检索结果-内蒙古大学图书馆

生物工程学报 2001年第4期17卷 388-391页

作者：曾革非张立国张智清中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室北京100052

新生血管大量形成在实体瘤的生长和转移中起着关键的作用。血管内皮生长因子 (VEGF)是介导肿瘤血管生成的最主要因素。从原代培养的人脐静脉血管内皮细胞 (HUVEC)提取细胞总RNA ,采用逆转录PCR(RT PCR)方法得到VEGF受体KDR胞外区cDNA片... 详细信息

新生血管大量形成在实体瘤的生长和转移中起着关键的作用。血管内皮生长因子 (VEGF)是介导肿瘤血管生成的最主要因素。从原代培养的人脐静脉血管内皮细胞 (HUVEC)提取细胞总RNA ,采用逆转录PCR(RT PCR)方法得到VEGF受体KDR胞外区cDNA片段。将获得的受体基因克隆到AAV基因治疗载体pSNAV中 ,得到重组质粒pSNAV KDR。重组质粒转染BHK细胞 ,加入辅助病毒后 ,获得了表达目的蛋白的重组AAV。重组病毒表达的KDR在体外实验中具有与VEGF结合的活性。在体内实验中 ,重组AAV感染的黑色素瘤细胞在小鼠中形成肿瘤的血管化程度明显低于对照组。

关键词：血管内皮生长因子受体腺病毒伴随病毒病毒载体介导基因表达

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一种高效的重组腺伴随病毒载体生产系统

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中国科学（C辑） 2001年第5期31卷 423-430页

作者：伍志坚吴小兵曹晖董小岩王宏侯云德中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室北京100052

重组腺伴随病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)载体是目前较理想的基因治疗载体之一, 但难以大规模制备一直是影响其广泛应用的主要因素. 曾组建了一种表达2型腺伴随病毒 (adeno-associated virus type 2, AAV-2) Rep和Ca... 详细信息

重组腺伴随病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)载体是目前较理想的基因治疗载体之一, 但难以大规模制备一直是影响其广泛应用的主要因素. 曾组建了一种表达2型腺伴随病毒 (adeno-associated virus type 2, AAV-2) Rep和Cap的重组1型单纯疱疹病毒HSV1-rc/DUL2, 现在此基础上, 证实了该重组病毒支持rAAV的复制与包装, 包装出的rAAV具有感染性; 构建了携带新霉素抗性基因、适合多种外源基因插入的通用型rAAV载体质粒pSNAV-2 及表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的rAAV载体质粒pSNAV-2-GFP, 建立了稳定携带GFP基因表达盒的rAAV载体细胞株; 确定了HSV1-rc/DUL2感染载体细胞株时的最佳感染复数(multiplicity of infection, MOI)为0.1; 采用"一种病毒感染一个载体细胞株"的策略, 用"感染"的方式代替传统的"转染"方式, 使每个细胞产生的rAAV比传统方式提高了2个数量级以上, 并实现了rAAV的规模化制备, 为rAAV用于基因治疗的临床试验打下了基础.

关键词：重组腺伴随病毒重组1型单纯疱疹病毒载体基因治疗生产系统绿色荧光蛋白转染方式

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流感病毒中和性基因工程Fab抗体的研制

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中华实验和临床病毒学杂志 2001年第2期15卷 182-185页

作者：杨贵宾韩峰梁米芳吴淑华王艳侯云德中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室北京100052 中国预防医学科学院病毒学研究所出血热研究室北京100052

目的　获得基因工程抗流感病毒抗体 ,为检测其粘膜用药在动物模型中的抗病毒效果奠定基础。方法　从酶联免疫吸附试验阳性的人外周血中分离淋巴细胞 ,提取总RNA ,Oligo dT逆转录cDNA ,聚合酶链反应扩增人IgG轻、重链基因 ,利用pComb3载... 详细信息

