检索结果-内蒙古大学图书馆

基于CRISPR/Cas9技术构建IDO1基因敲除的THP-1细胞株及其表型研究

免疫学杂志 2024年第1期40卷 87-95页

作者：李雪银吴传新刘慧玲李丽程莎孙航重庆医科大学附属第二医院感染科重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室重庆医科大学病毒性肝炎研究所401336 重庆医科大学附属第二医院肝胆外科 401336

目的采用CRISPR/Cas9技术构建吲哚胺-2,3-双加氧酶1(IDO1)基因敲除的THP-1细胞株,为研究IDO1在巨噬细胞中的作用提供细胞模型。方法设计靶向IDO1基因的3条向导RNA(guide RNA,gRNA),分别构建IDO1-gRNA重组质粒,酶切及测序鉴定后,包装成... 详细信息

目的采用CRISPR/Cas9技术构建吲哚胺-2,3-双加氧酶1(IDO1)基因敲除的THP-1细胞株,为研究IDO1在巨噬细胞中的作用提供细胞模型。方法设计靶向IDO1基因的3条向导RNA(guide RNA,gRNA),分别构建IDO1-gRNA重组质粒,酶切及测序鉴定后,包装成Lenti-IDO1-gRNA慢病毒。利用Cas9慢病毒感染THP-1细胞获得稳定表达Cas9蛋白的细胞株,再经Lenti-IDO1-gRNA慢病毒感染敲除IDO1基因,有限稀释法获得单克隆细胞株。T7E1酶切检测gRNA打靶效率,PCR产物测序和Western blot鉴定IDO1基因敲除效果。CCK8法检测IDO1基因敲除对THP-1细胞增殖活性的影响,流式细胞术检测对巨噬细胞标志物CD11b、CD68和CD14表达的影响,中性红法检测巨噬细胞吞噬功能。结果成功构建了3种IDO1-gRNA重组质粒,3条gRNA均能有效编辑IDO1基因,以gRNA2编辑效率最高。经PCR产物测序和Western blot验证获得了3株THP-1 IDO1-KO单克隆细胞株,并发现IDO1基因敲除可抑制THP-1细胞增殖,下调THP-1巨噬细胞CD11b、CD68表达,上调CD14表达,增强THP-1巨噬细胞吞噬功能。结论成功构建IDO1基因敲除的THP-1细胞株;IDO1对THP-1细胞增殖活性、分化调节以及THP-1巨噬细胞吞噬功能调节有重要作用,为后续进一步探讨IDO1基因在巨噬细胞中的功能及机制研究奠定基础。

关键词： CRISPR/Cas9 吲哚胺-2,3-双加氧酶1 基因敲除 THP-1细胞巨噬细胞

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阻断肝再生增强因子的表达对人肝癌细胞株HepG2增殖的抑制作用

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癌症 2006年第6期25卷 671-676页

作者：唐琳孙航张林郭晖张玲刘杞重庆医科大学病毒性肝炎研究所感染性疾病分子生物学实验室重庆400010 四川省医学科学院四川省人民医院感染科成都610072 重庆医科大学附属第二医院肾内科重庆400010

背景与目的:前期研究中已发现人肝再生增强因子(humanaugmenterofliverregeneration,hALR)在肝癌细胞中呈高表达,在正常肝细胞中几乎不表达,并在体外能刺激肝癌细胞株增殖,而对正常肝细胞无影响。本研究通过运用hALR的siRNA和hALR单克... 详细信息

