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分析化学 2009年第3期37卷 330-334页

作者：赵焕英段春礼范春香刘琦张韬杨慧首都医科大学神经科学研究所北京市神经再生修复重点实验室教育部神经变性病重点实验室首都医科大学医学实验与测试中心

建立一种快速、准确测定生物样品中左旋多巴(L-DOPA)、去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)、多巴柯(DOPAC)、多巴胺(DA)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、高香草酸(HVA)及5-羟色胺(5-HT)8种递质含量的高效液相色谱-电化学检测方法。使8种物质在25mi... 详细信息

建立一种快速、准确测定生物样品中左旋多巴(L-DOPA)、去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)、多巴柯(DOPAC)、多巴胺(DA)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、高香草酸(HVA)及5-羟色胺(5-HT)8种递质含量的高效液相色谱-电化学检测方法。使8种物质在25min于单一流动相、单流速、单通道检测器情况下达到良好的分离效果。采用ESAMD-150色谱柱(150mm×3.2mm,3μm),流动相为50mmol/L柠檬酸、50mmol/L无水乙酸钠、0.5mmol/L1-庚烷磺酸钠、0.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠、5mmol/L三乙胺,pH3.5,在甲醇浓度为5%～10%,流速0.3～0.5mL/min,柱温为30℃时,都能使8种物质很好分离,其中在甲醇浓度8%,流速0.4mL/min,检测到前5种物质线性范围为0.005～10nmol/L;后3种0.001～10nmol/L,8种物质相关系数在0.994～0.999之间,检出限在pmol/L水平;回收率在80.3%～102.1%之间,相对偏差在1.4%～4.8%之间。且对样本处理和保存方法进行了探讨。

关键词：单胺类神经递质高效液相色谱电化学检测

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α-突触核蛋白N-端结构域参与线粒体功能的调控

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中国生物工程杂志 2009年第12期29卷 1-6页

作者：吕王乐张韬刘琦范春香张凌赵焕英赵春礼杨慧首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室神经变性病教育部重点实验室北京100069

目的:确定α-Synuclein蛋白与线粒体相互作用的功能结构域,并检测该结构域对线粒体功能的影响。方法:构建重组融合蛋白质粒pCMV-myc/α-Syn-WT、pCMV-myc/α-Syn-N和pCMV-myc/α-Syn-△N,转染人胚肾HEK293T细胞,通过免疫共沉淀明确α-Sy... 详细信息

目的:确定α-Synuclein蛋白与线粒体相互作用的功能结构域,并检测该结构域对线粒体功能的影响。方法:构建重组融合蛋白质粒pCMV-myc/α-Syn-WT、pCMV-myc/α-Syn-N和pCMV-myc/α-Syn-△N,转染人胚肾HEK293T细胞,通过免疫共沉淀明确α-Synuclein蛋白与线粒体相互作用的功能结构域。使用表达α-Synuclein蛋白的病毒上清感染小鼠多巴胺能神经细胞MN9D,通过免疫荧光、流式细胞术检测线粒体膜电位及Cytochrome c释放。结果:成功构建了pCMV-myc/α-Syn-WT、pCMV-myc/α-Syn-N和pCMV-myc/α-Syn-△N融合蛋白质粒,免疫共沉淀明确α-Synuclein N-端为其功能结构域,JC-1染色发现N-端使线粒体膜电位降低,流式细胞术证实N-端使Cytochrome c释放明显增加。结论:α-Synuclein N-端是其与线粒体相互作用的功能结构域,N-端降低线粒体功能。

关键词： α-突触核蛋白N-端结构域线粒体线粒体膜电位细胞色素c

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AAV介导的α-synuclein基因过表达致多巴胺能神经元损伤——一种制作轻度帕金森病大鼠模型的新方法

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中国生物工程杂志 2009年第1期29卷 1-6页

作者：鲁玲玲周爱霞杨慧首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室教育部神经变性病学重点实验室北京100069

目的:研究过表达α-synuclein基因是否导致大鼠黑质纹状体选择性损伤,为帕金森病(parkinson’s disease,PD)大鼠模型的制备提供一种新的方法。方法:用腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)做载体,将人野生型α突触核蛋白(α-synuclei... 详细信息