目的　获得基因工程抗流感病毒抗体 ,为检测其粘膜用药在动物模型中的抗病毒效果奠定基础。方法　从酶联免疫吸附试验阳性的人外周血中分离淋巴细胞 ,提取总RNA ,Oligo dT逆转录cDNA ,聚合酶链反应扩增人IgG轻、重链基因 ,利用pComb3载体构建噬菌体抗体库。用纯化的流感病毒A Sydeny 5 97(H3N2 )为固相抗原筛选抗体Fab段 ,并在大肠埃希菌中进行分泌性表达。通过血凝抑制实验、免疫荧光实验和病毒中和实验选择具有中和作用的Fab抗体。结果　分离到两株Fab克隆 ,IV 2和IV 6 ,流感病毒抗原和抗Fab抗体直接ELISA检测阳性 ,间接免疫荧光实验呈阳性。它们都具有血凝抑制作用 ,病毒中和实验显示能使病毒滴度下降 30倍和 2 0倍。结论　获得了两株具有病毒中和活性的人源抗流感病毒悉尼株的Fab段抗体 ,为进一步的表达纯化及粘膜给药研究其抗病毒效果提供材料。

关键词：正粘病毒科 Fab免疫球蛋白类单克隆抗体重组蛋白质类研制

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酵母双杂交系统用于TPO分子间相互作用的研究

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中华实验和临床病毒学杂志 2001年第2期15卷 125-127页

作者：汪治清杨新科佟玉品侯云德中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室北京100052 北京军区二六一医院

目的　探索促血小板生成素 (Thrombopoietin ,TPO)分子间相互作用及其存在位置。方法　构建了含有不同TPO区段的酵母双杂交系统融合表达质粒 ,转化酵母菌SFY5 2 6 ,分析 β 半乳糖苷酶活性以推测TPO分子间的相互作用。结果　全长TPO pG... 详细信息

目的　探索促血小板生成素 (Thrombopoietin ,TPO)分子间相互作用及其存在位置。方法　构建了含有不同TPO区段的酵母双杂交系统融合表达质粒 ,转化酵母菌SFY5 2 6 ,分析 β 半乳糖苷酶活性以推测TPO分子间的相互作用。结果　全长TPO pGBT9与全长TPO pGAD42 4、全长TPO pGAD42 4与TPO(N) pGBT9、TPO(N) pGBT9与TPO(N) pGAD42 4之间有相互作用 ,全长TPO pGBT9与TPO(C) pGAD42 4、TPO(N) pGBT9与TPO(C) pGAD42 4、TPO(C) pGBT9与TPO(C) pGAD42 4之间无相互作用。结论　自然状态下TPO在N端结构区可能存在相互作用 ,C端结构域不参与此过程。

关键词：促血小板生成素酵母双杂交系统相互作用

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中和性流行性感冒病毒基因工程抗体在昆虫细胞中的全基因表达、纯化及鉴定

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病毒学报 2001年第4期17卷 313-317页

作者：杨贵宾吴淑华梁米芳赵小东王艳侯云德中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室北京100052

将中和性流行性感冒 (流感 )病毒基因工程抗体IV 2、IV 6的轻链和重链Fd段基因 ,分别克隆入全抗体表达载体 pAC L Fc ,构建成杆状病毒表达载体pAC L Fc Ⅳ 2和 pAC L Fc Ⅳ 6 ,转染昆虫Sf9细胞 ,利用杆状病毒 /昆虫细胞系统实现抗体... 详细信息

