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EHECO157∶H7志贺样毒素Ⅱ结合亚单位Stx2B的基因克隆、表达与纯化

中华微生物学和免疫学杂志 2006年第2期26卷 155-158页

作者：马颖毛旭虎邹全明易勇程建平曾明张卫军第三军医大学检验系临床微生物学及免疫学教研室暨重庆市生物制药工程技术研究中心重庆400038

目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7志贺样毒素B亚单位(Shiga liketoxin2B,Stx2B),并对其初步纯化。方法设计引物采用PCR法自EHEC O157∶H7基因组扩增志贺样毒素B亚单位的编码基因stx2b,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-22b(+)-s... 详细信息

目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7志贺样毒素B亚单位(Shiga liketoxin2B,Stx2B),并对其初步纯化。方法设计引物采用PCR法自EHEC O157∶H7基因组扩增志贺样毒素B亚单位的编码基因stx2b,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-22b(+)-stx2b,经测序鉴定后转化***21(DE3),IPTG诱导表达,以Tricine-PAGE和Western blot分析目的蛋白的表达,并采用固相镍离子亲和层析纯化重组蛋白。结果扩增的stx2b基因约210bp;原核表达质粒pET-22b(+)-stx2b经酶切和测序鉴定与预期序列一致;并在***21(DE3)中得到高效可溶性表达,蛋白表达率约30%;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约7×103;经固相镍离子亲和层析纯化后,蛋白纯度可达90.1%。结论EHEC O157∶H7志贺样毒素B亚单位的高效表达与初步纯化,有利于进一步的生物学性质研究。

关键词：肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7 志贺样毒素B亚单位(Stx2B) 基因克隆原核表达纯化

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EspA-Stx2A1融合蛋白的表达、纯化及其免疫学活性

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中国生物制品学杂志 2008年第12期21卷 1033-1038页

作者：程琰罗萍张卫军顾江邹全明毛旭虎第三军医大学检验系临床微生物及免疫学教研室暨重庆市生物制药工程技术研究中心重庆400038

目的在原核表达系统中表达肠出血性大肠杆菌O157∶H7(EHECO157∶H7)Ⅲ型分泌蛋白EspA与Stx2毒素A1亚单位(Stx2A1)的融合蛋白,并对表达蛋白进行纯化及免疫学活性检测。方法PCR扩增espA和stx2A1全长基因,利用重叠延伸PCR技术获得espA-stx... 详细信息

目的在原核表达系统中表达肠出血性大肠杆菌O157∶H7(EHECO157∶H7)Ⅲ型分泌蛋白EspA与Stx2毒素A1亚单位(Stx2A1)的融合蛋白,并对表达蛋白进行纯化及免疫学活性检测。方法PCR扩增espA和stx2A1全长基因,利用重叠延伸PCR技术获得espA-stx2A1融合基因,T-A克隆后插入表达载体pET-28a(+),构建原核表达质粒pET-28a(+)-espA-stx2A1,转化大肠杆菌BL21(DE3),分别在37℃和25℃用IPTG诱导表达。以EspA单克隆抗体亲和层析柱纯化目的蛋白,免疫小鼠,检测其免疫原性及抗血清的反应原性,并以天然Stx2毒素攻击,观察保护效果。通过细胞毒试验检测免疫小鼠抗血清的体外中和作用。结果重叠延伸PCR方法扩增出1319bp的融合基因片段,重组表达质粒构建正确;目的蛋白在25℃时的表达量明显高于37℃,约占菌体总蛋白的40%。两种温度下,目的蛋白均主要以包涵体形式存在;纯化后蛋白纯度可达90%。Western blot结果证实,融合蛋白与EspA单克隆抗体和Stx2A1单克隆抗体均发生特异性反应。融合蛋白免疫小鼠制备的抗血清能分别与O157∶H7的EspA、Stx2A发生特异性免疫反应。融合蛋白免疫小鼠能够抵御致死剂量天然Stx2毒素的攻击,保护率达95%。免疫小鼠血清可以中和天然Stx2毒素对HeLa细胞的毒性作用。结论已成功表达了EspA-Stx2A1融合蛋白,纯化的蛋白显示出较好的免疫保护效果,为研制EHECO157∶H7基因工程多亚单位疫苗奠定了基础。