背景与目的:前期研究中已发现人肝再生增强因子(humanaugmenterofliverregeneration,hALR)在肝癌细胞中呈高表达,在正常肝细胞中几乎不表达,并在体外能刺激肝癌细胞株增殖,而对正常肝细胞无影响。本研究通过运用hALR的siRNA和hALR单克隆抗体阻断人肝癌细胞株HepG2表达,探讨hALR对细胞增殖的影响。方法:设计、构建siRNA表达质粒pSIALR-A及其阴性对照质粒pSIALR-B。将构建的pSIALR-A和pSIALR-B分别转染HepG2细胞。荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,以计算转染效率。转染48h后,免疫细胞化学及RT-PCR法检测HepG2细胞中hALR的表达。用3H-TdR掺入法检测hALR的siRNA和特异性单克隆抗体对HepG2细胞增殖的影响。结果:HepG2细胞中有hALR的表达。成功构建了针对hALR基因编码区的siRNA表达质粒pSIALR-A。转染入细胞后发现,pSIALR-A能明显抑制hALR的表达(mRNA的表达量减少83%),而随机序列的siRNA却无此作用。hALR的siRNA在体外能显著抑制人肝癌细胞株HepG2增殖,分别转染质粒pSIALR-A和pSIALR-B后HepG2细胞的cpm值为67687±6548和104807±5713(P<0.05)。抗hALR单克隆抗体特异性地阻断hALR的作用后,可部分抑制肿瘤细胞自主性生长(P<0.05)。结论:HepG2细胞高表达hALR;针对hALR的siRNA能显著、特异性地抑制hALR表达,进而抑制HepG2细胞的生长。抗hALR单克隆抗体也能部分抑制HepG2细胞自主性生长。

关键词：人肝再生增强因子 siRNA 肝肿瘤单克隆抗体 HepG2细胞株细胞增殖

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抗2型登革病毒M蛋白单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定

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免疫学杂志 2009年第3期25卷 349-352,356页

作者：张娟但妍张君蔡雪飞陈婧郑建黄爱龙重庆医科大学附属第二医院病毒性肝炎研究所感染性疾病分子生物学教育部重点实验室重庆医科大学附属第二医院检验科

目的克隆表达2型登革病毒M蛋白,用纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制备可用于胶体金快速检测试条的抗2型登革病毒M蛋白的单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法利用登革热2型病毒全长基因重组质粒,经PCR方法扩增出prm/m基因... 详细信息

目的克隆表达2型登革病毒M蛋白,用纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制备可用于胶体金快速检测试条的抗2型登革病毒M蛋白的单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法利用登革热2型病毒全长基因重组质粒,经PCR方法扩增出prm/m基因片段,在pET-32a(+)表达系统中表达,表达产物用Ni柱亲和层析纯化后,用于免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗M蛋白的mAb,采用间接ELISA方法和Western blot进行mAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA方法鉴定mAb相对亲和力。结果获得2株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞Ⅲ1A6和Ⅲ3D2;相对亲和力均在105以上。Western blot显示2株mAb能特异识别重组M蛋白。结论成功地制备出抗登革病毒2型病毒M蛋白的2株mAb,为建立快速特异检测登革病毒的实验方法提供了有力的工具。

关键词：登革病毒 M蛋白单克隆抗体生物学特性

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qAnti-HBc与慢性乙型肝炎儿童抗病毒疗效的相关性分析及可能免疫机制探索

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中华肝脏病杂志 2021年第9期29卷 837-843页

作者：周英芝常宇南何怡王慧敏彭小蓉陈敏彭明利胡鹏任红许红梅重庆医科大学附属儿童医院感染科国家儿童健康与疾病临床医学研究中心儿童发育疾病研究教育部重点实验室儿童感染免疫重庆市重点实验室400014 重庆医科大学附属第二医院感染科教育部感染性疾病分子生物学重点实验室重庆医科大学病毒性肝炎研究所400010

目的﹑比较行抗病毒治疗的HBeAg阳性慢性乙型肝炎(CHB)患儿无应答组和应答组间基线乙型肝炎核心抗体定量(qAnti-HBc)水平的差异,以探讨不同qAnti-HBc水平患儿外周血CD_(8)^(+)记忆T细胞亚群比例及其功能活性。方法︰回顾性检测2018年6月... 详细信息

