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作者：赵焕英隋雷鸣范春香刘琦张韬杨慧首都医科大学神经科学研究所北京市神经再生修复重点实验室

目的建立一种快速准确测定培养细胞上清、脐带血干细胞定向诱导后细胞及上清、大鼠血清及脑组织中单胺类神经递质左旋多巴(L-DOPA)、去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)、多巴柯(DOPAC)、多巴胺(DA)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、高香草酸(HVA)、... 详细信息

目的建立一种快速准确测定培养细胞上清、脐带血干细胞定向诱导后细胞及上清、大鼠血清及脑组织中单胺类神经递质左旋多巴(L-DOPA)、去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)、多巴柯(DOPAC)、多巴胺(DA)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、高香草酸(HVA)、及5-羟色胺(5-HT)含量的高效液相色谱-电化学检测方法。并且使8种物质在同一流动相、同一柱子、同一流速等情况下达到良好的分离效果。方法泵的型号为:ESA Model582 Pump,检测器为:ESA Model coulochemⅢ;石墨碳电极、参比电极为金属板。采用ESA C18柱,柱型150 mm×3.2 mm,柱颗粒3μm;经反复实验摸索,能达到较好的分离效果,且8种物质分离时间间隔较均匀,并总时间较短的流动相配方为:缓冲液(0.05M柠檬酸、0.05无水乙酸钠、0.0005M辛烷基磺酸钠、0.0005M乙二胺四乙酸二钠、1.325%三乙胺及适度甲醇),流动相流速0.4ml/min。结果以上8种物质平均保留时间分别为2.60分、3.83分、5.42分、7.81分、10.62分、14.62分、20.33分、29.05分。另外流动相中8辛烷基磺酸钠和甲醇的浓度对分离时间和效果影响较大,应严格控制。8种递质的精密度分析结果:保留时间RSD为0.24%-0.68%;峰面积RSD为0.08%-0.43%,重现性好。线性检测范围HIAA、5-HT、HVA为12.5 nM-1000 nM;DA、LDOPA、DOPAC、NE、E为50 nM-4000 nM。8种递质相关系数范围为0.993-0.999之间。结论该方法可用于检测干细胞诱导单氨能神经元过程中培养上清的检测,帕金森病大鼠模型制作及其实行基因治疗效果等检测,以及为单胺类递质的神经毒理学、药理学研究提供了一个简单灵敏、稳定可靠的检测方法。

关键词：单胺类神经递质高效液相色谱

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行为检测软件在非人类灵长动物模型中的应用

行为检测软件在非人类灵长动物模型中的应用

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中国神经科学学会第四次会员代表大会暨第七届全国学术会议

作者：陈庆友刘玉军户乃丽鲁强张进禄首都医科大学神经科学研究所北京市神经再生修复重点实验室

目的以往对非人类灵长动物神经系统疾病模型的行为观察中,大多采用主观的人为观察或行为评分量表。目前,我们采用自动影像追踪系统(Ethovision)和猴上肢运动评价仪(mMAP)两种行为检测软件,可以定量的检测动物的躯体运动情况(运动距离和... 详细信息

目的以往对非人类灵长动物神经系统疾病模型的行为观察中,大多采用主观的人为观察或行为评分量表。目前,我们采用自动影像追踪系统(Ethovision)和猴上肢运动评价仪(mMAP)两种行为检测软件,可以定量的检测动物的躯体运动情况(运动距离和运动时平均速度)及精细活动(手和上肢),从而更加客观的评价神经系统病变中动物的行为变化。方法实验用成年恒河猴4只,实验前,先预适应环境,并检测术前动物行为情况。用Ethovision测试猴在观察笼内30分钟运动的距离和平均速度,使用mMAP检测猴双侧上肢取食活动,每侧各为6次,记录每次所需时间,取均数为每时间点观察值。后经立体定位仪向右侧黑质部位注射脂多糖(LPS),术后在第2,4,6,8,10,12周,分别用Ethovision和mMAP对动物进行检测并与术前比较。结果术后动物在30分钟内运动的距离和速度较术前明显减少,分别减少为23%±6%和19%±9%并随观察时间呈递减变化,mMAP检测结果显示动物上肢取食时间延长,平均时间增加26%±7%,在抓取食物时,出现抓取困难,抖动,类似帕金森样症状。结论上述两种检测方法能够更加客观的对灵长类动物的行为变化进行评价,这将为今后对灵长类动物模型的评价提供一个有利的工具。

