检索结果-内蒙古大学图书馆

中国普外基础与临床杂志 2008年第12期15卷 898-902,909页

作者：李明皓吴小兵严律南宁夏医学院附属医院肝胆外科银川750004 中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室北京100052 四川大学华西医院普外科成都610041

目的改良法构建携带金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)基因的Ⅱ型重组腺相关病毒(rAAV2)。方法采用PCR法从pDNR-LIB质粒中扩增人全长TIMP1基因,利用基因重组的方法将TIMP1全长cDNA插入通用型AAV2载体质粒pSNAV的多克隆位点,构建成pSNAV-TIMP1;... 详细信息

目的改良法构建携带金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)基因的Ⅱ型重组腺相关病毒(rAAV2)。方法采用PCR法从pDNR-LIB质粒中扩增人全长TIMP1基因,利用基因重组的方法将TIMP1全长cDNA插入通用型AAV2载体质粒pSNAV的多克隆位点,构建成pSNAV-TIMP1;用脂质体转染的方法将重组质粒转入BHK-21细胞中,G418细胞筛选得到转入重组质粒并能表达目的基因的细胞系BHK-21/rAAV2-TIMP1;用具有rAAV2包装功能的重组Ⅰ型单纯疱疹病毒(rHSV1-rc/△UL2)感染BHK-21/rAAV2-TIMP1,纯化后得到rAAV2-TIMP1。结果用改良法成功构建rAAV2-TIMP1,病毒滴度达到1×1012v.g./ml。结论成功构建rAAV2-TIMP1,为其进一步应用于基因治疗的研究提供实验基础。

关键词： Ⅱ型重组腺相关病毒金属蛋白酶抑制剂1 肝细胞癌基因治疗

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携带血红素加氧酶1基因的重组腺相关病毒的制备

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武汉大学学报（医学版） 2007年第4期28卷 409-412,425页

作者：何祥虎王焱林王成夭吴小兵代乐李娜武汉大学中南医院麻醉科湖北武汉430071 中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室北京100052

目的:制备携带大鼠血红素加氧酶1(rHO-1)基因的重组腺相关病毒(AAV)。方法:通过RT-PCR的方法,从大鼠脾脏组织中扩增rHO-1基因,克隆入通用型AAV载体质粒pSNAV中构建重组质粒pSNAV-rHO-1,通过酶切和测序鉴定。利用Lipofectamine将pSNAV-rH... 详细信息

目的:制备携带大鼠血红素加氧酶1(rHO-1)基因的重组腺相关病毒(AAV)。方法:通过RT-PCR的方法,从大鼠脾脏组织中扩增rHO-1基因,克隆入通用型AAV载体质粒pSNAV中构建重组质粒pSNAV-rHO-1,通过酶切和测序鉴定。利用Lipofectamine将pSNAV-rHO-1转染BHK-21细胞,G418筛选得到表达外源基因的细胞系BHK/rHO-1。用具有能表达Rap和Cap及包装重组AAV功能的一种重组单纯疱疹病毒HSV1-rc/△UL2分别感染这株细胞系后收获并纯化病毒,DNA斑点杂交检测重组病毒滴度。结果:扩增了rHO-1基因,测序证实与GenBank中的一致,病毒滴度为1.5×1015v.g/L。结论:成功获得了高滴度、高纯度的重组AAV-rHO-1,这为以后心血管系统疾病的基因治疗研究奠定了基础。

关键词：血红素加氧酶1 腺相关病毒斑点杂交

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改良法构建二型重组腺相关病毒介导人TMP1基因构建及鉴定

改良法构建二型重组腺相关病毒介导人TMP1基因构建及鉴定

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中国医师协会外科医师分会成立大会暨第十二届全国普通外科学术会议

作者：李明皓严律南王树人吴小兵宁夏医学院附属医院肝胆外科，银川750004 四川大学华西医学中心，成都 610041 中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室，北京 100052

目的：改良法构建二型重组腺相关病毒(rAAV2)介导的金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)构建及鉴定。方法：采用PCR法从pDNR-LIB质粒种扩增人全长TIMP1基因，利用基因重组的方法将全长TIMP1插入表达质粒pSNAV的多克隆位点，构建成pSNAV-TIMP1... 详细信息