关键词：肠出血性大肠杆菌 O157:H7 EspA Stx2A1 融合蛋白免疫学活性

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靶向性抗肿瘤融合蛋白RGD-hIL-24的构建、表达和体外活性研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2006年第12期26卷 1059-1063页

作者：肖斌杨珺朱永红田文标邹全明第三军医大学医学检验系临床微生物及免疫学教研室重庆市生物制药工程技术研究中心重庆400038

目的构建靶向性抗肿瘤融合蛋白RGD-hIL-24,并对其体外抗肿瘤效应和肿瘤靶向性进行初步研究。方法利用PCR技术将GRGDS序列融合至hIL-24的N端,并将融合基因连接至表达载体pET-22b后,在大肠杆菌BL21(DE3)内进行表达。亲和层析法纯化RGD-hIL... 详细信息

目的构建靶向性抗肿瘤融合蛋白RGD-hIL-24,并对其体外抗肿瘤效应和肿瘤靶向性进行初步研究。方法利用PCR技术将GRGDS序列融合至hIL-24的N端,并将融合基因连接至表达载体pET-22b后,在大肠杆菌BL21(DE3)内进行表达。亲和层析法纯化RGD-hIL-24,复性后采用MTT比色法、荧光染色分析其体外抗肿瘤活性,并通过细胞黏附实验评价其肿瘤靶向性。结果获得RGD-hIL-24基因,序列分析正确。SDS-PAGE和Western blot证明融合基因在大肠杆菌表达相对分子质量(Mr)约为20×103的RGD-hIL-24,占全菌蛋白的26．47％,主要以包涵体形式存在。纯化后的蛋白纯度达90％以上。复性后的RGD-hIL-24能够诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡,显著抑制其生长,并具有肿瘤靶向性。结论大肠杆菌成功表达RGD-hIL-24融合蛋白,体外实验证实RGD-hIL-24具有显著的抗肿瘤活性和肿瘤靶向性,为其在体内抗肿瘤效应和靶向性研究奠定了基础。

关键词： RGD 人IL-24 抗肿瘤活性肿瘤靶向性

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microRNA在胃肠道肿瘤中的研究进展

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中国肿瘤临床 2010年第11期37卷 656-659页

作者：黎伯胜肖斌刘真(综述) 邹全明(审校) 第三军医大学医学检验系临床微生物及免疫学教研室重庆市生物制药工程技术研究中心重庆市400038

microRNA(miRNA)是一段长度约22nt的内源性非编码单链RNA分子,能在转录后水平调控基因的表达。研究证实,miRNA在细胞增殖、发育、分化、凋亡、代谢、信号转导以及肿瘤发生中发挥重要的调节作用。近年来,miRNA已经被证实能够抑制癌基因... 详细信息

microRNA(miRNA)是一段长度约22nt的内源性非编码单链RNA分子,能在转录后水平调控基因的表达。研究证实,miRNA在细胞增殖、发育、分化、凋亡、代谢、信号转导以及肿瘤发生中发挥重要的调节作用。近年来,miRNA已经被证实能够抑制癌基因或抑癌基因的表达,参与了胃肠道肿瘤的发生和发展。本文就miRNA在人胃肠道肿瘤中的作用作一综述。

关键词：微小RNA 胃肠道癌幽门螺杆菌

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幽门螺杆菌尿素酶表位疫苗的构建、表达及鉴定

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中国生物制品学杂志 2007年第3期20卷 157-161页

