MMP-2、MMP-9和nm23-H1以及E-cadherin的表达;建立C57BL/6小鼠肺转移模型,观察肺上肿瘤转移灶的变化。结果酶切和测序结果证明重组质粒构建成功,实验组细胞RI的mRNA和蛋白的表达较B16细胞组和空质粒对照组显著升高(P<0.05);HE染色结果显示,细胞铺展良好,核质比减小;转染pIRES2-EGFP-RI质粒的实验组细胞的黏附、迁移及侵袭能力明显降低(P<0.05);与两对照组相比,实验组细胞MMP-2和MMP-9的表达水平明显降低,nm23-H1和E-cadherin的表达水平明显升高(P<0.05);动物实验结果显示与对照组相比,实验组的肺转移灶明显减少。结论成功构建的RI真核表达质粒能升高RI基因及蛋白水平的表达,显著抑制了B16细胞的转移和侵袭能力。

关键词：核糖核酸酶抑制因子 B16黑色素瘤细胞细胞黏附细胞运动肿瘤转移肿瘤侵润

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miRNA-451表达质粒的构建及对人A549肺癌细胞侵袭转移及凋亡的影响

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重庆医科大学学报 2012年第10期37卷 841-845页

作者：姚莉孙艳查何彭惠民重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室重庆400016 重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的:探讨miRNA-451对人A549肺癌细胞侵袭转移及凋亡的影响。方法:Hsa-miRNA-451序列通过miRBase数据库查找,根据此序列设计出2条寡核苷酸片段,将目的基因经过退火处理后克隆至真核表达载体pGenesil-1.1质粒中,从而构建成为miRNA-451真... 详细信息

目的:探讨miRNA-451对人A549肺癌细胞侵袭转移及凋亡的影响。方法:Hsa-miRNA-451序列通过miRBase数据库查找,根据此序列设计出2条寡核苷酸片段,将目的基因经过退火处理后克隆至真核表达载体pGenesil-1.1质粒中,从而构建成为miRNA-451真核表达载体(pGenesil-1.1-miRNA-451质粒)。将pGenesil-1.1-miRNA-451及pGenesil-1.1-control质粒分别转染人A549肺癌细胞,经过G418的筛选,建立pGenesil-1.1-miRNA-451及pGenesil-1.1-control稳定表达的细胞株。流式细胞术分析检测细胞凋亡的情况;Transwell小室检测miRNA-451对细胞侵袭能力的影响;细胞划痕实验检测细胞的迁移情况。结果:经测序证实miRNA-451真核表达质粒构建成功,与未处理的人A549肺癌细胞和稳定表达pGenesil-1.1-control的细胞相比,稳定表达了pGenesil-1-miRNA-451的人A549肺癌细胞的侵袭和迁移能力均明显受到抑制影响,而细胞凋亡无明显变化(P>0.05)。结论:miRNA-451对人A549肺癌细胞侵袭转移具有显著的抑制作用,但对细胞凋亡作用不明显。

关键词：肺癌 miRNA-451 侵袭转移凋亡

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RI基因真核表达载体的构建及其对人脐静脉内皮细胞的影响

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第三军医大学学报 2012年第16期34卷 1591-1595页

作者：李红彦潘湘阳姚雪熊东梅陈俊霞重庆医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的构建融合表达载体pcDNA3.1-RI,并检测核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)基因与血管生成素(angiogenin,ANG)的关系及对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖及迁移能力的影响。方法用RT-PCR方法扩增RI基因,酶切后将其插入pcDNA3.1,构建融合表达载体pcDNA3.1-RI,在脂质体介导下转染HUVECs,RT-PCR检测RI、ANG基因的mRNA表达水平;Western blot检测RI、ANG、MMP-2、MMP-9的表达水平;CO-IP法检测ANG和RI的相互作用,MTT法检测细胞的增殖活力,流式细胞仪检测细胞周期分布。结果真核表达质粒构建成功;转染pcDNA3.1-RI组细胞RI基因的mRNA及蛋白的表达较2个对照组(转染pcDNA3.1空载体组和未转染质粒组)均呈显著性增加(P<0.05),而ANG基因的mRNA及蛋白的表达均降低(P<0.05),MMP-2、MMP-9蛋白表达水平亦降低(P<0.05);CO-IP法检测到ANG和RI在细胞内能结合;转染pcDNA3.1-RI质粒到HUVECs细胞后细胞的增殖活力明显降低(P<0.05),G0～G1期比例明显增加,S期减少。结论成功构建的真核表达质粒能显著增加RI基因及其蛋白水平的表达,RI可以直接在转录水平上降低ANG的表达,在细胞内与ANG结合,从而影响内皮细胞的增殖、迁移能力。

