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帕金森病基因治疗的理论:VMAT_2基因的表达及其对MN9D细胞多巴胺代谢的影响

中国临床康复 2004年第4期8卷 667-669,T002页

作者：张京钟余爽赵春礼段春礼徐群渊首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复重点实验室北京市100054

目的:获得人Ⅱ型囊泡单胺转运体(vesicularmonoaminetransporter-2,VMAT2)基因,转染至MN9D细胞,通过检测细胞内外单胺类递质含量的变化评价VMAT2基因促进单胺类递质循环利用的效应。方法:从人胎脑中提取总RNA,RT-PCR方法扩增目的cDNA片... 详细信息

目的:获得人Ⅱ型囊泡单胺转运体(vesicularmonoaminetransporter-2,VMAT2)基因,转染至MN9D细胞,通过检测细胞内外单胺类递质含量的变化评价VMAT2基因促进单胺类递质循环利用的效应。方法:从人胎脑中提取总RNA,RT-PCR方法扩增目的cDNA片段并将其重组于pGEM-Easy-T载体中,进行全序列测定。重组真核表达载体pBK-RSV-VMAT2,转染MN9D细胞,免疫细胞化学检测VMAT2的表达,HPLC检测细胞内外单胺类递质含量的变化。结果:RT-PCR扩增到1637bp的带有Kozak序列的cDNA片段。原位杂交证实pAAV-VMAT2能在COS7细胞表达;免疫组化证实转基因的MN9D细胞(实验组)VMAT2免疫着色明显高于对照组。HPLC结果表明实验组中细胞内外的多巴胺含量分别升高至(227.2±20.8)%和(302.6±15.7)%(P<0.01),而细胞外HVA、DOPAC分别降低至(48.1±5.3)%和(55.7±4.9)%(P<0.05),细胞内HVA,DOPAC分别升高至(332.1±28.2)%和(1176.8±82.5)%(P<0.01)。结论:克隆了VMAT2cDNA片断,可在真核细胞中表达。该基因的过表达可促进多巴胺的循环利用,有望用于帕金森病的基因治疗。

关键词：帕金森病基因治疗 VMAT2基因基因表达 MN9D细胞多巴胺代谢 Ⅱ型囊泡单胺转运体

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骨髓基质干细胞多向分化的可能机制

引用

中国生物工程杂志 2004年第7期24卷 17-22页

作者：李娜杨慧首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室北京100054

近年来 ,围绕骨髓基质细胞分化机制的问题 ,大致有两种假说。有人认为骨髓基质细胞在其细胞的基因组内有几套“程序” ,在不同的外界环境下 ,会有相应的一套基因开启 ,从而分化成某种终末细胞。而另外一些人则认为骨髓基质细胞是通过与... 详细信息

近年来 ,围绕骨髓基质细胞分化机制的问题 ,大致有两种假说。有人认为骨髓基质细胞在其细胞的基因组内有几套“程序” ,在不同的外界环境下 ,会有相应的一套基因开启 ,从而分化成某种终末细胞。而另外一些人则认为骨髓基质细胞是通过与不同组织的细胞发生融合而实现向该组织分化的。在前人分化实验机理研究的基础上 ,认为骨髓基质细胞在分化成一些中胚层来源的细胞 ,如脂肪细胞 ,血细胞等时 ,可以直接通过靶基因的开启或关闭分化。而在跨胚层向外胚层或内胚层分化时 ,则需要通过细胞融合这一过程来最终分化成这些组织器官的特定细胞。

关键词：骨髓基质细胞干细胞分化机制融合

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骨髓源干细胞向损伤脑组织迁移的可能性

引用

解剖学报 2004年第6期35卷 561-564页

作者：邹西峰蔡青鲁强李铁林徐群渊首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室北京100054 第一军医大学珠江医院神经外科广州510282

目的　探讨骨髓源干细胞迁移至损伤脑组织的可能性。　方法　致死剂量照射的C5 7BL 6雌性小鼠 ,接受月龄相配的雄性小鼠骨髓移植。骨髓移植 2个月后制作脑外伤模型 ,1、2、4和 6周分批处死存活的动物。分别在外周血涂片和新鲜脑切片上... 详细信息

目的　探讨骨髓源干细胞迁移至损伤脑组织的可能性。　方法　致死剂量照射的C5 7BL 6雌性小鼠 ,接受月龄相配的雄性小鼠骨髓移植。骨髓移植 2个月后制作脑外伤模型 ,1、2、4和 6周分批处死存活的动物。分别在外周血涂片和新鲜脑切片上用荧光原位杂交法检测Y染色体阳性细胞。　结果　在移植后 6周的脑外伤病灶周围发现Y染色体阳性细胞。　结论　骨髓源干细胞可以迁移至脑外伤病灶周围 ,但这些细胞的性质需要进一步研究证实。

关键词：骨髓源干细胞骨髓移植神经元神经胶质小鼠

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小鼠Y染色体RNA探针的标记和应用

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解剖学报 2004年第6期35卷 664-667页

作者：邹西峰苏玉金鲁玲玲杨慧李铁林徐群渊首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室北京100054 第一军医大学珠江医院神经外科广州510282