目的:研究过表达α-synuclein基因是否导致大鼠黑质纹状体选择性损伤,为帕金森病(parkinson’s disease,PD)大鼠模型的制备提供一种新的方法。方法:用腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)做载体,将人野生型α突触核蛋白(α-synuclein,NACP)引入大鼠脑内,观察大鼠行为学的改变,通过免疫组织化学染色观察其对黑质多巴胺能神经元细胞的影响,高效液相色谱(HPLC)检测纹状体多巴胺(DA)的含量。结果:α-synuclein基因过表达后大鼠出现自发性活动减少、爬行活动减慢、暂时性躯干震颤、竖毛等类似PD初期的症状和体征;大鼠脑黑质TH阳性神经元细胞随时间的延长出现数目减少,并且纹状体DA含量也出现减少,并且出现α-synuclein的积聚。结论:上述结果表明α-synuclein基因的过表达引起黑质多巴胺能神经元细胞的死亡,对大鼠的运动行为有一定的影响,产生类似于PD早期的症状与体征,与化学毒素(如6-OHDA,MPTP)诱导的动物模型相比,此法制作的动物模型可模拟PD缓慢发展的进程,为研究PD的病程进展及发病机制提供一个理想的动物模型。

关键词：帕金森病 α-突触核蛋白动物模型

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功能化硅壳荧光纳米载体在A549细胞中的细胞标记

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中国组织工程研究与临床康复 2009年第8期13卷 1486-1490页

作者：赵焕英隋雷鸣李峰李睿蔡青邓君高尔静姬曼杨慧首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室北京市100069 首都医科大学医学实验与测试中心北京市100069

背景:硅壳荧光磁性纳米载体表面功能化后不仅仍具备荧光性、磁性功能,而且还具有携药和携基因潜能,并有良好的生物相容性,可实现对细胞的标记功能。目的:制备Fe3O4@SiO2(FITC)-3-异氰基丙基三乙氧基硅烷-聚酰胺-胺树状大分子(G2.0)纳米... 详细信息

背景:硅壳荧光磁性纳米载体表面功能化后不仅仍具备荧光性、磁性功能,而且还具有携药和携基因潜能,并有良好的生物相容性,可实现对细胞的标记功能。目的:制备Fe3O4@SiO2(FITC)-3-异氰基丙基三乙氧基硅烷-聚酰胺-胺树状大分子(G2.0)纳米颗粒型多功能纳米载体,并评估纳米载体标记A549细胞的能力,在细胞内的分布及与细胞的生物相容性。设计、时间及地点:观察性实验,于2006-06/2007-06在首都医科大学化学生物学与药学院合成了纳米载体,2007-07/2008-07在首都医科大学神经科学研究所完成了复合纳米载体的生物评估。材料和方法:15μL3-异氰基丙基三乙氧基硅烷和195.12mg聚酰胺-胺树状大分子(G2)在无水甲醇环境中反应24h,得到目的产物3-异氰基丙基三乙氧基硅烷-聚酰胺-胺树状大分子;然后将合成好的Fe3O4@SiO2(FITC)与3-异氰基丙基三乙氧基硅烷-聚酰胺-胺树状大分子在甲醇溶液环境下,避光搅拌48h,用永磁铁分离固体,并经无水乙醇洗后真空干燥,得到最终目标载体。主要观察指标:透射电镜观察纳米载体的大小和细胞内分布,Zeta电位测定其生理情况下电荷情况,激光共聚焦显微镜下观察FITC、DAPI和LysotrackerBlue细胞染色情况以评估载体在细胞内定位,CCK-8评估其对细胞毒性作用,流式细胞计数法评价其标记细胞的效率。结果:透射电镜分析表明,修饰的硅壳纳米载体大小约为80nm,pH=7.4,纳米载体zeta电位为+23.93mV。透射电镜和激光共聚焦显微镜结果表明纳米粒主要存在细胞浆中,且能被溶酶体吞噬。CCK-8结果显示纳米载体的浓度高达1g/L时仍无明显的毒性作用。流式细胞计数结果表明,细胞摄取纳米粒呈浓度和时间依赖性。结论:成功制备了硅壳结构的荧光磁性纳米载体,主要分布在细胞浆中,且细胞相容性好。