关键词：核糖核酸酶抑制因子人脐静脉内皮细胞血管生成素真核表达

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siRNA沉默整合素连接激酶对人膀胱癌细胞凋亡的影响

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第三军医大学学报 2012年第21期34卷 2154-2157页

作者：高娟康炜陈俊霞朱军潘湘阳西安医学院附属医院检验科西安710077 重庆医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆2400016

目的探讨应用整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)特异性siRNA沉默ILK基因的表达对人膀胱癌细胞凋亡的影响。方法将构建好的针对ILK基因的1个特异性siRNA表达质粒和1个无同源性的阴性对照质粒,在脂质体介导下稳定转染人膀胱癌BI... 详细信息

目的探讨应用整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)特异性siRNA沉默ILK基因的表达对人膀胱癌细胞凋亡的影响。方法将构建好的针对ILK基因的1个特异性siRNA表达质粒和1个无同源性的阴性对照质粒,在脂质体介导下稳定转染人膀胱癌BIU-87细胞,并将实验分为BIU-87 si ILK、BIU-87 vector及BIU-87细胞3组,运用TUNEL凋亡检测试剂盒和流式细胞术检测BIU-87细胞的凋亡,进一步运用Western blot检测siRNA ILK对凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax和Bcl-2的影响。结果 TUNEL检测结果显示,BIU-87 si ILK组出现大量凋亡细胞,而BIU-87细胞组和BIU-87 vector组仅有少量凋亡细胞出现。流式细胞仪检测结果显示,BIU-87 si ILK组细胞大约有(75.70±2.00)%的凋亡细胞,而BIU-87 vector组和BIU-87细胞组仅有(0.88±0.10)%和(1.66±0.90)%的凋亡细胞,Western blot结果显示,在BIU-87 si ILK组中,Bcl-2的表达明显降低(P<0.05),而Bax和Caspase-3的表达明显升高(P<0.01)。结论 siRNA ILK可能通过调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3的表达诱导膀胱癌BIU-87细胞凋亡的发生。

关键词：整合素连接激酶膀胱癌凋亡

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HBc蛋白与NIRF蛋白细胞外相互作用鉴定

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生物学杂志 2012年第1期29卷 21-24,46页

作者：杨艳金方敏白露王筱绘段昌柱重庆医科大学细胞生物学与遗传学教研室重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

构建原核表达质粒pGST-HBc,真核表达质粒pFLAG-NIRF,表达并纯化GST-HBc蛋白,表达FLAG-NIRF蛋白,利用GST pull down技术鉴定HBc与NIRF蛋白的相互作用。利用PCR技术分别扩增HBc编码框和NIRF基因全长,并将其分别插入到原核表达载体pGEX-4T-... 详细信息

构建原核表达质粒pGST-HBc,真核表达质粒pFLAG-NIRF,表达并纯化GST-HBc蛋白,表达FLAG-NIRF蛋白,利用GST pull down技术鉴定HBc与NIRF蛋白的相互作用。利用PCR技术分别扩增HBc编码框和NIRF基因全长,并将其分别插入到原核表达载体pGEX-4T-1和真核表达载体p3*FLAG-CMV-10中,构建出pGST-HBc及pFLAG-NIRF。pFLAG-NIRF转染HEK293,培养48 h,收获前10 h加入MG132抑制蛋白酶体,收获细胞,经NP40裂解后离心收集上清pGST-HBc转化BL21(DE3)细菌,优化培养条件使GST-HBc在上清中大量表达,然后用GST4Bgel亲合纯化该蛋白,结合有GST-HBc蛋白与含FLAG-NIRF的细胞上清孵育后,离心收集GST 4Bgel,经洗脱液洗脱后蛋白电泳,western blotting分析。构建了pGST-HBc及pFLAG-NIRF,在上清中成功表达GST-HBc并纯化该蛋白,在细胞中成功表达FLAG-NIRF,GST pull down结果显示两者存在体外相互结合。HBc与NIRF能够在细胞外发生相互结合。