关键词：灵长类动物行为 Ethovision mMAP 脂多糖

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脑室注射脂多糖引起脑内炎症反应及其对黑质多巴胺能神经元影响的研究

脑室注射脂多糖引起脑内炎症反应及其对黑质多巴胺能神经元影响的...

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中国神经科学学会第四次会员代表大会暨第七届全国学术会议

作者：李军泉张进禄徐群渊首都医科大学北京神经科学研究所北京神经再生修复研究重点实验室

目的通过脑室注射脂多糖激活脑内炎症反应,观察脑内炎症变化情况,大鼠行为学改变,以及对黑质多巴胺能神经元的影响。方法 250-300g雄性SD大鼠,侧脑室（前囟后0.8 mm,旁开1.3 mm,硬膜下3.5mm）立体定位注射脂多糖10μg、25μg、50μg和10... 详细信息

目的通过脑室注射脂多糖激活脑内炎症反应,观察脑内炎症变化情况,大鼠行为学改变,以及对黑质多巴胺能神经元的影响。方法 250-300g雄性SD大鼠,侧脑室（前囟后0.8 mm,旁开1.3 mm,硬膜下3.5mm）立体定位注射脂多糖10μg、25μg、50μg和100μg,对照组注射同等体积生理盐水。记录给药后各时间点大鼠30分钟行为录像,通过Enthovision行为轨迹分析软件计算运动平均速度。TH免疫组化染色观察各时间点黑质多巴胺能神经元的变化。OX42免疫组化染色观察各时间点脑内小胶质细胞变化。结果 10μg、50μg各时间点大鼠的平均运动速度没有统计学差异;25μg组给药后24 w大鼠平均运动速度有统计学差异,实验组较对照组平均运动速度下降,其它时间点没有统计学差异。100μg组给药后1 h纹状体及海马部位小胶质细胞明显激活,细胞胞体增大,突起缩短增粗,染色变深,而黑质部位小胶质细胞形态没有明显变化,激活不明显;给药后6 h纹状体、海马和黑质部位小胶质细胞都明显激活;给药后24 h纹状体、海马和黑质部位小胶质细胞激活程度更高,可以看到较多小胶质细胞呈圆形,胞体增大,突起消失,呈巨噬细胞形态;给药后4 w纹状体、海马和黑质部位大部分小胶质细胞形态己恢复到静息状态,仅少数呈激活状态,末见高度激活的小胶质细胞。10μg组24 w纹状体、海马和黑质小胶质细胞呈部分激活;25μg组24 w纹状体、海马和黑质小胶质细胞激活较明显,细胞胞体增大,突起缩短增粗,染色变深;50μg组24 w纹状体、海马和黑质小胶质细胞激活不明显,大部分呈静息状态。TH免疫组化染色显示:100μg组给药后1 h、6 h、24 h、4 w黑质TH阳性神经元形态和数量没有明显改变;10μg组24 w黑质TH阳性神经元数量没有明显减少,形态上与对照组相比,神经元胞体变小,突起减少甚至消失,染色变浅;25μg组24 w黑质TH阳性神经元数量较对照组减少,神经元胞体变小,突起减少甚至消失,染色变浅;50μg组24 w黑质TH阳性神经元数量和形态与对照组相比没有明显改变。结论脑室注射脂多糖后能引起脑内小胶质细胞的广泛激活,其激活程度随时间而逐渐增高,注射后24 h激活程度最高。黑质部位小胶质细胞激活要晚于纹状体及海马,说明脑室注射脂多糖后炎症反应在脑内由近及远扩散。不同剂量脂多糖注射后24 w对黑质TH阳性神经元的损伤作用不同,25μg剂量组对黑质多巴胺能神经元的损伤作用较明显。