关键词： SiO_2纳米粒子生物材料细胞相容性细胞标记

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多巴胺合成相关酶基因联合治疗帕金森病大鼠模型的研究

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中国生物工程杂志 2009年第2期29卷 34-41页

作者：鲁玲玲赵焕英吴均杨慧首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生与修复研究重点实验室教育部神经变性病学重点实验室北京100069

目的:利用骨髓间充质干细胞(MSCs)作为运载细胞,携带DA合成代谢过程中3个重要相关酶的基因:酪氨酸羟化酶(TH)、芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)和三磷酸鸟苷酸环化水解酶-I(GCH-I)基因,治疗帕金森病(PD)模型大鼠。方法:首先用重组病毒AAV-TH、... 详细信息

目的:利用骨髓间充质干细胞(MSCs)作为运载细胞,携带DA合成代谢过程中3个重要相关酶的基因:酪氨酸羟化酶(TH)、芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)和三磷酸鸟苷酸环化水解酶-I(GCH-I)基因,治疗帕金森病(PD)模型大鼠。方法:首先用重组病毒AAV-TH、AAV-AADC和AAVGCH-I的上清液对MSCs进行体外感染;将携带有TH、AADC和GCH-I基因的MSCs移植到PD模型大鼠纹状体内,检测纹状体及黑质内多巴胺及其代谢产物的变化,并观察其行为学的变化,以评估上述基因对PD大鼠的治疗作用。结果:重组假病毒颗粒感染MSCs后植入PD模型大鼠损伤侧纹状体内。通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和原位杂交的方法在移植后12周仍能检测到上述3种基因的表达。免疫荧光检测发现移植后12周MSCs在脑内存活良好;移植后4周、8周、12周行为学观察发现阿扑吗啡(APO)诱导旋转行为较对照组LacZ基因移植组有明显改善(p<0.01);移植后12w时三重基因移植组较双重基因移植组有明显改善(p<0.01)。移植后12周用高效液相色谱(HPLC)电化学法测定损伤侧纹状体和黑质内DA及其代谢产物3,4-二羟苯丙酸(DOPAC)的含量,三重基因移植组较hTH+hGCH-I基因移植组有明显增高(p<0.01);三重基因移植组较hTH+hAADC基因移植组有所增高,但两组之间没有显著性差异。结论:基因工程改造的MSCs在移植到PD模型大鼠脑内后可以很好地表达目的基因并在对动物行为学及生化方面改善的长期观察中发现三重基因联合脑内移植可能是比双重基因联合移植更佳的帕金森病基因治疗途径。

关键词：帕金森病基因治疗骨髓间充质干细胞

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HLAA表达沉默和酪氨酸羟化酶过表达的人成纤维细胞脑内移植治疗帕金森病大鼠模型

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基础医学与临床 2009年第7期29卷 697-703页

作者：梁彩霞徐云智赵春礼郑德宇段德义首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室教育部神经变性病重点实验室北京100069

目的观察人白细胞抗原A(HLA A)敲减和酪氨酸羟化酶(TH)过表达的人胚肺成纤维细胞(HELFs)于脑内移植后帕金森病(PD)大鼠的旋转行为和脑内炎性反应。方法用TH反转录病毒和携带HLA A干扰序列的慢病毒(表达绿色荧光蛋白GFP)感染细胞后移植... 详细信息