关键词： HBc NIRF 相互作用 GST pull down

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UHRF2结构域突变体的原核表达与纯化

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医学分子生物学杂志 2012年第2期9卷 98-102页

作者：白露胡斌杨艳段昌柱重庆医科大学细胞生物学与遗传学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆市400016

目的构建UHRF2各个以结构域为基础的突变体原核表达载体，在大肠埃希菌中表达并对融合蛋白进行纯化和鉴定。方法以pCMV-3xFlag—UHRF2为模板，PCR扩增UHRF2的各个结构域基因片段，各PCR产物经酶切后连接到pGEX-4T-1载体上；将重组载体... 详细信息

目的构建UHRF2各个以结构域为基础的突变体原核表达载体，在大肠埃希菌中表达并对融合蛋白进行纯化和鉴定。方法以pCMV-3xFlag—UHRF2为模板，PCR扩增UHRF2的各个结构域基因片段，各PCR产物经酶切后连接到pGEX-4T-1载体上；将重组载体转化大肠埃希菌（BL21菌株），IPTG诱导表达各GST融合蛋白，超声波破碎细菌，离心收获蛋白并经谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B（glutathione sepharose 4B）亲合纯化；纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳后用考马斯亮蓝染色或免疫印记实验鉴定各蛋白表达情况。结果成功构建了UHRF2结构域突变体的原核表达载体，各突变体蛋白表达正确。结论UHRF2各结构域突变体的成功构建便于用GST pull—down实验研究UHRF2参与与其它蛋白相互作用的结构域，为了解UHRF2功能打下了基础。

关键词： UHRF2 结构域突变体 GST融合蛋白 ICBP90 表观遗传学

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转录因子XBP1S对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响

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肿瘤 2011年第1期31卷 11-16页

作者：林建炜刘平向廷秀李祥柱赵文君郭风劲重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室重庆400016 重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学附属第一医院分子肿瘤及表观遗传学实验室重庆400016

目的:探讨人剪接型X盒结合蛋白1(X-box binding protein1spliced,XBP1S)对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响。方法:应用衣霉素(tunicamycin,Tm)和毒胡萝卜素(thapsigargin,Tg)建立HepG2细胞的内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)模型。将XBP1S真核表达载体pcDNA3.1(-)-XBP1S和靶向XBP1S的RNA干扰质粒pSUPER-XBP1S转染HepG2细胞,MTT法检测细胞的增殖能力,荧光显微镜下观察细胞的形态学变化,FCM法检测细胞凋亡率,Western印迹法检测caspase12的表达。结果:转染pSUPER-XBP1S可有效抑制细胞增殖,而转染pcDNA3.1(-)-XBP1S可促进细胞增殖。荧光显微镜下可见Tm处理组细胞出现细胞凋亡的形态学改变,进一步下调XBP1S的表达可使这一改变增强。对照组、Tm组、Tm+pSUPER-XBP1S转染组和Tm+pcDNA3.1(-)-XBP1S转染组细胞的凋亡率分别为5.21%、41.51%、52.15%和35.87%,差异有统计学意义(P<0.05)。HepG2细胞中caspase12的表达,Tm组高于对照组,Tm+pSUPER-XBP1S转染组高于Tm组,Tm+pcDNA3.1(-)-XBP1S转染组低于Tm组。结论:XBP1S可以促进肝癌HepG2细胞增殖,抑制或促进XBP1S表达可调节ERS介导的细胞凋亡。

