目的对登革病毒-2(DENV-2)感染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的差异磷酸化蛋白质进行分析以及初步探究DENV-2感染的可能致病机制。方法实验设置DENV-2感染HUVEC组和HUVEC空白对照组,每组3个重复。收集细胞沉淀后,利用SDT裂解法获取蛋白质,通过串联质谱标签(TMT)法对磷酸化蛋白质进行定性与定量分析,对鉴定到的差异磷酸化蛋白质进行氨基酸保守基序分析、亚细胞定位分析、蛋白质结构域分析、GO富集分析、KEGG通路分析和蛋白质互作(PPI)等生物信息学分析。利用Western blot检测JUN、MAP2K2和AKT1磷酸化蛋白的表达。结果共检测到1385个差异蛋白质上的2918个修饰肽段,其中有1346个修饰肽段显著上调(FC>1.2,P<0.05),1572个修饰肽段显著下调(FC<0.83,P<0.05)。氨基酸保守基序分析共获得49个磷酸化保守基序。蛋白质结构域分析中富集到的差异磷酸化肽段最多是RNA识别基序、蛋白激酶结构域和PH结构域。通过亚细胞定位分析发现差异的修饰肽段主要定位在细胞核和细胞质中。GO富集和KEGG通路分析结果显示差异肽段主要在刺激反应的调节、含核碱基的小分子生物合成过程、吞噬体和白细胞跨内皮迁移处富集。对上调和下调的差异磷酸化蛋白分别进行蛋白质互作—KEGG联合分析,结果发现上调和下调的差异磷酸化蛋白质共富集到15条通路,且通过Western Blot检测与自噬途径相关的3个差异磷酸化蛋白质即JUN、MAP2K2和AKT1的表达,结果显示DENV-2组与空白组相比,p-JUN表达显著下调(1.48±0.01 vs 1.23±0.01,P<0.0001);p-AKT1表达显著上调(0.87±0.02 vs 1.01±0.01,P<0.001);p-MAP2K2表达显著上调(1.10±0.02 vs 1.29±0.05,P<0.01)。结论DENV-2感染HUVEC存在较多差异表达蛋白,p-JUN的下调、p-MAP2K2和pAKT1的上调提示3个能够调节自噬的磷酸化蛋白可能与DENV-2感染机制有关。
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