关键词：脂多糖多巴胺能神经元小胶质细胞

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LPS激活的小胶质细胞条件培养基对DA能神经元毒性作用的探讨

LPS激活的小胶质细胞条件培养基对DA能神经元毒性作用的探讨

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中国神经科学学会第四次会员代表大会暨第七届全国学术会议

作者：鞠莉莉张琳段德义徐群渊首都医科大学北京神经科学研究所北京神经再生修复研究重点实验室

目的研究LPS激活的小胶质细胞条件培养基对DA能神经元毒性作用。方法收集LPS激活的不同浓度小胶质细胞培养基,分别作用于多巴胺能神经元MN9D、胆碱能神经元NG108-15和神经前体细胞RMN,利用MTT方法检测各细胞活性;同时,利用实时定量PCR... 详细信息

目的研究LPS激活的小胶质细胞条件培养基对DA能神经元毒性作用。方法收集LPS激活的不同浓度小胶质细胞培养基,分别作用于多巴胺能神经元MN9D、胆碱能神经元NG108-15和神经前体细胞RMN,利用MTT方法检测各细胞活性;同时,利用实时定量PCR检测α-synuclein mRNA在各时间点的表达水平。结果活化小胶质细胞条件培养基作用于MN9D、NG108-15、RMN三种细胞,24小时后,三种细胞活性分别降低44.3%、41.7%和39.9%;48小时后,分别降低35.2%、31.2%和38.3%;72小时后,分别升高29%、56.2%和3.3%。MN9D中α-synuclein mRNA表达量24 h升高67.7%,48 h升高60%,72 h升高186.3%。结论活化小胶质细胞条件培养基对多巴胺能神经元MN9D、胆碱能神经元NG108-15和神经前体细胞RMN均有毒性作用,对多巴胺能神经元MN9D的毒性作用更加明显。活化的小胶质细胞能提高多巴胺能神经元α-synuclein mRNA的表达,可能起到保护多巴胺能神经元的作用。

关键词： LPS活化的小胶质细胞多巴能神经元

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大鼠胚胎脑发育过程中血小板源性生长因子受体α 的时相表达

大鼠胚胎脑发育过程中血小板源性生长因子受体α 的时相表达

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中国神经科学学会第四次会员代表大会暨第七届全国学术会议

作者：江小华王蓓蓓赵焕英邹西峰徐群渊首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室教育部神经变性病学重点实验室

目的研究胎鼠脑发育过程中血小板源性生长因子受体α（PDGFRα）的表达变化,来探究其在神经系统发育过程中可能发挥的作用。方法利用免疫组织化学方法对PDGFRα在SD胎鼠脑中的表达进行定位;利用Realtime PCR和Western Blot等方法检测E11... 详细信息

目的研究胎鼠脑发育过程中血小板源性生长因子受体α（PDGFRα）的表达变化,来探究其在神经系统发育过程中可能发挥的作用。方法利用免疫组织化学方法对PDGFRα在SD胎鼠脑中的表达进行定位;利用Realtime PCR和Western Blot等方法检测E11.5-E18.5天SD胎鼠脑中PDGFRα的mRNA水平和蛋白水平的变化规律。结果免疫组织化学显示PDGFRα普遍表达于胎脑的各个脑区。Realtime PCR结果显示PDGFRα的mRNA水平在胎脑的发育过程中呈规律性改变,在E11.5就检测到了PDGFRα的表达,以后其表达水平逐渐增高,E14.5达高峰（表达量约为E11.5的3.6倍）,从E15.5开始下降,E18.5时的表达量紧为E14.5的1/11。Western Blot的结果与Realtime PCR结果相一致,E11.5可以检测到蛋白的表达,其表达水平在E13.5和E14.5维持较高的水平,E15.5后逐渐下降。结论 PDGFRα可能在神经干细胞向神经元定向分化方面起着重要的调控作用。

