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特异性ILK siRNA对膀胱癌移植瘤生长及p-Akt、p-GSK3β表达的影响

第三军医大学学报 2011年第18期33卷 1947-1950页

作者：高娟朱军潘湘阳李红彦陈俊霞重庆医科大学细胞生物学与遗传学教研室重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的探讨应用整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)特异siRNA沉默ILK基因的表达对膀胱癌裸鼠移植瘤生长及p-Akt、p-GSK3β表达的影响。方法实验分3组:BIU-87细胞组(正常BIU-87细胞)、BIU-87-NC组(转染阴性对照质粒的BIU-87细胞)... 详细信息

目的探讨应用整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)特异siRNA沉默ILK基因的表达对膀胱癌裸鼠移植瘤生长及p-Akt、p-GSK3β表达的影响。方法实验分3组:BIU-87细胞组(正常BIU-87细胞)、BIU-87-NC组(转染阴性对照质粒的BIU-87细胞)、BIU-87 siRNA(转染干扰质粒的BIU-87细胞)。将ILK特异性siRNA转染人膀胱癌BIU-87细胞,筛选稳定表达ILK siRNA的BIU-87细胞,将其注入裸鼠皮下,检测裸鼠移植瘤的大小和质量,HE染色观察移植瘤组织的形态学变化,利用免疫组化技术检测移植瘤组织中微血管的变化及p-Akt和p-GSK3β的表达。结果 BIU-87siRNA组较BIU-87与BIU-87-NC组,瘤体质量显著降低(P<0.01),抑瘤率分别为64.73%和66.73%。BIU-87 siRNA组癌细胞较BIU-87与BIU-87-NC组体积减小,核浆比例明显缩小,细胞核染色较浅,核分裂相显著减少,BIU-87 siRNA组微血管较BIU-87与BIU-87-NC组明显减少甚至无血管出现,BIU-87 siRNA组p-Akt和p-GSK3β的表达呈弱阳性反应。结论特异性ILK siRNA能抑制膀胱癌裸鼠移植瘤的生长,并通过降低p-Akt和p-GSK3β的表达抑制膀胱癌裸鼠移植瘤的增殖。

关键词：整合素连接激酶膀胱癌移植瘤生长

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分子伴侣BiP结构域分析及对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

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中国细胞生物学学报 2011年第11期33卷 1204-1212页

作者：李祥柱刘艳娜赵文君周菁华郭风劲重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室重庆医科大学分子医学及肿瘤研究中心重庆400016

结合免疫球蛋白(binding immunoglobulin protein,BiP),是Hsp70(70 kilodalton heatshock proteins)蛋白家族的成员之一,是内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)主要的调节器。为了研究BiP的分子结构与生物学功能的关系,首先,分析BiP的DNA序列和蛋白质空间构象,接着利用重叠PCR方法分别克隆ATPase结构域缺失体和peptide-binding结构域缺失体(BiPa和BiPp),成功构建带myc标签的真核表达载体,转染LO2细胞和SMMC-7721细胞,应用免疫印迹方法检测其在细胞内的表达;运用MTT法、BrdU免疫组化法及流式细胞仪分别检测细胞的增殖和凋亡;检测BiP及两个组成结构域对SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响。酶切、电泳和DNA测序结果显示,BiP全长和两个缺失体的真核表达载体构建成功;免疫印迹检测到BiP三种真核载体在LO2细胞和SMMC-7721细胞中均能正确表达;MTT和BrdU免疫组化结果表明,BiP全长和缺失体BiPa、BiPp三种真核载体均能有效促进SMMC-7721的增殖,各组间细胞增殖率结果分析提示ATPase功能域可能抑制细胞增殖,而peptide-binding结构域可能促进细胞的增殖;流式细胞仪结果显示,转染BiP、BiPa、BiPp三种真核载体均可以促进SMMC-7721的凋亡,缺失体BiPa与全长BiP组间凋亡率差异不显著;而缺失体BiPp组细胞凋亡率明显低于全长BiP组,两组差异具有显著性(P<0.05);提示ATPase功能域与细胞凋亡可能不相关,而peptide-binding结构域可能促进细胞的凋亡。上述结果表明,BiP的两个组成结构域:ATPase功能域与peptide-binding结构域,独立存在或者共同存在时,调控细胞增殖与凋亡具有差异性;当两个结构域共同存在时,它们会协同调控细胞的增殖与凋亡,具体的分子机制还需要进一步的实验研究和探讨。