目的﹑比较行抗病毒治疗的HBeAg阳性慢性乙型肝炎(CHB)患儿无应答组和应答组间基线乙型肝炎核心抗体定量(qAnti-HBc)水平的差异,以探讨不同qAnti-HBc水平患儿外周血CD_(8)^(+)记忆T细胞亚群比例及其功能活性。方法︰回顾性检测2018年6月至2020年12月于重庆医科大学附属儿童医院感染科就诊的85例HBeAg阳性CHB患儿基线qAnti-HBc水平。分析其中37例抗病毒治疗患儿基线qAnti-HBc水平与HBeAg血清学应答的关系。流式细胞检测59例患儿基线外周血CD_(8)^(+)记忆T细胞亚群比例及干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α分泌水平,分析qAnti-HBc水平与CD_(8)^(+)记忆T细胞亚群比例及其功能活性间的关系。计数资料比较采用Pearson's Chi-square检验,两组或多组间计量资料比较采用Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis检验,连续性变量间的相关性采用Spearman秩相关分析。结果﹐在37例接受恩替卡韦(ETV,21/37)或聚乙二醇干扰素)(Peg-IFN,16/37)治疗的患儿中,有18例发生HBeAg血清学转换(ETV组10/21,Peg-IFN组8/16),应答组患儿基线qAnti-HBc水平[4.71(4.64~4.81)log_(10)IU/ml]显著高于无应答组[4.54(4.45~4.64)log_(10)IU/ml,Z=-3.316,P=0.001]。高qAnti-HBc组CD8^(+)Tem,CD38^(+)CD8^(+)Tem、CD38^(+)CD8^(+)Temra细胞比例及CD8^(+)T细胞分泌的IFN-γ、TNF-α水平显著高于低qAnti-HBc组(P<0.05);ALT>1×正常值上限(ULN)组CD8^(+)Tem、CD38^(+)CD8^(+)Tem,CD38^(+)CD8^(+)Temra细胞比例显著高于ALT≤1×ULN组(P<0.05),但两组CD8T细胞分泌的IFN-γ、TNF-α水平差异无统计学意义(P>0.05)。Spearman相关分析显示,qAnti-HBc与CD8^(+)Tem、CD38^(+)CD8^(+)Tem、CD38^(+)CD8^(+)Temra细胞比例及CD8^(+)T细胞分泌的IFN-γ水平呈正相关(P<0.05),ALT仅与CD38^(+)CD8^(+)Tem、CD38^(+)CD8^(+)Temra细胞比例呈正相关(P<0.05)。结论﹑较高的基线qAnti-HBc水平与CHB儿童患者抗病毒治疗HBeAg血清学应答相关﹔qAnti-HBc较高的CHB患儿外周血效应CD8T细胞表现出更强的表型及功能活化特点,此研究可能对CHB儿童抗病毒治疗疗效相关的潜在免疫机制作出一定阐释。

关键词：慢性乙型肝炎乙型肝炎核心抗体定量 CD8阳性T细胞儿童

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γδT细胞在急性乙型肝炎病毒感染小鼠模型中的变化分析

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中国免疫学杂志 2014年第1期30卷 18-23,29页

作者：常琳王磊彭辉陈敏重庆医科大学病毒性肝炎研究所感染性疾病分子生物学省部共建教育部重点实验室重庆400010 重庆医科大学附属第二医院检验科重庆400010

目的:通过构建急性乙型肝炎病毒(HBV)感染小鼠模型,观察肝脏内γδT细胞的比例、激活表型及细胞因子表达的变化,探讨γδT细胞在HBV急性感染清除机制中的作用。方法:用尾静脉高压水动力法注射HBV基因组1.3倍体真核表达质粒(pcDNA3.1-HBV... 详细信息