关键词：血小板源性生长因子受体α 胎鼠脑

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抑制多巴胺能细胞α -Synuclein基因表达增加酪氨酸羟化酶的活力

抑制多巴胺能细胞α -Synuclein基因表达增加酪氨酸羟化酶的活力

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中国神经科学学会第四次会员代表大会暨第七届全国学术会议

作者：刘冬梅杨慧首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经损伤与修复重点实验室

α-Synuclein基因是一种重要的帕金森病（Parkinson’s disease,PD）相关蛋白,其异常表达和聚集会造成DA能神经元的毒性。酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）是DA合成过程中的限速酶,TH活力的短期调节依赖于其丝氨酸残基的磷酸化... 详细信息

α-Synuclein基因是一种重要的帕金森病（Parkinson’s disease,PD）相关蛋白,其异常表达和聚集会造成DA能神经元的毒性。酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）是DA合成过程中的限速酶,TH活力的短期调节依赖于其丝氨酸残基的磷酸化,其中Ser40的磷酸化起到最主要调节作用。PKA是Ser40最主要的磷酸化酶,而Ser40的去磷酸化几乎完全依赖于PP2A。目前α-synuclein的生理功能及其在PD发病机制中的作用尚未完全阐明,α-synuclein与TH之间的关系仍不明确。在本研究中,我们利用稳定转染了小鼠α-synuclein基因干扰序列的MN9D多巴胺能细胞,探讨α-synuclein与TH的关系。实时定量RT-PCR、Western blot发现MN9D/α-SYN-细胞α-synuclein mRNA及蛋白表达量比正常MN9D细胞分别下降88%和70%,但MN9D/α-SYN-、MN9D/CON、MN9D/plasmid、MN9D/α-SYN+和MN9D细胞TH mRNA及蛋白表达量没有明显差异,这表明抑制α-synuclein并不会影响TH的基因表达。Western blot也发现,MN9D/α-SYN-细胞p-Ser40-TH蛋白表达量比正常MN9D细胞明显增加。HPLC对细胞内DA、L-DOPA测定发现,MN9D/α-SYN-细胞DA、L-DOPA含量均显著增高。以上结果提示抑制α-synuclein基因表达会使细胞内p-Ser40反映的TH活力增高。此外,Western blot也发现各组细胞PKA、磷酸化PKA蛋白表达量没有显著差异,这表明抑制α-synuclein基因表达不会影响PKA的基因表达和活力,提示TH活力的增高不是由于PKA使其磷酸化增加所导致的。而我们也发现,MN9D/α-SYN-细胞PP2A蛋白表达量显著减少,这表明抑制α-synuclein表达会增加PP2A的基因表达水平,从而使得TH去磷酸化减少、活力增高。综上所述,在正常MN9D细胞中,α-synuclein参与调控DA合成代谢的体内平衡;当α-synuclein功能缺失时,细胞内的去磷酸化酶PP2A表达增加,进而显著增高TH活力,使得DA合成增加,氧化应激增强,最终导致细胞损伤甚至死亡。本研究为探讨α-synuclein的生理功能及其在PD发病中的作用提供了新的证据。

关键词： α-synuclein 酪氨酸羟化酶帕金森病

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α -synuclein磷酸化修饰通过ERK1/2通路提高MN9D细胞内TH活性