关键词： BiP 缺失体生物信息学细胞增殖

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沉默核糖核酸酶抑制因子促进膀胱癌BIU-87细胞生长和转移潜能

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第三军医大学学报 2011年第22期33卷 2357-2360页

作者：陈俊霞高娟朱军姜蓉重庆医科大学基础医学院细胞生物学及遗传学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学基础医学院干细胞与组织工程研究室重庆400016

目的研究沉默核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)基因表达,对人膀胱癌BIU-87细胞增殖和侵袭能力及肿瘤生长的影响。方法通过用RI mRNA的特异性siRNA表达载体和无同源性的对照载体,在脂质体介导下稳定转染膀胱癌BIU-87细胞,... 详细信息

目的研究沉默核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)基因表达,对人膀胱癌BIU-87细胞增殖和侵袭能力及肿瘤生长的影响。方法通过用RI mRNA的特异性siRNA表达载体和无同源性的对照载体,在脂质体介导下稳定转染膀胱癌BIU-87细胞,通过筛选、鉴定后,用Am-blue法检测细胞增殖能力及用Western blot分析细胞中MMP-2和MMP-9的表达。将siRNA RI BIU-87(实验组)及对照组细胞皮下注射到BALB/c裸鼠中,观察肿瘤的生长和肿瘤微血管密度的变化,以及nm23-H1和E-cadherin在肿瘤中的表达。结果 RI基因表达下调显著增加了细胞的增殖,而且显著增强了MMP-2和MMP-9的表达。动物实验结果显示,实验组显著促进了肿瘤的生长(促瘤增长率31.85%),具有更大的瘤质量和更高的肿瘤微血管密度以及更低的nm23-H1和E-cadherin的表达。结论抑制RI基因的表达能显著提高膀胱癌细胞的生长和侵袭潜能,RI可能作为治疗膀胱癌的靶蛋白。

关键词：核糖核酸酶抑制因子膀胱癌细胞肿瘤生长转移

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外源性TGF-β1诱导人乳腺癌MCF-7细胞的乙醛脱氢酶1 mRNA及蛋白表达

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复旦学报（医学版） 2011年第4期38卷 340-342页

作者：韩明利吴诚义莫志强彭琼乐王艺梦屈洪波重庆医科大学附属第一医院内分泌外科重庆400016 重庆医科大学基础医学院细胞生物学及遗传学教研室重庆400016 重庆医科大学基础医学院分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学附属第一医院急诊科重庆400016

目的本研究旨在探讨外源性TGF-β1诱导人乳腺癌MCF-7细胞对乙醛脱氢酶1(aldehyde dehydrogenase1,ALDH1)mRNA及蛋白表达的影响。方法用不同浓度(1、5ng/mL)的TGF-β1诱导体外培养的MCF-7细胞48h后,RT-PCR检测ALDH1mRNA的表达变化,Western blot检测ALDH1蛋白的表达变化。结果 TGF-β1(1、5ng/mL)诱导的MCF-7细胞的ALDH1mRNA及蛋白表达均高于未诱导的MCF-7亲本细胞,差异有统计学意义(P均<0.001);高浓度(5ng/mL)TGF-β1诱导的MCF-7细胞的ALDH1mRNA及蛋白表达均高于低浓度(1ng/mL)TGF-β1诱导的MCF-7细胞,差异有统计学意义(P均<0.001)。结论外源性TGF-β1可诱导人乳腺癌MCF-7细胞上调ALDH1mRNA及蛋白的表达,可能诱导ALDH1+乳腺癌肿瘤干细胞(cancer stemcell,CSC)的转化,并有一定的浓度依赖性。