目的:通过构建急性乙型肝炎病毒(HBV)感染小鼠模型,观察肝脏内γδT细胞的比例、激活表型及细胞因子表达的变化,探讨γδT细胞在HBV急性感染清除机制中的作用。方法:用尾静脉高压水动力法注射HBV基因组1.3倍体真核表达质粒(pcDNA3.1-HBV1.3)构建急性乙型肝炎病毒感染小鼠模型,用流式细胞仪方法检测pcDNA3.1-HBV1.3质粒模型组(pHBV组)、pcDNA3.1对照质粒组(pcDNA组)在质粒注射后不同时间肝脏、脾脏及外周血中γδT细胞比例的变化,以及pHBV组肝脏中γδT细胞的CD25与CD69激活分子,IFN-γ及TNF-α细胞因子产生的变化,用SPSS统计软件分析各时间点及各组间的差异。结果:pHBV组血清中的HBsAg在第1天即为阳性(33.64±14.88 COI),到第5天上升到最高(146.92±24.23 COI),而后逐渐降低;而血清中的HBeAg在第1天为阳性并达峰值(2.26±2.34 COI),然后降低。而正常对照小鼠(NC)与pcDNA组的外周血中HBV标志物一直为阴性。在pHBV组中,肝脏内的γδT细胞的比例在第1天即升高至(8.3±4.3)%,而后降低,到第10天时,又快速升高至(8.0±1.2)%。统计结果显示,第1天的比例明显高于第5及15天的比例,差异有显著性(P<0.05)。但各时间点脾脏或外周血中的γδT细胞比例未见有明显的变化,差异无显著性(P>0.05)。在pcDNA组中,小鼠肝脏、脾脏或外周血中的γδT细胞比例均未见有显著性的变化发生(P>0.05)。同时pHBV组小鼠肝脏内CD25+γδT细胞比例在第5天升高至最高(8.4±3.7)%,但各时间点间的差异无显著性(P>0.05);而CD69+γδT细胞比例随着时间延长而逐渐降低,第10天的CD69+γδT细胞比例与其他组比较差异有显著性(P<0.05)。pHBV组第1天IFN-γ+γδT细胞比例升高至(8.6±3.2)%,之后即刻降低,与其他组比较,差异无显著性(P>0.05)。结论:急性乙型肝炎病毒感染小鼠模型构建成功,模型中肝脏内γδT细胞的比例、激活表型或细胞因子产生均发生了显著性变化,提示γδT细胞可能参与了急性HBV感染与清除过程。

关键词： γδT细胞乙型肝炎病毒急性感染非特异性免疫

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儿童感染乙型肝炎病毒BCP/PC区基因突变特征及其与基因型的关系

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中华肝脏病杂志 2020年第8期28卷 667-671页

作者：白俊玺邓海军黄勇达州市中心医院检验科 635000 重庆医科大学病毒性肝炎研究所暨感染性疾病分子生物学教育部重点实验室 400016 重庆医科大学附属第二医院检验科 400010

目的分析儿童感染乙型肝炎病毒(HBV)基本核心启动子和前C(BCP/PC)区在不同基因型样本中的突变特征及其临床意义。方法收集2011年至2018年期间就诊的294例儿童和92例成人慢性HBV感染患者,PCR扩增HBV BCP/PC区并直接测序,比对分析该区段... 详细信息