α -synuclein磷酸化修饰通过ERK1/2通路提高MN9D细胞内TH活性

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中国神经科学学会第四次会员代表大会暨第七届全国学术会议

作者：吴波杨慧首都医科大学北京神经科学研究所北京神经再生修复重点实验室教育部神经变性病学重点实验室

突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）是-种与帕金森病（Parkinson Disease,PD）密切相关的磷蛋白。在PD中,α-Syn是特征性病理变化路易氏体（lewy bodies,LBs）的主要成分,并且其129位丝氨酸（Ser129）几乎全部处于磷酸化修饰状态,而在... 详细信息

突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）是-种与帕金森病（Parkinson Disease,PD）密切相关的磷蛋白。在PD中,α-Syn是特征性病理变化路易氏体（lewy bodies,LBs）的主要成分,并且其129位丝氨酸（Ser129）几乎全部处于磷酸化修饰状态,而在正常生理情况下,该位点磷酸化水平是极低的。α-Syn蛋白Ser129磷酸化由正常的低水平升高到PD状态的高水平,在PD发病机制中发挥什么样的作用,目前仍不清楚。本实验将α-Syn129位丝氨酸突变成天冬氨酸,模拟该位点的磷酸化功能,观察其对酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）活性的影响及其可能机制。应用重叠延伸PCR定点突变法,将129位丝氨酸编码碱基TCT突变为天冬氨酸（Asp,D）编码碱基GAT,获得编码模拟磷酸化α-Syn（S129Dα-Syn）的DNA序列,亚克隆到逆转录病毒真核表达载体（pLNCX2）。包装逆转录病毒并感染多巴胺能神经细胞MN9D细胞。通过蛋白印迹（Westernblot）检测TH蛋白表达、TH40位丝氨酸磷酸化（TH Ser40）水平变化及上游调节激酶变化。结果可见野生型α-Syn过表达组同正常对照组相比TH Ser40磷酸化水平降低（P＜0.01）,而S129Dα-Syn过表达组TH的磷酸化水平同野生型α-Syn组相比明显升高（P＜0.05）。TH蛋白水平在各组之间未见显著性差异。THSer40上游激酶PKA及磷酸化PKA蛋白水平在各组之间未见显著性差异,而活性形式的磷酸化ERK1/2在S129Dα-Syn过表达组表达水平明显增加（P＜0.01）。上述实验结果证实,在MN9D细胞中,α-Syn Ser129磷酸化修饰可能通过ERK1/2通路提高TH活性,TH活性上调可能导致多巴胺合成增加,最后影响多巴胺神经元活力。

关键词：突触核蛋白磷酸化酪氨酸羟化酶重叠延伸PCR

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成年大鼠侧脑室外侧壁新生细胞在嗅球切除后增殖与分化的形态学变化

成年大鼠侧脑室外侧壁新生细胞在嗅球切除后增殖与分化的形态学变...

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中国神经科学学会第四次会员代表大会暨第七届全国学术会议

作者：张淑文孟艳刘丙方蔡青高尔静徐群渊首都医科大学宣武医院老年病研究中心首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室中国教育部神经变性病重点实验室

目的 :研究嗅球切除后成年大鼠侧脑室外侧壁(SVZ)新生细胞增殖和分化的情况,进一步探讨嗅球对SVZ神经生发活动的影响。方法 :建立成年SD雄性大鼠右侧嗅球切除模型,并分别存活4w和12w,利用Nissl染色、PSA-NCAM和BrdU免疫组织化学染色的... 详细信息