关键词： TGF-β1 乙醛脱氢酶1 乳腺癌上皮-间质转化肿瘤干细胞

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沉默FNBP1基因对人HL-7702细胞体外增殖及迁移能力的影响

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激光生物学报 2011年第4期20卷 490-495页

作者：张乾英王蕴红朱重阳张军重庆医科大学分子医学及肿瘤学研究中心细胞生物学及遗传学教研室重庆400016

为了研究沉默FNBP1(formin-binding protem1)基因对细胞体外增殖以及对细胞迁移能力的影响,设计并构建了3个靶向FNBP1 siRNA干扰载体(Si-1,Si-2,Si-3),经酶切和DNA测序鉴定后转染人正常的肝细胞HL-7702。RT-PCR和Western blot检测瞬时... 详细信息

为了研究沉默FNBP1(formin-binding protem1)基因对细胞体外增殖以及对细胞迁移能力的影响,设计并构建了3个靶向FNBP1 siRNA干扰载体(Si-1,Si-2,Si-3),经酶切和DNA测序鉴定后转染人正常的肝细胞HL-7702。RT-PCR和Western blot检测瞬时转染细胞中FNBP1基因的干扰效率,筛选出特异高效的RNAi靶点。并用G418筛选稳定表达了RNAi的细胞株,用XTT法检测细胞体外增殖率,划痕法检测细胞的迁移能力。结果显示:酶切和测序结果证明干扰质粒构建正确;转染特异性的干扰质粒(Si-1、Si-2、Si-3)细胞的FNBP1基因表达量与对照组相比均有所降低,在蛋白质水平表达也明显受到抑制,且重组干扰质粒Si-2的干扰效应较强。XTT检测结果表明,构建的沉默FNBP1重组质粒Si-2能显著抑制HL-7702细胞的体外增殖能力,但并不直接影响HL-7702细胞的迁移能力。

关键词： FNBP1 RNA干扰 HL 7702细胞

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沉默FNBPl基因对人HL-7702细胞体外增殖及迁移能力的影响

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激光生物学报 2011年第4期20卷 490-495页

作者：张乾英王蕴红朱重阳张军重庆医科大学分子医学及肿瘤学研究中心重庆400016 重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室重庆400016

为了研究沉默门忸尸1（formin—bindingprotein1）基因对细胞体外增殖以及对细胞迁移能力的影响，设计并构建了3个靶向FNBPlsiRNA干扰载体（Si一1，Si-2，Si一3），经酶切和DNA测序鉴定后转染人正常的肝细胞HL-7702。***和Westernblot... 详细信息

为了研究沉默门忸尸1（formin—bindingprotein1）基因对细胞体外增殖以及对细胞迁移能力的影响，设计并构建了3个靶向FNBPlsiRNA干扰载体（Si一1，Si-2，Si一3），经酶切和DNA测序鉴定后转染人正常的肝细胞HL-7702。***和Westernblot检测瞬时转染细胞中FNBPI基因的干扰效率，筛选出特异高效的RNAi靶点。并用G418筛选稳定表达了RNAi的细胞株，用XTT法检测细胞体外增殖率，划痕法检测细胞的迁移能力。结果显示：酶切和测序结果证明干扰质粒构建正确；转染特异性的干扰质粒（Si一1、Si-2、Si一3）细胞的FNBPl基因表达量与对照组相比均有所降低，在蛋白质水平表达也明显受到抑制，且重组干扰质粒Si一2的干扰效应较强。X＇IT检测结果表明，构建的沉默FNBPl重组质粒Si-2能显著抑制HL一7702细胞的体外增殖能力，但并不直接影响HL-7702细胞的迁移能力。