目的：改良法构建二型重组腺相关病毒(rAAV2)介导的金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)构建及鉴定。方法：采用PCR法从pDNR-LIB质粒种扩增人全长TIMP1基因，利用基因重组的方法将全长TIMP1插入表达质粒pSNAV的多克隆位点，构建成pSNAV-TIMP1;用脂质体转染的方法将重组的质粒转入BHK-21细胞中，G418筛选得到转入重组质粒并能表达目的基因的细胞系BHK-TIMP1;用具有rAAV2包装功能的1型单纯疱疹病毒(HSV1-rc/△UL2)感染BHK-TIMP1，纯化后得到rAAV2-TIMP1;采用“一种病毒感染一种载体细胞株”，用“感染”的方式代替传统的“转染”方式，使每个细胞产生的rAAV2-TIMP1比传统方式提高了2个数量级以上。结果：用改良法成功rAAV2-TIMP1，用PCR检测到目的基因TIMP1，病毒滴度达到1×1012v．g/ml。结论：构建的rAAV2-TIMP1可望能有效地将TIMP1基因导入人肝癌细胞株，为进一步研究肝癌浸润和转移机理以及探讨抑制肝癌浸润和转移的方法提供实验基础。

关键词：重组腺病毒基因重组脂质体转染肝癌肿瘤转移机理

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乙型肝炎表面抗原基因重组2型腺相关病毒的免疫原性研究

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中国热带医学 2005年第5期5卷 932-934页

作者：欧程山胡贵方陈清吴小兵俞守义南方医科大学公共卫生和热带医学学院广东广州510515 中国预防医学科学院病毒学研究所基因工程国家重点实验室北京100052

目的观察含乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因的2型重组腺相关病毒(rAAV-2-HBsAg)在Balb/c小鼠体内的免疫原性。方法以5×1011的重组病毒颗粒单次注射Balb/c小鼠,RT-PCR扩增肝脏组织中HBsAg基因cD-NA:ELISA检测肝组织中HBsAg的表达;RIA... 详细信息

目的观察含乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因的2型重组腺相关病毒(rAAV-2-HBsAg)在Balb/c小鼠体内的免疫原性。方法以5×1011的重组病毒颗粒单次注射Balb/c小鼠,RT-PCR扩增肝脏组织中HBsAg基因cD-NA:ELISA检测肝组织中HBsAg的表达;RIA法检测血清中表面抗体(抗一HBs)滴度;51Cr释放分析检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。结果外源性HBsAg基因己整合到肝细胞染色体DNA并有效地转录和翻译,表达水平最高可达33.8pg/(mglivertissue),rAAV-HBsAg免疫小鼠后可以诱导机体产生表面抗体并激发特异性CTL。结论外源性HBsAg基因可以转移到小鼠肝细胞并稳定表达;rAAV-2-HBsAg免疫小鼠可以同时诱导体液和细胞免疫反应的出现。提示基于rAAV-2载体的乙型肝炎(HBV)疫苗,对于防止HBV感染,尤其是作为慢性乙型肝炎的治疗性疫苗可能只有潜在的应用价值,值得做进一步的系统研究。

关键词：乙型肝炎表面抗原,基因表达 2型重组腺相关病毒,细胞毒性T淋巴细胞活性

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rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-GM-CSF共感染增强人外周血单核细胞来源树突状细胞免疫刺激功能

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第三军医大学学报 2004年第1期26卷 22-24页

作者：胡贵方俞守义吴小兵尹芳陈清候云德第一军医大学流行病学教研室广州510515 中国预防医学科学院病毒学研究所基因工程国家重点实验室北京100052 第一军医大学南方医院血液科广州510515

目的　探讨rAAV 2 HBsAg(表达乙肝表面抗原的重组腺相关病毒 )和rAAV 2 GM CSF(表达粒细胞 /巨嗜细胞-集落刺激因子的重组腺相关病毒 )共感染对人外周血单核细胞来源树突状细胞 (DC)免疫刺激功能的影响。方法　用rAAV 2 HBsAg和rAAV ... 详细信息

目的　探讨rAAV 2 HBsAg(表达乙肝表面抗原的重组腺相关病毒 )和rAAV 2 GM CSF(表达粒细胞 /巨嗜细胞-集落刺激因子的重组腺相关病毒 )共感染对人外周血单核细胞来源树突状细胞 (DC)免疫刺激功能的影响。方法　用rAAV 2 HBsAg和rAAV 2 GM CSF同时感染新分离的树突状细胞 ;CytoTox 96 Non RadioactiveCtoxicityAssay试剂盒检测细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)反应 ;混合白细胞反应 (MLR)检测DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力 ;流式细胞仪检测DC表面分子CD80、CD83、CD86和HLA DR。结果　rAAV 2 HBsAg和rAAV 2 CM CSF共感染的DC刺激同种异体淋巴细胞增值的能力和激发的自身淋巴细胞的CTL效应增强 ,CD83表达水平提高。结论　内源性表达的GM CSF能促进DC成熟。