目的分析儿童感染乙型肝炎病毒(HBV)基本核心启动子和前C(BCP/PC)区在不同基因型样本中的突变特征及其临床意义。方法收集2011年至2018年期间就诊的294例儿童和92例成人慢性HBV感染患者,PCR扩增HBV BCP/PC区并直接测序,比对分析该区段基因突变情况。两样本均数比较采用t检验,非参数资料的比较采用Wilcoxon-Mann-Whitney检验,两组资料率的比较采用χ^2检验或Fisher精确检验。结果儿童和成人患者均以B基因型为主,分别占76.9%、71.7%,C基因型分别占23.1%、28.3%。在儿童组,nt 1679、1721、1753、1757、1758、1762、1764、1775、1856及1858十个核苷酸位点在C基因型样本中的突变率显著高于B基因型样本,如G1721A、C1856T和T1858C突变在C基因型样本中的突变率分别为30.9%、16.2%和30.9%,而在B基因型样本中的突变率则分别为0.4%、0、0,P<0.001。在成人组,只有nt 1679、1758、1775三个位点在C基因型样本中的突变率显著高于B基因型样本。这些位点多以联合突变的模式被检出,如T1858C突变共检出21例,其中20例为G1721A/A1775G/T1858C三联突变,10例为G1721A/A1775G/C1856T/T1858C四联突变,且这些联合突变模式仅在儿童C基因型样本中被检出,在儿童B基因型及成人样本中均无检出。进一步分析发现,G1721A/A1775G/T1858C三联突变组患者年龄明显低于无突变组患儿[(4.58±2.53)岁对比(6.53±4.02)岁,P=0.012)],血清HBV DNA滴度明显高于无突变组患儿[(7.57±2.03)log10拷贝/ml对比(6.61±2.11)log10拷贝/ml,P=0.045)]。结论儿童感染HBV BCP/PC区在C基因型样本中的突变频率显著高于B基因型样本;与基因型相关的联合位点突变主要见于C基因型儿童样本,且与较低的患者年龄和较高的HBV DNA滴度相关。

关键词：乙型肝炎病毒基因突变 BCP/PC区儿童

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微滴数字化PCR检测肝癌基因组MSH2基因的一个新的无义突变

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第三军医大学学报 2015年第23期37卷 2368-2372页

作者：潘琦丁克越重庆医科大学附属第二医院感染科重庆医科大学病毒性肝炎研究所

目的探讨微滴数字化PCR(droplet digital PCR,dd PCR)验证原发性肝细胞肝癌患者癌基因组MSH2基因中发生的一个新的无义突变的分析方法。方法对已经通过全外显子组测序鉴定到的一个新的MSH2的体细胞突变进行dd PCR验证;分别对该患者肝... 详细信息

目的探讨微滴数字化PCR(droplet digital PCR,dd PCR)验证原发性肝细胞肝癌患者癌基因组MSH2基因中发生的一个新的无义突变的分析方法。方法对已经通过全外显子组测序鉴定到的一个新的MSH2的体细胞突变进行dd PCR验证;分别对该患者肝细胞肝癌组织和癌旁硬化组织的基因组DNA分析。结果 dd PCR验证了该无义突变(rs63751009,***2:47630358 C>T,c.28 C>T,p.Q10*)只发生在肝癌组织而不存在于癌旁硬化组织中,定量检测发现该无义突变在肝癌组织中的等位基因分数为0.4,与外显子测序的结果类似。结论 dd PCR是一种快速和准确的基因突变分析的新方法,灵敏度和特异性高,在基因突变的分析中具有极大的潜力。

关键词：微滴数字PCR 肝细胞肝癌 MSH2基因无义突变

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人肝再生增强因子对体外单个核细胞PKCα-NF-κB及IL-2的影响

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第三军医大学学报 2009年第21期31卷 2065-2068页

作者：王新国刘杞孙航重庆医科大学第二附属医院感染科病毒性肝炎研究所教育部感染性疾病分子生物学重点实验室重庆400010

目的观察人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration,hALR)对人外周血单个核细胞(periph-eral blood mononuclear cell,PBMC)PKCα-NF-κB及IL-2的影响,探讨hALR免疫抑制机制。方法用梯度离心法分离正常人PBMC,分成正常对照组、刀豆蛋白A(ConA)刺激组(ConA组)和hALR干预组(ConA+hALR组)。ConA组用5μg/mlConA刺激细胞增殖和分泌细胞因子IL-2;ConA+hALR组用30μg/mlhALR对ConA刺激进行干预。于细胞培养0、8、16、32、40h时,用MTT法测定细胞增殖程度,Westonblot检测细胞内信号通路PKCα-NF-κB表达含量,Fluo-3AM装载检测胞内钙离子浓度,用双抗夹心酶联法检测上清细胞因子IL-2含量。结果ConA组细胞增殖逐渐加强,16h时与正常对照组比较具有统计学意义(P<0.05);PKCα、NF-κB表达上调及上清IL-2含量增加趋势一致,在16h达到高峰(P<0.05)。ConA+hALR组细胞没有增殖,PKCα-NF-κB表达及上清IL-2含量最高峰后移至32h。每个时间点各组细胞内Ca2+浓度没有差别。结论hALR可能通过抑制PKCα-NF-κB通路阻碍IL-2的产生速度进而抑制免疫。