关键词： FNBPl RNA干扰 HL·7702细胞

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IRE1结构域分析及截短型载体的构建和表达

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医学分子生物学杂志 2011年第2期8卷 108-113页

作者：刘平李祥柱赵文君刘艳娜周菁华郭风劲重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室重庆市400016 重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆市400016

目的克隆IRE1基因,根据IRE1基因不同生物学功能的4个结构域构建截短型真核表达载体,并用生物信息学方法对其蛋白产物进行分析.方法应用PCR重组技术,以pCMV-IRE1为模板扩增IRE1全长及4个截短型片段,利用DNA重组技术将片段定向插入到真... 详细信息

目的克隆IRE1基因,根据IRE1基因不同生物学功能的4个结构域构建截短型真核表达载体,并用生物信息学方法对其蛋白产物进行分析.方法应用PCR重组技术,以pCMV-IRE1为模板扩增IRE1全长及4个截短型片段,利用DNA重组技术将片段定向插入到真核表达载体pcDNA3.1（-）中,经酶切及测序鉴定后,免疫印迹检测各重组载体在细胞中的表达,并利用SWISS-MODEL在线软件预测其蛋白结构.结果酶切鉴定及Western 印迹结果表明成功构建了IRE1全长及每一种截短型片段的真核表达载体：pcDNA3.1（-）-IRE1（pIRE1）,pcDNA3.1（-）-IRE1-NLDP（pNLD）,pcDNA3.1（-）-IRE1-KinaseP（pKinase）,pcDNA3.1（-）-IRE1-R＋L（pR＋L）,pcDNA3.1（-）-IRE1-RNase（pRNase）.结论 IRE1及其截短型真核表达载体的成功构建和表达,为进一步研究IRE1各个结构域的生物学功能奠定了基础.

关键词：内质网应激需肌醇酶结构域载体构建

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转录因子XBPlS对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响

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肿瘤 2011年第1期31卷 11-16页

作者：林建炜刘平向廷秀李祥柱赵文君郭风劲重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室重庆400016 重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学附属第一医院分子肿瘤及表观遗传学实验室重庆400016

目的：探讨人剪接型X盒结合蛋白1（X—boxbinding protein 1 spliced，XBPIS）对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响。方法：应用衣霉素（tunicamycin，Tm）和毒胡萝卜素（thapsigargin，Tg）建立HepG2细胞的内质网应激（endoplasmicreticulumstress，ERS）模型。将XBPlS真核表达载体pcDNA3．1（-）-XBPlS和靶向XBPlS的RNA干扰质粒pSUPER-XBPlS转染HepG2细胞，MTT法检测细胞的增殖能力，荧光显微镜下观察细胞的形态学变化，FCM法检测细胞凋亡率，Western印迹法检测caspasel2的表达。结果：转染pSUPER-XBPlS可有效抑制细胞增殖，而转染pcDNA3．1（-）-XBPlS可促进细胞增殖。荧光显微镜下可见Tm处理组细胞出现细胞凋亡的形态学改变，进一步下调XBPlS的表达可使这一改变增强。对照组、Tm组、Tm＋pSUPER-XBPlS转染组和Tm＋pcDNA3．1（-）-XBPlS转染组细胞的凋亡率分别为5．21％、41．51％、52．15％和135．87％，差异有统计学意义（P〈0．05）。HepG2细胞中caspasel2的表达，Tm组高于对照组，Tm＋pSUPER-XBPlS转染组高于Tm组，Tm＋pcDNA3．1（-）-XBPlS转染组低于Tm组。结论：XBPlS可以促进肝癌HepG2细胞增殖，抑制或促进XBPlS表达可调节ERS介导的细胞凋亡。

关键词：肝肿瘤 X盒结合蛋白1 内质网应激细胞增殖细胞凋亡细胞,HepG2

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let-7a对肺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长的影响