关键词：重组腺相关病毒,Ⅱ型肝炎表面抗原,乙型粒细胞/巨嗜细胞-集落刺激因子树突状细胞免疫治疗

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我国虫媒病毒研究10年回顾

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中国公共卫生 2003年第4期19卷 473-476页

作者：王环宇梁国栋中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室北京100052

虫媒病毒(Arbovirus)是通过吸血的节肢动物叮咬敏感的脊椎动物,使脊椎动物发病从而传播疾病的一类病毒.其特点是病毒在节肢动物体内繁殖,但是动物自身却不发病.虫媒病毒性疾病大多数是自然疫源性疾病,由于节肢动物叮咬人、畜引起疾病,... 详细信息

虫媒病毒(Arbovirus)是通过吸血的节肢动物叮咬敏感的脊椎动物,使脊椎动物发病从而传播疾病的一类病毒.其特点是病毒在节肢动物体内繁殖,但是动物自身却不发病.虫媒病毒性疾病大多数是自然疫源性疾病,由于节肢动物叮咬人、畜引起疾病,因此虫媒病毒属于人畜共患病毒.

关键词：虫媒病毒研究人畜共患病毒分类生物学特性

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腺相关病毒介导的小鼠IX因子在血友病B小鼠体内表达研究

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中国科学（C辑） 2003年第2期33卷 175-181页

作者：陈立陈浩明陆华中吴小兵卢大儒邱信芳薛京伦复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室上海200433 中国预防医学科学院病毒学研究所分子病毒学与病毒基因工程国家重点实验室北京100052

通过重组HSV/AAV辅助病毒方法制备出高滴度(>10^(12))的重组AAV/mFⅨ病毒颗粒,并注射到血友病B小鼠的后肢骨骼肌中,获得了稳定的高水平小鼠Ⅸ因子表达(>370ng/mL),持续时间超过350d。治疗组小鼠体内的Ⅸ因子活性达到正常值的30％... 详细信息

通过重组HSV/AAV辅助病毒方法制备出高滴度(>10^(12))的重组AAV/mFⅨ病毒颗粒,并注射到血友病B小鼠的后肢骨骼肌中,获得了稳定的高水平小鼠Ⅸ因子表达(>370ng/mL),持续时间超过350d。治疗组小鼠体内的Ⅸ因子活性达到正常值的30％,而且出血症状得到显著改善。在小鼠血浆中未发现抗Ⅸ因子的中和抗体,第1次注射后抗AAV抗体的水平也非常低。重复注射AAV/mFⅨ病毒后,不同剂量组的小鼠体内的抗AAV抗体出现了不同的结果。组织分析结果证实了血浆中有功能的FⅨ因子确实来源于骨骼肌。以上结果显示,AAV介导的基因转移是血友病B基因治疗的极有前途的方法。

关键词：血友病B 基因治疗腺相关病毒小鼠 Ⅸ因子基因表达抗体单纯疱疹病毒

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CT引导脑内植入携带人类酪氨酸羟化酶基因腺相关病毒载体治疗实验性帕金森病猴

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中华放射学杂志 2003年第11期37卷 1029-1035页

作者：王维毛俊于小平刘晟胡维新曾赵军蔡维军吴小兵中南大学湘雅第三医院放射科长沙410013 中南大学湘雅医学院中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室

目的　观察CT引导脑内注射人类酪氨酸羟化酶基因腺相关病毒载体 (AAV hTH)对神经细胞的转染能力 ,以及对帕金森病 (PD)猴的治疗效应。方法　经右侧颈内动脉注射 1 甲基 4 苯基 1,2 ,3,6 四氢吡啶 (MPTP)制作 6只偏侧帕金森病恒河猴模... 详细信息

目的　观察CT引导脑内注射人类酪氨酸羟化酶基因腺相关病毒载体 (AAV hTH)对神经细胞的转染能力 ,以及对帕金森病 (PD)猴的治疗效应。方法　经右侧颈内动脉注射 1 甲基 4 苯基 1,2 ,3,6 四氢吡啶 (MPTP)制作 6只偏侧帕金森病恒河猴模型 ,经CT引导将AAV hTH注入 5只帕金森病猴右侧尾状核内 ,观测猴模型的行为学改变 6个月以上 ,以高效液相色谱法 (HLPC)测定转染后尾状核内多巴胺 (DA)及其代谢产物含量 ,并以免疫组化检测法及逆转录聚合酶链式反应 (RT PCR)方法检测酪氨酸羟化酶 (TH)基因的表达情况。结果　CT引导定位穿刺有实时操作、定位精确、微创的优点。所有注射AAV hTH的偏侧PD猴模型术后 2周即有帕金森病症状改善 ,持续 6个月以上 ,其中 1只动物阿朴吗啡旋转实验示完全停止了帕金森病旋转现象 ,其余动物旋转次数较术前减少约4 2 %～ 70 %。实验侧与健侧尾状核区多巴胺及其代谢产物含量比值较未治疗模型增高。免疫组化染色见穿刺针道部位有大量TH阳性细胞 ;RT PCR检测到实验侧尾状核区有TH mRNA存在 ;而对照侧尾状核区、其他部位脑组织与心、肝、肾组织及未注射模型实验侧尾状核区均未见阳性发现。结论　CT引导立体定向穿刺PD猴尾状核注入AAV hTH能使TH基因精确地在特定部位有效表达。