作者：周维英吴超石云邹全明第三军医大学检验系临床微生物及免疫学教研室暨重庆市生物制药工程技术研究中心重庆400038

目的构建和表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)尿素酶B亚单位(UreB)表位串联体(Uepi)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合蛋白表位疫苗,并对其生物学及免疫学特性进行鉴定。方法设计引物,采用PCR法分别扩增UreB表位多肽编码基... 详细信息

目的构建和表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)尿素酶B亚单位(UreB)表位串联体(Uepi)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合蛋白表位疫苗,并对其生物学及免疫学特性进行鉴定。方法设计引物,采用PCR法分别扩增UreB表位多肽编码基因Uepi和LTB编码基因,重叠延伸PCR法将两段基因拼接,T-A克隆后,构建融合基因表达质粒pET-22b(+)-Uepi-LTB,经酶切鉴定后转化***21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行鉴定。结果PCR扩增出206bp和336bp的目的片段,重叠延伸PCR扩增出524bp的融合目的基因片段。原核表达质粒pET-22b(+)-Uepi-LTB经酶切及测序鉴定,与设计序列一致。重组工程菌pET-22b(+)-Uepi-LTB/BL21经IPTG诱导,目的蛋白表达率约25%,SDS-PAGE分析相对分子质量约20000,目的蛋白以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达96%,Westernblot鉴定该融合蛋白与兔抗LTB多抗血清可发生特异性结合。结论HpUreB表位串联体与LTB融合蛋白的表位疫苗经基因克隆,可获得高效表达,并显示出较好的免疫活性,为新一代Hp疫苗的研制奠定基础。

关键词：幽门螺杆菌尿素酶B亚单位大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位表位疫苗

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幽门螺杆菌双亚单位表位疫苗的构建及免疫原性研究

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中国人兽共患病学报 2008年第1期24卷 33-37,66页

作者：周维英吴超石云邹全明第三军医大学检验系临床微生物及免疫学教研室暨重庆市生物制药工程技术研究中心重庆400038

目的构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)黏附素(HpaA)和尿素酶B亚单位(UreB)双亚基多表位疫苗,并对其免疫原性进行研究。方法设计引物采用PCR法将黏附素(HpaA)的一个B细胞表位与尿素酶B亚单位的三个TH表位及一个B细胞表位串联起来(... 详细信息

目的构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)黏附素(HpaA)和尿素酶B亚单位(UreB)双亚基多表位疫苗,并对其免疫原性进行研究。方法设计引物采用PCR法将黏附素(HpaA)的一个B细胞表位与尿素酶B亚单位的三个TH表位及一个B细胞表位串联起来(HUepi),表位之间用两个赖氨酸(KK)间隔,T-A克隆后构建融合基因表达质粒pET-22b(+)-HUepi,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,重组蛋白采用阳离子和疏水层析进行纯化,经鉴定后皮下免疫BALB/c小鼠,检测细胞免疫应答及体液免疫应答。结果PCR法扩增出了约233bp的目的片段;原核表达质粒pET-22b(+)-HUepi经酶切及测序鉴定,目的基因序列与设计序列一致;重组蛋白HUepi表达率约20.0%,PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约8.38×103Dr,破菌后电泳证实目的蛋白以可溶形式表达,纯化后蛋白纯度大于97.6%,经N端测序证实为设计的表位疫苗蛋白,TH表位多肽、表位疫苗蛋白及rUreB均能够刺激表位疫苗致敏的小鼠淋巴细胞增殖(SI>2),并且此疫苗能够刺激机体产生特异性抗体。结论Hp HpaA、UreB双亚基表位疫苗HUepi经基因克隆获得了较高的表达量,并初步显示了较好的免疫原性。为新一代Hp疫苗的研制奠定实验基础。

关键词：幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp) 粘附素(HpaA) 尿素酶B亚单位(UreB) 表位疫苗