目的观察人白细胞抗原A(HLA A)敲减和酪氨酸羟化酶(TH)过表达的人胚肺成纤维细胞(HELFs)于脑内移植后帕金森病(PD)大鼠的旋转行为和脑内炎性反应。方法用TH反转录病毒和携带HLA A干扰序列的慢病毒(表达绿色荧光蛋白GFP)感染细胞后移植于PD大鼠模型纹状体。移植后检测大鼠旋转行为,免疫组化染色观察TH、OX42、OX6和GFAP表达,GFP观察移植物存活。同时移植HELFs以及TH转导的HELFs和大鼠肺成纤维细胞作对照。结果移植后GFP荧光细胞数量逐渐减少,HLA A敲减组细胞的减少相对较轻,但对大鼠旋转行为的改善不明显;OX42阳性小胶质细胞改变不明显,但OX6表达逐渐增加,而GFAP阳性细胞激活逐渐下降但仍强于移植对侧。结论HLA A表达沉默细胞移植对大鼠运动症状改善不明显,细胞移植能激活小胶质细胞和星形胶质细胞。

关键词：帕金森病人白细胞抗原A 酪氨酸羟化酶异种移植 RNA干扰

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α-突触核蛋白磷酸化参与小鼠多巴胺能神经元的保护作用

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基础医学与临床 2009年第6期29卷 561-565页

作者：刘琦段春礼吴波范春香张韬赵焕英赵春礼杨慧首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室神经变性病教育部重点实验室北京100069

目的研究α-突触核蛋白(α-SYN)129位点磷酸化修饰是否具有神经元保护作用。方法应用反转录病毒感染小鼠多巴胺能神经元细胞MN9D,通过实时定量PCR检测各组细胞内α-SYN过表达情况,并通过免疫细胞化学方法检测野生型α-SYN(WT/α-SYN)及... 详细信息

目的研究α-突触核蛋白(α-SYN)129位点磷酸化修饰是否具有神经元保护作用。方法应用反转录病毒感染小鼠多巴胺能神经元细胞MN9D,通过实时定量PCR检测各组细胞内α-SYN过表达情况,并通过免疫细胞化学方法检测野生型α-SYN(WT/α-SYN)及129位点磷酸化α-SYN(S129D/α-SYN)过表达后α-SYN在细胞内聚集情况,应用CCK-8检测细胞活力,观察WT/α-SYN及S129D/α-SYN对MN9D的细胞毒性,从而明确S129D/α-SYN对多巴胺能神经元的影响。结果实时定量PCR结果显示,WT/α-SYN及S129D/α-SYN在MN9D细胞内均过表达(P<0.01)。WT/α-SYN过表达组细胞活力明显下降(P<0.01),共聚焦显微镜观察未见明显的α-SYN聚集;S129D/α-SYN过表达组细胞内可观察到明显的α-SYN聚集体,同WT/α-SYN组相比细胞活力有明显提高(P<0.01)。结论129位点丝氨酸的磷酸化修饰在一定程度上减轻了WT/α-SYN过表达所引起的细胞毒性。

关键词： α-突触核蛋白磷酸化α-突触核蛋白神经元保护多巴胺神经元

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骨髓干细胞来源的星形胶质细胞参与脑损伤后胶质界膜的形成

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南方医科大学学报 2009年第12期29卷 2391-2393页

作者：邹西峰朱军李建民张海燕赵春礼徐群渊华北煤炭医学院附属医院神经外科河北唐山063000 首都医科大学北京神经科学研究所/北京市神经再生修复研究重点实验室/教育部神经变性疾病学重点实验室北京100069 首都医科大学细胞生物学系北京100069

目的探讨骨髓干细胞来源的星形胶质细胞是否参与脑损伤后胶质界膜的形成。方法将制作好的雌性Sprague-Dawley大鼠脑损伤模型24h后经尾静脉植入GFP标记的雄性Sprague-Dawley大鼠的骨髓源干细胞。在植入后2、4和8周取脑,用GFAP荧光免疫组... 详细信息

目的探讨骨髓干细胞来源的星形胶质细胞是否参与脑损伤后胶质界膜的形成。方法将制作好的雌性Sprague-Dawley大鼠脑损伤模型24h后经尾静脉植入GFP标记的雄性Sprague-Dawley大鼠的骨髓源干细胞。在植入后2、4和8周取脑,用GFAP荧光免疫组织化学方法显示星形胶质细胞,GFP显示骨髓来源细胞,观察损伤组织边缘的胶质界膜中是否存在GFP/GFAP双阳性细胞。结果在损伤组织边缘可见骨髓干细胞来源的星形胶质细胞。结论骨髓干细胞来源星形胶质细胞参与脑损伤后胶质界膜的形成。这对脑外伤的恢复和组织工程材料的植入有重要的意义。