将中和性流行性感冒 (流感 )病毒基因工程抗体IV 2、IV 6的轻链和重链Fd段基因 ,分别克隆入全抗体表达载体 pAC L Fc ,构建成杆状病毒表达载体pAC L Fc Ⅳ 2和 pAC L Fc Ⅳ 6 ,转染昆虫Sf9细胞 ,利用杆状病毒 /昆虫细胞系统实现抗体的分泌型表达 ,表达产物进行亲和层析分离纯化。SDS PAGE电泳和Westernblot法证实有完整免疫球蛋白的表达 ,免疫印迹法证实它们能与流感病毒血凝素蛋白特异性结合。经间接竞争性抑制ELISA法测定 ,抗体与流感病毒抗原结合的解离常数KD 值分别为 2 5× 10 -9M和 3 0× 10 -9M。流感病毒基因工程全抗体经在昆虫细胞中的表达、纯化和抗体特性鉴定 ,获得了两株纯化的全抗体 ,可用于以后的动物模型呼吸道粘膜被动免疫抗感染的研究。

关键词：杆状病毒昆虫细胞流感病毒基因工程抗体分泌性表达纯化鉴定

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表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒伴随病毒的产生

引用

中华实验和临床病毒学杂志 2001年第3期15卷 300-300,F003页

作者：伍志坚吴小兵曹晖牛东滨王宏侯云德中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室北京100052

来源于维多利亚水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是近年来发现的一种新的报告基因,由于其具有产生荧光不需任何底物或辅助因子、可以活体观察等特点,因此在目前的基因转移、基因治疗研究中得到了... 详细信息

来源于维多利亚水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是近年来发现的一种新的报告基因,由于其具有产生荧光不需任何底物或辅助因子、可以活体观察等特点,因此在目前的基因转移、基因治疗研究中得到了广泛的应用[1].重组腺病毒伴随病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)具有安全性好、可介导外源基因长期稳定表达等特点,是目前比较理想的基因治疗载体.构建表达GFP的rAAV载体(rAAV-GFP)对于应用rAAV进行基因转移和基因治疗研究非常必要,如评估rAAV生产系统的生产效率、估计rAAV的转导效率、研究rAAV进入体内后的分布及表达情况等.

关键词：绿色荧光蛋白重组腺病毒伴随病毒表达基因治疗

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TNF受体(P55)胞外区基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

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病毒学报 2001年第2期17卷 127-131页

作者：安乃莉徐春晓姚立红陈爱君曾革非张立国张智清中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室北京100052

TNF与多种疾病密切相关。为了获得大量具有生物学活性的可溶性TNF受体用以拮抗TNF的毒性作用 ,在原核表达系统中表达了TNFR(P5 5 )的胞外区与TrxA的融合蛋白。将TNFR(P5 5 )胞外区去信号肽的前三个结构域基因克隆入融合蛋白表达载体 pET... 详细信息

TNF与多种疾病密切相关。为了获得大量具有生物学活性的可溶性TNF受体用以拮抗TNF的毒性作用 ,在原核表达系统中表达了TNFR(P5 5 )的胞外区与TrxA的融合蛋白。将TNFR(P5 5 )胞外区去信号肽的前三个结构域基因克隆入融合蛋白表达载体 pET 32a ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)中高效表达了TrxA TNFR融合蛋白。表达产物以包涵体形式存在 ,经过变性和复性 ,并经镍金属鳌和柱亲和层析纯化 ,得到了纯度较高的可溶性受体蛋白的初纯品。免疫学实验及L92 9细胞体外实验均表明 :该蛋白具有TNFR(P5 5 )特异的抗原性、与TNF结合的活性以及良好的抑制TNF的生物学活性。

关键词： TNF可溶性受体基因克隆融合蛋白大肠杆菌表达

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20世纪末新出现的病毒性脑炎——尼巴病毒性脑炎

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中华实验和临床病毒学杂志 2001年第3期15卷 293-295页

作者：邓娟梁国栋中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室北京100052

1 一种新的病毒性脑炎1998年9月马来西亚的Perak州发生病毒性脑炎的流行,许多成年人出现高热、脑炎等临床症状,病例急剧增加,截至1999年5月,共发病265例,死亡105例,死亡率达40%.由于该病发病凶险,死亡率高,且病因不清,震惊世界[1].1999... 详细信息