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中国生物制品学杂志 2011年第8期24卷 885-888,892页

作者：何晓燕彭琼乐张政彭惠民重庆医科大学附属儿童医院临床分子医学中心重庆400016 儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室重庆400016 儿科学重庆市重点实验室重庆400016 重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室重庆400016 重庆医科大学实验教学中心重庆400016

目的研究let-7a对肺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长的影响及其可能的分子机制。方法将A549细胞、稳定转染let-7a重组质粒的A549-let-7a细胞及稳定转染对照质粒的A549-control细胞分别接种至BALB/c裸鼠背部皮下,观察各组细胞在裸鼠体内的生长... 详细信息

目的研究let-7a对肺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长的影响及其可能的分子机制。方法将A549细胞、稳定转染let-7a重组质粒的A549-let-7a细胞及稳定转染对照质粒的A549-control细胞分别接种至BALB/c裸鼠背部皮下,观察各组细胞在裸鼠体内的生长情况,测量肿瘤体积并绘制生长曲线;30 d后处死裸鼠,取出瘤体,称重并计算抑瘤率;HE染色观察瘤组织的形态学改变;Western blot及免疫组化法检测各组瘤组织中k-Ras蛋白的表达情况。结果与A549细胞组相比,A549-let-7a细胞组裸鼠的瘤体生长速度明显减慢,瘤体重量显著降低(P<0.01),抑瘤率为27.51%,A549-control细胞组差异无统计学意义(P>0.05);HE染色显示,A549-let-7a细胞组癌细胞体积较其他两组减小,核浆比例明显缩小,核分裂相显著减少;Westernblot及免疫组化结果表明,与A549细胞组相比,A549-let-7a细胞组瘤组织中k-Ras蛋白的表达明显降低(P<0.01),而A549-control细胞组中k-Ras蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论 let-7a能显著抑制A549细胞在裸鼠体内的生长能力,其机制可能与下调k-Ras蛋白的表达有关。

关键词：微RNAs let-7a 肺肿瘤 A549细胞 k-Ras 小鼠,裸

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内质网分子伴侣BiP缺失突变体的构建及生物信息学分析

内质网分子伴侣BiP缺失突变体的构建及生物信息学分析

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中华医学会医学细胞生物学分会第三届全国学术会议

作者：李祥柱赵文君刘平刘艳娜周菁华郭风劲重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆 400016

免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP),又称GRP-78或HspA5,是位于内质网(ER)的重要分子伴侣,属于热休克蛋白(Hsp70)家族成员之一.BiP与许多内质网蛋白都有短暂的相互作用,是内质网维持内环境稳态的一个感应器,参与内质网应激(ERS)介导的未折叠... 详细信息

免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP),又称GRP-78或HspA5,是位于内质网(ER)的重要分子伴侣,属于热休克蛋白(Hsp70)家族成员之一.BiP与许多内质网蛋白都有短暂的相互作用,是内质网维持内环境稳态的一个感应器,参与内质网应激(ERS)介导的未折叠蛋白反应过程.为了研究BiP的分子结构与生物学功能的关系,本研究通过分析BiP的DNA碱基序列和蛋白质空间构象,利用重叠PCR技术克隆分别获得缺失ATPase和peptide-binding区的缺失体(BiPa,BiPp),成功构建带myc标签的真核表达载体,将其转入LO2细胞中,应用免疫印迹方法鉴定其在细胞内的正确表达.酶切电泳和DNA测序结果显示,成功构建了BiP全长和2个缺失体的真核表达载体,免疫印迹检测到3种真核载体在LO2细胞中均能正确表达.BiP全长及缺失体真核表达载体的成功构建和表达为进一步研究BiP结构域及生物学功能奠定实验基础.

关键词：内质网分子伴侣 BiP 缺失体生物信息学重叠PCR

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