目的　标记小鼠Y染色体RNA探针 ,检验该探针在检测外周血涂片和脑组织切片Y染色体阳性细胞的效率。　方法　以小鼠Y染色体重复序列pY35 3/BcDNA为模板标记RNA探针。以雌性小鼠为对照 ,用原位杂交法检测小鼠外周血涂片Y染色体阳性细胞 ;... 详细信息

目的　标记小鼠Y染色体RNA探针 ,检验该探针在检测外周血涂片和脑组织切片Y染色体阳性细胞的效率。　方法　以小鼠Y染色体重复序列pY35 3/BcDNA为模板标记RNA探针。以雌性小鼠为对照 ,用原位杂交法检测小鼠外周血涂片Y染色体阳性细胞 ;用荧光原位杂交法检测雄性小鼠脑组织切片Y染色体阳性细胞。　结果　Y染色体原位杂交法在外周血涂片Y染色体阳性的检测灵敏度和特异度均为 1 0 0 %,在脑切片检测Y染色体阳性细胞的灵敏度和特异度分别为 85 6 7%和 1 0 0 %。

关键词： Y染色体原位杂交荧光原位杂交小鼠

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神经干细胞脑内移植后的存活、迁移和分化

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中国生物工程杂志 2004年第11期24卷 13-17页

作者：王颖段德义徐群渊首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经修复再生重点实验室北京100054

从胚胎或成体大鼠脑组织、人胚脑组织均能分离到神经干细胞 ,将它们进行体外原代培养扩增或永生化后植入脑内 ,均能观察到其在脑内的迁移和分化现象。其分化能力主要取决于移植部位的脑内微环境 ,但这种影响作用是相对的。同时 ,体外培... 详细信息

从胚胎或成体大鼠脑组织、人胚脑组织均能分离到神经干细胞 ,将它们进行体外原代培养扩增或永生化后植入脑内 ,均能观察到其在脑内的迁移和分化现象。其分化能力主要取决于移植部位的脑内微环境 ,但这种影响作用是相对的。同时 ,体外培养环境如培养时间和细胞融合程度、维甲酸类诱导分化剂处理、NGF转导处理再移植或与嗜铬细胞 (分泌NGF)共移植等 ,也能决定神经干细胞脑内移植后向神经元方向分化的能力。神经干细胞移植为中枢神经系统功能重建和神经再生带来新的希望。

关键词：脑内移植神经干细胞脑组织分化维甲酸类中枢神经系统功能转导成体存活培养时间

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人胚胎海马神经干细胞体外培养方法的建立

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首都医科大学学报 2004年第2期25卷 144-146页

作者：赵春礼孙晓红鲁强刘玉军李敏姜传涛杨慧徐群渊首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室首都医科大学宣武医院

为建立人胚胎海马神经干细胞的体外培养方法 ,防止神经干细胞在培养过程中的分化 ,确立最佳的传代时机和方法 ,分离 1 6周人胚海马组织 ,采用无血清培养基对所分离的神经干细胞进行体外培养 ,比较不同培养条件与方法所获得的神经球数量... 详细信息

为建立人胚胎海马神经干细胞的体外培养方法 ,防止神经干细胞在培养过程中的分化 ,确立最佳的传代时机和方法 ,分离 1 6周人胚海马组织 ,采用无血清培养基对所分离的神经干细胞进行体外培养 ,比较不同培养条件与方法所获得的神经球数量的差异。结果 :建立了人胚胎海马神经干细胞体外培养的优化条件 ,确立了最佳传代方法与时机。提示 :人胚胎海马神经干细胞在体外抑制分化的条件下可以长期处于未分化状态增生 ,并且可多次传代。

关键词：人胚胎海马神经干细胞体外培养传代方法

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AGRIN在老年鼠大脑皮质和海马的表达

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中国组织化学与细胞化学杂志 2004年第1期13卷 54-57页

作者：刘丙方王唯析高尔静徐群渊首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复重点实验室北京100054 西安交通大学医学院人体解剖学与组织胚胎学教研室西安710061

目的　观察蛋白聚糖—agrin在大鼠大脑皮质和海马的表达 ,探讨agrin与记忆的关系。方法　用抗agrin的多克隆抗体 ,免疫组化方法检测成年大鼠、记忆正常老年鼠以及记忆障碍的老年鼠大脑皮质和海马中agrin的表达变化。结果　Agrin在不同... 详细信息

目的　观察蛋白聚糖—agrin在大鼠大脑皮质和海马的表达 ,探讨agrin与记忆的关系。方法　用抗agrin的多克隆抗体 ,免疫组化方法检测成年大鼠、记忆正常老年鼠以及记忆障碍的老年鼠大脑皮质和海马中agrin的表达变化。结果　Agrin在不同动物组的表达变化明显 ,在成年鼠和记忆正常的老年鼠的大脑皮质和海马agrin有较弱表达 ,但在记忆障碍的老年鼠其表达增加明显。结论　Agrin表达可能和大鼠的记忆障碍有关。