关键词：人肝再生增强因子外周血单个核细胞 PKCα-NF-κB IL-2

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利用pSOS系统筛选靶向HBV病毒X基因的siRNA

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生物技术通报 2010年第11期26卷 146-152页

作者：韦德芳高健曾春华彭明利任红重庆医科大学附属第二医院消化科重庆400010 重庆医科大学病毒性肝炎研究所感染性疾病分子生物学教育部重点实验室重庆400010

构建靶向乙肝病毒(HBV)X基因的真核表达载体pSOS-X-siRNA和pSOS-siRNA,转染肝癌细胞系HepG2和HepG2.2.15,筛选和验证高效siRNA。设计4个靶向X基因siRNA,将siRNA和HBx基因插入载体pSOS得重组质粒pSOS-X-siRNA;pSOS-X-siRNA经PacI酶切去除目的片段HBx后得pSOS-siRNA。将质粒pSOS-X-siRNA和pSOS-siRNA分别转HepG2和HepG2.2.15肝癌细胞株。荧光显微镜下观察HepG2细胞绿色荧光(GFP)减弱程度预估干扰效率。ELISA检测HepG2.2.15细胞上清HBsAg、HBeAg表达,Western blotting检测胞内蛋白HBsAg、HBcAg表达,Real time PCR检测胞内HBsmRNA、HBx mRNA的转录。转染4d后,siRNA4使HepG2细胞的GFP信号表达程度最低,为阴性对照的9%,预测其干扰效果最强。siRNA4使HepG2.2.15细胞转染后4d上清的HBsAg蛋白表达为对照的(13.92±1.14)%(P<0.05)、HBeAg为(21.69±4.92)%(P<0.05),胞内的HBsAg、HBcAg蛋白表达量灰度比值为0.175±0.025、0.0825±0.028,均为各处理组中最低(P<0.01),HBs mRNA和HBx mRNA分别降为对照的0.237±0.028(P<0.01)、0.110±0.022(P<0.01),差异有统计学意义,证实siRNA4为高效干扰位点。利用pSOS成功筛选并验证构建靶向HBV X基因的siRNA靶点。

关键词： pSOS 乙肝病毒 X基因 RNA干扰

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重症肝病与全身炎症反应综合征的相关性研究

重症肝病与全身炎症反应综合征的相关性研究

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中华医学会全国第九次感染病学学术会议

作者：刘毅郭树华任红重庆医科大学病毒性肝炎研究所重庆医科大学附属第二医院感染科重庆医科大学病毒性肝炎研究所重庆医科大学附属第二医院感染科重庆医科大学病毒性肝炎研究所重庆医科大学附属第二医院感染科

目的:探讨SIRS／sepsis在重症肝病,尤其是失代偿期肝硬化及慢性重型肝炎病人中的发病情况及其对病情的影响。方法:采用病例对照研究方法,按照SIRS／sepsis诊断标准将重症肝病患者分为SIRS 组和非SIRS组,回顾性分析两组患者主要脏器功能... 详细信息

目的:探讨SIRS／sepsis在重症肝病,尤其是失代偿期肝硬化及慢性重型肝炎病人中的发病情况及其对病情的影响。方法:采用病例对照研究方法,按照SIRS／sepsis诊断标准将重症肝病患者分为SIRS 组和非SIRS组,回顾性分析两组患者主要脏器功能、并发症发生情况以及病情转归的差异。结果:262 例患者中SIRS发生率为58．0％,引起SIRS最常见的原因是感染(71．1％)和消化道出血(19．7％)。两

关键词：重症肝病全身炎症反应综合征相关性研究

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