目的 :研究嗅球切除后成年大鼠侧脑室外侧壁(SVZ)新生细胞增殖和分化的情况,进一步探讨嗅球对SVZ神经生发活动的影响。方法 :建立成年SD雄性大鼠右侧嗅球切除模型,并分别存活4w和12w,利用Nissl染色、PSA-NCAM和BrdU免疫组织化学染色的方法观察了成年SD大鼠嗅球切除后存活不同时间两侧嘴侧迁移流(RMS)BrdU阳性细胞数占总细胞百分比的变化以及两侧RMS PSA-NCAM阳性细胞的形态学变化。结果 :(1)嗅球切除后不同时间点,嗅球切除侧RMS的细胞数增加,BrdU免疫阳性细胞数增加,但BrdU免疫阳性细胞数占总细胞数的百分比随嗅球切除后大鼠存活时间的延长而下降,且以RMS的嘴侧部分下降更明显;(2)嗅球切除后,在切除侧断端嘴侧颗粒层和RMS均出现较对照侧更多地具有较长突起的PSA-NCAM阳性细胞。结论 :嗅球切除后仍有年轻神经元沿RMS向嘴侧迁移,但其增殖率随时间延长下调;嗅球的切除似乎并没有影响成神经细胞的分化。

关键词：溴球切除新生细胞增殖分化形态学成年大鼠

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骨髓干细胞来源的星形胶质细胞参与脑损伤后胶质界膜的形成

骨髓干细胞来源的星形胶质细胞参与脑损伤后胶质界膜的形成

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中华医学会河北省神经外科分会2007年学术会议

作者：邹西峰朱军李建珉张海燕赵春礼高尔静徐群渊华北煤炭医学院附属医院神经外科首都医科大学细胞生物学系首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室教育部神经变性疾病学重点实验首都医科大学医学实验与测试中心

目的：探讨骨髓干细胞来源的星形胶质细胞是否参与脑损伤后胶质界膜的形成。方法：将制作好的雌性sprague-Dawley大鼠脑损伤模型24小时后经尾静脉植入GFP标记的雄性Sprague-Dawley大鼠的骨髓源干细胞。在植入后2周、4周组和8周取脑,... 详细信息

目的：探讨骨髓干细胞来源的星形胶质细胞是否参与脑损伤后胶质界膜的形成。方法：将制作好的雌性sprague-Dawley大鼠脑损伤模型24小时后经尾静脉植入GFP标记的雄性Sprague-Dawley大鼠的骨髓源干细胞。在植入后2周、4周组和8周取脑,用GFAP荧光免疫组织化学方法显示星形胶质细胞,GFP显示骨髓来源细胞,观察损伤组织边缘是否存在GFP/GFAP双阳性细胞。结果：在损伤组织边缘可见骨髓干细胞来源的星形胶质细胞。结论：骨髓干细胞来源星形胶质细胞参与脑损伤后胶质界膜的形成。

关键词：绿色荧光蛋白骨髓源干细胞脑损伤星形胶质细胞免疫组织化学

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α-Synuclein聚集与帕金森病——影响α-synuclein蛋白聚集的因素

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生物化学与生物物理进展 2006年第4期33卷 321-328页

作者：金玲杨慧首都医科大学北京神经科学研究所北京神经再生修复研究重点实验室北京100069

α-synuclein基因是最早发现的与帕金森病相关的基因,在部分家族性帕金森病患者中存在该基因的突变.而无论是家族性还是散发性帕金森病,其特征性包涵体——Lewy小体的主要成分都是聚集的!-synuclein蛋白.目前研究发现的影响α-synuclei... 详细信息

α-synuclein基因是最早发现的与帕金森病相关的基因,在部分家族性帕金森病患者中存在该基因的突变.而无论是家族性还是散发性帕金森病,其特征性包涵体——Lewy小体的主要成分都是聚集的!-synuclein蛋白.目前研究发现的影响α-synuclein蛋白聚集的因素种类繁多.根据其对α-synuclein聚集的影响效应,主要分为促进聚集与抑制聚集两大类,不同因素作用于α-synuclein聚集的不同阶段或不同状态的α-synuclein.值得注意的是,目前研究认为可溶性寡聚物的毒性要强于聚集状态的α-synuclein,因此探讨影响α-synuclein蛋白聚集的因素,尤其是探讨各种因素对α-synuclein聚集状态的影响有重要意义.

关键词： α-synuclein 帕金森病 Lewy小体

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