关键词： Agrin 蛋白聚糖记忆障碍大鼠大脑皮质海马表达

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应用逆转录病毒pLXSN-GFP在脑组织追踪骨髓源干细胞的可行性

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中华神经医学杂志 2004年第5期3卷 327-329页

作者：邹西峰赵春礼张海燕李铁林徐群渊第一军医大学珠江医院神经外科广东广州510282 首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室北京100054

目的探讨应用逆转录病毒pLXSN-GFP在脑组织追踪骨髓源于细胞的可行性。方法应用逆转录病毒pLXSN-GFP标记Sprague-Dawley大鼠骨髓源干细胞,经尾静脉植入C57BL/6小鼠。在植入后4周和8周取材。用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察绿色荧... 详细信息

目的探讨应用逆转录病毒pLXSN-GFP在脑组织追踪骨髓源于细胞的可行性。方法应用逆转录病毒pLXSN-GFP标记Sprague-Dawley大鼠骨髓源干细胞,经尾静脉植入C57BL/6小鼠。在植入后4周和8周取材。用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察绿色荧光阳性细胞,同时用GFP抗体的荧光免疫组织化学方法判断绿色荧光的来源。结果移植骨髓源干细胞后4周和8周,在嗅球和脑干网状结构均可见绿色荧光阳性细胞,GFP抗体的荧光免疫组织化学方法证实绿色荧光的确来源于GFP的表达。结论逆转录病毒pLXSN-GFP可用以标记并在脑组织追踪骨髓源干细胞。

关键词：骨髓逆转录病毒干细胞脑组织免疫组织化学方法植入阳性细胞 GFP 荧光

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骨髓基质细胞的分离、鉴定以及TH基因的转染与表达

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生物化学与生物物理学报 2003年第6期35卷 536-541页

作者：鲁玲玲苏玉金赵春礼邹西峰侯少平徐群渊杨慧首都医科大学北京神经科学研究所、北京市神经再生修复研究重点实验室首都医科大学北京神经科学研究所、北京市神经再生修复研究重点实验室北京100054

目的是探索骨髓基质细胞的分离培养、鉴定及其接受并表达TH基因的能力。实验中通过密度梯度离心法成功地从成年SD大鼠骨髓中分离获得了骨髓基质干细胞 ,并用流式细胞仪对其进行鉴定 ,纯度可达 75 %。进一步采用复制缺陷型腺相关病毒载... 详细信息

目的是探索骨髓基质细胞的分离培养、鉴定及其接受并表达TH基因的能力。实验中通过密度梯度离心法成功地从成年SD大鼠骨髓中分离获得了骨髓基质干细胞 ,并用流式细胞仪对其进行鉴定 ,纯度可达 75 %。进一步采用复制缺陷型腺相关病毒载体介导的基因转染方法 ,将之改造成为携带lacZ与TH基因的工程细胞 ,经X gal染色和TH免疫组化检测 ,转染效率为 (74 .6± 19.4 ) %。实验结果表明骨髓基质细胞易于接受并表达外源基因 ,有望作为运载细胞应用于帕金森病的基因治疗。

关键词：骨髓基质细胞帕金森病腺相关病毒载体 TH基因

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酪氨酸羟化酶和左旋芳香族氨基酸脱羧酶基因的细胞表达及活性检测

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生理学报 2003年第5期55卷 583-588页

作者：苏月段春礼赵春礼赵焕英徐群渊杨慧首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复重点实验室北京 100054 首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复重点实验室

由于在帕金森病中合成多巴胺所需的酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)和左旋芳香族氨基酸脱羧酶(aromatic L-amino acid decarboxylase,AADC)活性明显降低,所以补充多巴胺合成酶成为基因治疗帕金森病研究的主要手段。我们分别构建... 详细信息

由于在帕金森病中合成多巴胺所需的酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)和左旋芳香族氨基酸脱羧酶(aromatic L-amino acid decarboxylase,AADC)活性明显降低,所以补充多巴胺合成酶成为基因治疗帕金森病研究的主要手段。我们分别构建了重组逆转录病毒载体pLHCX/TH及pLNCX/AADC,通过脂质体介导将带有目的基因的载体分别转到包装细胞PA317中,经筛选得到产病毒的细胞PA317/TH和PA317/AADC,采用免疫组化、原位杂交方法检测目的基因表达;细胞经裂解后进行的酶促反应产物多巴胺以高压液相电化学方法检测证明所克隆的TH及AADC基因具有功能活性;这两种基因工程改造细胞可以完成酶促动力学的功能,使L-dopa及多巴胺产生明显增加。本研究为用TH和AADC双基因对帕金森病进行基因治疗提供了一定的依据。

关键词：细胞生物学帕金森病酪氨酸羟化酶芳香族氨基酸左旋脱羧酶逆转录病毒载体基因治疗

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