1 一种新的病毒性脑炎1998年9月马来西亚的Perak州发生病毒性脑炎的流行,许多成年人出现高热、脑炎等临床症状,病例急剧增加,截至1999年5月,共发病265例,死亡105例,死亡率达40%.由于该病发病凶险,死亡率高,且病因不清,震惊世界[1].1999年初,与马来西亚毗邻的新加坡也发现同样的脑炎病人,经医院确诊的病例为11例,死亡1例.同年3月马来西亚大学的研究人员从Perak 州Nipah镇的病毒性脑炎的尸解标本中分离到1株病毒,该病毒颗粒为160～300 nm,符合副粘病毒(Paramyxovirus)形态特征[2].经血清学证实该病毒为马来西亚和新加坡两地新发现的病毒性脑炎的病原体,由于分离病毒的标本来自于Nipah镇,因此取名为尼巴病毒(Nipah virus,NiV),该病毒引起的脑炎称尼巴病毒性脑炎.

关键词：病毒性脑炎鉴别诊断尼巴病毒性脑炎

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可溶性人肿瘤坏死因子受体Ⅱ(sTNFRⅡ)在大肠杆菌中的表达及其活性检测

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病毒学报 2001年第2期17卷 132-135页

作者：徐春晓姚立红陈爱君安乃莉曾革非张立国张智清中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室北京100052

肿瘤坏死因子 (TNF)是一种多功能性的细胞因子 ,与许多重大疾病有关。为了抑制TNF的生物学活性 ,将TNF受体Ⅱ胞外区在大肠杆菌中进行了可溶性表达 ,并通过金属鳌合层析柱纯化重组蛋白。结果表明 ,纯化的重组蛋白能够识别并结合TNF ,同... 详细信息

肿瘤坏死因子 (TNF)是一种多功能性的细胞因子 ,与许多重大疾病有关。为了抑制TNF的生物学活性 ,将TNF受体Ⅱ胞外区在大肠杆菌中进行了可溶性表达 ,并通过金属鳌合层析柱纯化重组蛋白。结果表明 ,纯化的重组蛋白能够识别并结合TNF ,同时能中和TNF的生物学活性 ,抑制其对细胞的杀伤作用 ,具有潜在的临床应用前景。

关键词：肿瘤坏死因子受体可溶性受体大肠杆菌生物学活生表达检测

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我国分离的两株病毒为重组甲病毒

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中华实验和临床病毒学杂志 2001年第2期15卷 120-124页

作者：何海怀吕新军杨益良付士红周国林张桂筠陈向伟梁国栋金奇侯云德中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室北京100052 山西医科大学

目的　明确我国分离的XJ 90 2 6 0和XJ 910 0 6病毒的分类地位、种系发生和遗传型。方法　特异引物逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)扩增两株病毒的NSP4、E1基因区和 3′端非编码区 ,测序 ,进行核苷酸序列同源性比较和 3′端非编码区核苷... 详细信息

目的　明确我国分离的XJ 90 2 6 0和XJ 910 0 6病毒的分类地位、种系发生和遗传型。方法　特异引物逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)扩增两株病毒的NSP4、E1基因区和 3′端非编码区 ,测序 ,进行核苷酸序列同源性比较和 3′端非编码区核苷酸序列分析 ,并结合同属其他病毒这些基因区的核苷酸序列进行种系进化分析。结果　两株病毒的核苷酸序列同源性为 10 0 % ,与西方马脑炎病毒的核种酸序列同源性最高 ,具有西方马脑炎病毒 3′端非编码区结构特征 ,其NSP4基因区与东方马脑炎病毒同源 ,E1基因区与辛德毕斯病毒同源 ,两株病毒均位于西方马脑炎病毒B组 ,与西方马脑炎病毒俄罗斯分离株进化关系最近。结论　我国分离的XJ 90 2 6 0和 910 0 6病毒属于西方马脑炎病毒同一遗传型 ,均为重组甲病毒。

关键词：披膜病毒科甲病毒属核苷酸类/分析种系发生/分析西方马脑炎病毒

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