关键词：骨髓源干细胞星形胶质细胞胶质界膜脑损伤绿色荧光蛋白

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三硝基丙酸动物模型和亨廷顿氏病

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中国比较医学杂志 2009年第8期19卷 70-75页

作者：王丹丹李峰首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生及修复研究重点实验教育部神经变性病学重点实验室北京100069

亨廷顿氏病(Huntington s disease,HD)是一类神经系统退行性疾病,主要病理改变累及基底节神经元以及纹状体的固有神经元,患者主要临床特征为进行性恶化的运动、认知及精神障碍三联征。3-硝基丙酸(3-NP)是线粒体毒性药物,主要作用于氧化... 详细信息

亨廷顿氏病(Huntington s disease,HD)是一类神经系统退行性疾病,主要病理改变累及基底节神经元以及纹状体的固有神经元,患者主要临床特征为进行性恶化的运动、认知及精神障碍三联征。3-硝基丙酸(3-NP)是线粒体毒性药物,主要作用于氧化呼吸链并抑制机体的三羧酸循环。本文将就HD的发病机制及病理学特征以及3-NP介导的动物模型的优缺点做一综述。

关键词：亨廷顿氏病 3-硝基丙酸模型动物

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神经干细胞与接枝NogoR-Aβ的透明质酸水凝胶材料生物相容性的研究

神经干细胞与接枝NogoR-Aβ的透明质酸水凝胶材料生物相容性的研究

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中国神经科学学会第四次会员代表大会暨第八届全国学术会议

作者：肖丽丽王颖徐群渊首都医科大学、北京神经科学研究所、北京市神经再生修复研究重点实验室

目的评价神经干细胞与接枝了NogoR-Aβ的透明质酸水凝胶支架材料的生物相容性,探讨接枝NogoR-Aβ的透明质酸水凝胶支架材料作为中枢神经组织工程载体材料的可行性。方法以冷冻干燥法制备透明质酸水凝胶材料支架,用多聚赖氨酸（PLL）对... 详细信息

目的评价神经干细胞与接枝了NogoR-Aβ的透明质酸水凝胶支架材料的生物相容性,探讨接枝NogoR-Aβ的透明质酸水凝胶支架材料作为中枢神经组织工程载体材料的可行性。方法以冷冻干燥法制备透明质酸水凝胶材料支架,用多聚赖氨酸（PLL）对其进行改性,通过化学接枝法接枝NogoR-Aβ,利用扫描电镜观察透明质酸水凝胶的内部结构。体外培养大鼠孕13.5天胚胎前脑泡神经干细胞并将神经干细胞与透明质酸水凝胶支架材料共培养3d-7d,通过扫描电镜及细胞免疫组织化学技术观察3 d和7 d时神经干细胞在接枝了NogoR-Aβ的透明质酸水凝胶材料上的粘附、生长与分化情况。结果扫描电镜显示制备的透明质酸水凝胶材料具有疏松的三维多孔结构,神经干细胞在支架材料上能够很好的黏附并且有突起长出。细胞免疫组织化学染色显示神经于细胞在接枝NogoR-Aβ的透明质酸水凝胶支架材料上能够保持干细胞特性（Nestin）并且分化为神经元前体细胞（β-TubulinⅢ、Dcx）、GFAP阳性星形胶质细胞、少突胶质细胞（O4）。生长7 d比3 d时Nestin、Dcx阳性率下降,β-TubulinⅢ、NF、GFAP、O4阳性率升高。结论神经于细胞与经过改性的透明质酸水凝胶材料有良好的生物相容性,并且在其上能够很好的存活、生长、分化,透明质酸水凝胶材料有望作为中枢神经组织工程的载体材料。

关键词：神经干细胞水凝胶支架材料 NogoR-A 材料生物相容性

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