关键词：肝肿瘤 X盒结合蛋白1 内质网应激细胞增殖细胞凋亡细胞,HepG2

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整合素连接激酶基因沉默对膀胱癌BIU-87细胞增殖能力的影响及其机制

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中国生物制品学杂志 2011年第7期24卷 785-790页

作者：高娟朱军潘湘阳李红彦陈俊霞重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室重庆400016 重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的构建整合素连接激酶(Integrin linked kinase,ILK)基因siRNA干扰质粒,探讨ILK基因沉默对膀胱癌BIU-87细胞增殖能力及糖原合成酶激酶3(Glycogen synthase kinase 3,GSK3)、β-环连蛋白(β-catenin)表达的影响。方法构建针对人ILK基因... 详细信息

目的构建整合素连接激酶(Integrin linked kinase,ILK)基因siRNA干扰质粒,探讨ILK基因沉默对膀胱癌BIU-87细胞增殖能力及糖原合成酶激酶3(Glycogen synthase kinase 3,GSK3)、β-环连蛋白(β-catenin)表达的影响。方法构建针对人ILK基因的2个特异性siRNA表达质粒和1个无同源性的阴性对照质粒,在脂质体介导下转染膀胱癌BIU-87细胞,通过RT-PCR及Western blot检测ILK基因mRNA和蛋白的表达水平,筛选出1个干扰效果较强的质粒用于后续试验,Western blot检测细胞GSK3和β-catenin蛋白的表达,Am-blue法检测细胞的增殖活力,流式细胞术检测细胞周期的分布。结果经酶切和测序证明重组干扰质粒构建正确;稳定转染pGenesil-1 siRNA1和pGenesil-1 siRNA2质粒的BIU-87细胞ILK基因mRNA和蛋白表达水平较BIU-87细胞组(未转染组)分别下降了69%、52%和70%、55%,选择pGenesil-1 siRNA1为最有效干扰序列;BIU-87siRNA1组GSK3的表达水平较阴性对照组和BIU-87细胞组分别升高了41.87%和30.12%,β-catenin的表达水平较阴性对照组和BIU-87细胞组分别降低了38.67%和48.05%;BIU-87 siRNA1组细胞增殖活力明显下降;BIU-87 siRNA1组G0-G1期细胞比例明显增加,S期减少。结论已成功构建ILK基因siRNA表达质粒,其可明显抑制膀胱癌BIU-87细胞的增殖,机制可能为ILK基因通过介导GSK3、β-catenin信号分子促进膀胱癌BIU-87细胞的增殖。

关键词：整合素连接激酶 RNA干扰膀胱肿瘤细胞增殖

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NIRF蛋白的原核表达及纯化

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中国生物制品学杂志 2011年第1期24卷 56-60页

作者：杨艳金方敏钱冠华段昌柱重庆医科大学细胞生物学与遗传学教研室重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的原核表达NIRF基因,并纯化NIRF蛋白。方法 PCR扩增全长NIRF基因,克隆入原核表达质粒pGEX-4T-1中,转化*** BL21(DE3),IPTG诱导表达,并用GST 4B球珠亲和纯化目的蛋白。结果重组表达质粒pGST-NIRF经酶切鉴定证明构建正确。22℃条件下... 详细信息

目的原核表达NIRF基因,并纯化NIRF蛋白。方法 PCR扩增全长NIRF基因,克隆入原核表达质粒pGEX-4T-1中,转化*** BL21(DE3),IPTG诱导表达,并用GST 4B球珠亲和纯化目的蛋白。结果重组表达质粒pGST-NIRF经酶切鉴定证明构建正确。22℃条件下培养,菌体A600值达1.8时,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导7 h,能使GST-NIRF在上清中大量表达;纯化的重组GST-NIRF蛋白纯度达85%以上,可与GST抗体和NIRF抗体发生特异性结合。结论已成功在大肠杆菌中表达了GST-NIRF蛋白,纯化的蛋白可用于NIRF的生物功能活性研究。

关键词： NIRF GST标签原核细胞基因表达纯化

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