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原核融合表达载体的设计、构建及应用

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免疫学杂志 2008年第6期24卷 618-624页

作者：程琰毛旭虎王庆旭余抒刘艳青张晓丽宁亚蕾邹全明第三军医大学检验系临床微生物学及免疫学教研室暨重庆市生物制药工程技术研究中心重庆400038

目的利用EspA(肠出血性大肠杆菌O157:H7Ⅲ型分泌蛋白A)作为融合伴体分子,构建一种高效原核融合表达载体。方法在EspA的羧基端设计一Linker,包括柔韧区,肠激酶酶切位点和多克隆位点。PCR分别扩增EspA、Linker基因,利用重叠延伸PCR技术获... 详细信息

目的利用EspA(肠出血性大肠杆菌O157:H7Ⅲ型分泌蛋白A)作为融合伴体分子,构建一种高效原核融合表达载体。方法在EspA的羧基端设计一Linker,包括柔韧区,肠激酶酶切位点和多克隆位点。PCR分别扩增EspA、Linker基因,利用重叠延伸PCR技术获得二者融合基因,T-A克隆后插入表达载体pET-28a(+),构建高效原核表达载体-pEspA。分别将IL-24、GFP等六种基因克隆入pEspA,转化*** BL21(DE3),IPTG诱导融合蛋白表达,SDS-PAGE检测融合蛋白。以EspA单克隆抗体亲和层析柱纯化融合蛋白,融合蛋白经肠激酶酶切后再通过Ni2+亲和层析柱获得外源蛋白。分别利用MTT法和紫外光激发实验鉴定IL-24、GFP生物学活性。结果构建的表达载体pEspA可高效表达外源目的蛋白,使本身不表达或表达量低的目的蛋白获得高效表达。先以EspA单克隆抗体亲和层析一步纯化获得高纯度的融合蛋白,融合蛋白经肠激酶酶切后再以Ni2+亲和层析柱获得了外源蛋白,同时生物学活性实验显示纯化的IL-24、GFP具有较好的生物学活性。结论成功构建了基于EspA的新型高效原核融合表达载体,为蛋白的融合表达及纯化又提供了一种可供选择的工具。

关键词： EspA 融合表达载体肠出血性大肠杆菌O157:H7

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miR-25在人胃癌组织中的表达分析及其靶基因TOB1的鉴定

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中国肿瘤临床 2013年第9期40卷 529-533页

作者：黎伯胜左钱飞肖斌邹全明郭刚第三军医大学医学检验系临床微生物学及免疫学教研室国家免疫生物制品工程技术研究中心重庆市生物制药工程技术研究中心重庆市400038

目的:分析miR-25在胃癌组织中的表达水平并鉴定其新的靶基因。方法:选取10例胃癌患者的胃癌及癌旁正常组织样本,用qRT-PCR法检测miR-25的表达水平。利用miRNA靶基因预测数据库预测miR-25的靶基因。构建荧光素酶载体(pMIR-TOB1)及绿色荧... 详细信息

目的:分析miR-25在胃癌组织中的表达水平并鉴定其新的靶基因。方法:选取10例胃癌患者的胃癌及癌旁正常组织样本,用qRT-PCR法检测miR-25的表达水平。利用miRNA靶基因预测数据库预测miR-25的靶基因。构建荧光素酶载体(pMIR-TOB1)及绿色荧光蛋白报告载体(pMIR-GFP-TOB1)(含有miR-25结合位点的TOB1的3'UTR片段),利用荧光素酶活性实验和GFP荧光强度报告实验鉴定miR-25的预测靶基因(TOB1)。qRT-PCR法和Western blot法分别检测TOB1的mRNA和蛋白质的表达水平。结果:miR-25在80%(8/10)的胃癌组织样本中表达上调。miR-25模拟物显著抑制了荧光素酶的活性(P<0.01)和GFP荧光强度。miR-25模拟物显著下调了AGS细胞中TOB1的mRNA(P<0.05)和蛋白质的表达。结论:miR-25在人胃癌组织中表达上调,miR-25能结合TOB1的3'UTR并下调TOB1的mRNA和蛋白质的表达。