关键词：尾状核 CT引导帕金森病 PD 酪氨酸羟化酶脑内治疗模型实时旋转

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HSV/AAV嵌合病毒法制备rAAV/hFⅨ及其安全性检测

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科学通报 2003年第10期48卷 1054-1058页

作者：陈立邹蓓艳陈浩明伍志坚吴小兵卢大儒薛京伦基因工程国家重点实验室复旦大学生命科学院遗传学研究所上海200433 中国预防医学科学院病毒学研究所北京100052

构建了由CMV启动子调控的人凝血因子Ⅸ小基因的重组腺相关病毒载体, 并通过HSV/AAV杂合辅助病毒的方法大量制备成重组腺相关病毒颗粒(rAAV/hFⅨ). 经Southern dot blot及QC-PCR法测定, 滴度达到3.6 × 1012 vg(病毒基因组)/mL. 将rA... 详细信息

构建了由CMV启动子调控的人凝血因子Ⅸ小基因的重组腺相关病毒载体, 并通过HSV/AAV杂合辅助病毒的方法大量制备成重组腺相关病毒颗粒(rAAV/hFⅨ). 经Southern dot blot及QC-PCR法测定, 滴度达到3.6 × 1012 vg(病毒基因组)/mL. 将rAAV/hFⅨ病毒以7.5 × 1011 vg/只直接注射到血友病B小鼠股四头肌中, 检测到人Ⅸ因子最高表达量达到387 ng/mL血浆, 持续表达时间12周. 血浆中产生的抗体情况与表达曲线相吻合. 实验结果表明, 采用HSV/AAV杂合辅助病毒法能够有效解决AAV载体的大量制备问题, QC-PCR法检测重组腺相关病毒的滴度比传统的点杂交法更加快速准确. RT-PCR检测表明重组AAV中没有野生型HSV的污染, PCR检测表明重组AAV注射后, 重组AAV病毒仅存在于注射点附近的肌肉中, 未见扩散.

关键词：重组腺相关病毒载体凝血因子 IX小基因杂合病毒 HSV/AAV嵌合病毒法血友病B QC-PCR

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阳离子脂质体联合转铁蛋白介导肝癌组织特异性载体在人肝癌细胞株中的表达

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天津医药 2003年第8期31卷 483-485页

作者：程香普段芳龄张智清陈庆华马军冯常炜唐芙爱赵治国李振峰郑州大学第二附属医院消化内科 450003 中国预防医学科学院病毒学研究所基因工程国家重点实验室

目的 :研究阳离子脂质体联合转铁蛋白(transferrin,Tf)介导甲胎蛋白 (AFP)启动子/增强子载体对分泌AFP的人肝癌细胞株的双重靶向作用。方法:测定比较阳离子脂质体Lipofectin、Lipofectin联合含双铁的人转铁蛋白[HTf(Fe)2]介导质粒 pDR2... 详细信息

目的 :研究阳离子脂质体联合转铁蛋白(transferrin,Tf)介导甲胎蛋白 (AFP)启动子/增强子载体对分泌AFP的人肝癌细胞株的双重靶向作用。方法:测定比较阳离子脂质体Lipofectin、Lipofectin联合含双铁的人转铁蛋白[HTf(Fe)2]介导质粒 pDR2luc、pEBAFluc转染分泌AFP的人肝癌细胞株 (HepG2)、不分泌AFP的人肝癌细胞株 (SMMC7721)、人肾癌细胞株 (GRC)及非洲绿猴肾细胞 (COS7)的转染效率 ,转染效率以液体闪烁计数仪单光子计数法测定荧光素酶活性估计。结果 :(1)除COS7 外 ,其余3株细胞以Lipofectin +HTf(Fe)2介导pDR2luc的转染效率均比单用Lipofectin的转染效率高 (均P<0.01)。(2)以Lipofectin介导 pEBAFluc转染4株细胞 ,荧光素酶活性仅在能分泌AFP的HepG2 中表达。 (3)比较Lipofectin、Lipofectin +HTf(Fe) 2 介导 pEBAFluc转染HepG2 的效率 ,后者较前者高8倍多 (P<0.01)。结论 :Lipofectin +HTf(Fe)

关键词：原发性肝癌阳离子脂质体转铁蛋白甲胎蛋白特异性载体基因治疗

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