关键词： miR-25 TOB1 胃癌

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百日咳毒素S1亚单位突变体在大肠杆菌中的表达及纯化

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中国生物制品学杂志 2007年第4期20卷 264-266,270页

作者：张晓丽邹全明章金勇张卫军第三军医大学医学检验系临床微生物及免疫学教研室暨重庆市生物制药工程技术研究中心重庆400038

目的克隆百日咳毒素S1亚单位,获得其突变体(S1/9K-129G,rS1),构建原核表达系统,并鉴定融合蛋白的特异性。方法采用PCR和重叠延伸扩增得到突变体,将其与pMD18-T连接,转化至大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性重组克隆载体pMD18-T-rS1,经双酶切得... 详细信息

目的克隆百日咳毒素S1亚单位,获得其突变体(S1/9K-129G,rS1),构建原核表达系统,并鉴定融合蛋白的特异性。方法采用PCR和重叠延伸扩增得到突变体,将其与pMD18-T连接,转化至大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性重组克隆载体pMD18-T-rS1,经双酶切得到rS1活性结构域编码片段。将其插入pQE-30载体中,转化大肠杆菌M15株,经IPTG诱导表达。表达产物经镍离子柱纯化,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果PCR及重叠延伸获得了约700bp的目的基因片段,并获得阳性重组表达载体克隆,表达产物为相对分子质量27000左右的蛋白,Western blot检测能与兔抗百日咳毒素多价抗血清发生反应。结论成功表达并纯化了百日咳毒素S1亚单位突变体,为研制百日咳疫苗候补抗原的相关分子免疫学研究奠定了基础。

关键词：百日咳毒素 S1亚单位突变体原核表达

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鼠源性抗EHEC O157:H7 Stx2噬菌体Fab抗体库的构建及筛选

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中国生物制品学杂志 2009年第2期22卷 111-114,123页

作者：刘璐曾浩罗萍吴剑张卫军毛旭虎邹全明第三军医大学医学检验系临床微生物及免疫学教研室暨重庆市生物制药工程技术研究中心重庆400038

目的构建鼠源性抗EHEC O157∶H7 Stx2噬菌体Fab抗体库,并从中筛选特异性的抗体。方法用EHEC O157∶H7 Stx2类毒素免疫BALB/c小鼠,取脾分离淋巴细胞,提取总RNA,RT-PCR分别扩增抗体轻、重链(к和Fd)基因,经双酶切依次克隆入噬粒载体pComb3... 详细信息

目的构建鼠源性抗EHEC O157∶H7 Stx2噬菌体Fab抗体库,并从中筛选特异性的抗体。方法用EHEC O157∶H7 Stx2类毒素免疫BALB/c小鼠,取脾分离淋巴细胞,提取总RNA,RT-PCR分别扩增抗体轻、重链(к和Fd)基因,经双酶切依次克隆入噬粒载体pComb3X中,电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体M13K07进行超感染,构建抗EHEC O157∶H7 Stx2的Fab噬菌体抗体库。以纯化的Stx2为抗原进行筛选,获得抗EHECO157∶H7Stx2的特异性Fab抗体,Western blot法检测噬菌体抗体与毒素抗原的结合活性,并对所得阳性克隆进行基因序列分析。结果构建了一个库容为1.56×107的Fab抗体库,筛选出3株特异性较强的阳性克隆,其中2个可与Stx2A1亚单位抗原反应,1个可与Stx2B亚单位抗原反应。基因序列分析显示,轻、重链可变区氨基酸序列与GenBank中已注册的鼠免疫球蛋白可变区氨基酸序列同源性分别为98.5%和99.6%。结论已成功构建了鼠源性抗EHEC O157∶H7 Stx2噬菌体Fab抗体库,为进一步制备抗EHECO157∶H7Stx2的治疗性人源化抗体奠定了基础。

关键词： EHEC O157:H7 Stx2亚单位噬菌体 Fab抗体库

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