检索结果-内蒙古大学图书馆

基因治疗帕金森病的分子生物学研究:神经营养因子Neurturin基因克隆及其真核表达

中国临床康复 2005年第5期9卷 64-66页

作者：张京钟余爽段德义赵春礼徐群渊首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室北京市100054

目的:克隆中国人Neurturin基因,重组携带Neurturin基因的真核表达载体,为研究Neurturin基因治疗帕金森病提供分子生物学基础。方法:实验于2003-03/2004-05在北京市神经再生修复研究重点实验室完成。采用RT-PCR方法从人胎儿脑中获取Neurt... 详细信息

目的:克隆中国人Neurturin基因,重组携带Neurturin基因的真核表达载体,为研究Neurturin基因治疗帕金森病提供分子生物学基础。方法:实验于2003-03/2004-05在北京市神经再生修复研究重点实验室完成。采用RT-PCR方法从人胎儿脑中获取NeurturincDNA,将其克隆至pGEM-Easy-T载体中。测序鉴定后,重组携带Neurturin基因的反转录病毒载体pLPCX-Neurturin;通过脂质体将重组载体转染PT67包装细胞系,用病毒上清感染NIH3T3细胞系以检测病毒滴度。结果:RT-PCR扩增到人NeurturincDNA片段,序列与Genebank登录的序列一致;将Neurturin基因亚克隆至反转录病毒载体得到插入方向正确的重组载体pLPCX-Neurturin,病毒上清滴度为5×104CFU/mL。结论:获得人Neurturin基因cDNA序列,检测到Neurturin基因在真核细胞中表达,并得到较高滴度的病毒上清。

关键词：帕金森病克隆,分子基因表达

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胚胎皮层神经元的发育及其相关分子机制

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基础医学与临床 2005年第8期25卷 679-683页

作者：余爽徐群渊首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室北京100054

在胚胎皮层的发育过程中,神经元及胶质细胞先后由同一先祖细胞分化而来.其中,bHLH(basic helix-loop-helix)转录因子NGN1表达水平的改变可能是前体细胞从神经元发生到胶质细胞发生转变过程中的一个关键因素.此外,转录因子EMX2 、PAX6 、... 详细信息

在胚胎皮层的发育过程中,神经元及胶质细胞先后由同一先祖细胞分化而来.其中,bHLH(basic helix-loop-helix)转录因子NGN1表达水平的改变可能是前体细胞从神经元发生到胶质细胞发生转变过程中的一个关键因素.此外,转录因子EMX2 、PAX6 、MASH1等也与神经元的表型特化及皮层的区域划分密切相关.

关键词：皮层神经元分化转录因子 NGN1

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外源性Nurr1基因过表达增强SK-N-SH细胞对神经毒素6-OHDA敏感性的研究

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中国药理学通报 2005年第10期21卷 1171-1176页

作者：刘扬赵咏梅张海燕李卫红徐群渊首都医科大学宣武医院北京100053 首都医科大学细胞生物学教研室北京100054 首都医科大学北京市神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室北京100054

目的通过比较自身不表达Nurrl基因的人神经母细胞瘤细胞SK—N—SH和过表达外源性Null基因的SK—N—SH／Nurrl细胞对神经毒素6-羟多巴胺（6-OHDA）损伤的敏感程度，探讨Null基因与6一OHDA引起的多巴胺（DA）能神经元特异性损伤的相关性... 详细信息

目的通过比较自身不表达Nurrl基因的人神经母细胞瘤细胞SK—N—SH和过表达外源性Null基因的SK—N—SH／Nurrl细胞对神经毒素6-羟多巴胺（6-OHDA）损伤的敏感程度，探讨Null基因与6一OHDA引起的多巴胺（DA）能神经元特异性损伤的相关性。方法①绘制SK—N—SH细胞及SK—N—SH／Nurrl细胞的生长曲线，比较外源性Null基因过表达对细胞增殖率的影响。②用不同浓度的6-OHDA（5—100μmol·L^-1）分别作用两株细胞1—24h，倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，MTT测定法比较两株细胞的存活率。③用75μmol·L^-1的6-OHDA作用12h，经Hoechst33342染色，荧光显微镜观察细胞核形态，比较两株细胞的凋亡情况。结果①生长曲线结果显示，SK—N—SH／Null细胞增殖数目低于SK—N—SH细胞一②MTT结果显示，6-OHDA对两株细胞的存活均有抑制作用，但SK—N—SH／Null细胞存活率下降更为明显。③Hoechst33342染色结果显示，用75μmol·L^-1的6-OHDA作用12h后SK—N—SH细胞核没有出现明显的凋亡形态改变，而部分SK—N—SH／Null细胞的细胞核出现了染色质凝聚、碎裂等凋亡形态改变，比例约为22％-24％。结论外源性Null基因过表达抑制SK—N—SH细胞增殖，增强SK—N—SH细胞对6-OHDA的敏感性并有可能促进6-OHDA诱导的细胞凋亡。Null基因可能作为易感因子参与多巴胺能神经元的特异性损伤。

关键词： Null 过表达 6-OHDA 凋亡

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α-突触核蛋白N-端结构域参与线粒体功能的调控

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中国生物工程杂志 2009年第12期29卷 1-6页

作者：吕王乐张韬刘琦范春香张凌赵焕英赵春礼杨慧首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室神经变性病教育部重点实验室北京100069

目的:确定α-Synuclein蛋白与线粒体相互作用的功能结构域,并检测该结构域对线粒体功能的影响。方法:构建重组融合蛋白质粒pCMV-myc/α-Syn-WT、pCMV-myc/α-Syn-N和pCMV-myc/α-Syn-△N,转染人胚肾HEK293T细胞,通过免疫共沉淀明确α-Sy... 详细信息

目的:确定α-Synuclein蛋白与线粒体相互作用的功能结构域,并检测该结构域对线粒体功能的影响。方法:构建重组融合蛋白质粒pCMV-myc/α-Syn-WT、pCMV-myc/α-Syn-N和pCMV-myc/α-Syn-△N,转染人胚肾HEK293T细胞,通过免疫共沉淀明确α-Synuclein蛋白与线粒体相互作用的功能结构域。使用表达α-Synuclein蛋白的病毒上清感染小鼠多巴胺能神经细胞MN9D,通过免疫荧光、流式细胞术检测线粒体膜电位及Cytochrome c释放。结果:成功构建了pCMV-myc/α-Syn-WT、pCMV-myc/α-Syn-N和pCMV-myc/α-Syn-△N融合蛋白质粒,免疫共沉淀明确α-Synuclein N-端为其功能结构域,JC-1染色发现N-端使线粒体膜电位降低,流式细胞术证实N-端使Cytochrome c释放明显增加。结论:α-Synuclein N-端是其与线粒体相互作用的功能结构域,N-端降低线粒体功能。

关键词： α-突触核蛋白N-端结构域线粒体线粒体膜电位细胞色素c

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温度敏感型基因永生化神经前体细胞系的建立

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解剖学报 2005年第5期36卷 491-497页

作者：张海燕段德义赵春礼兰兰赵咏梅王蓓蓓苏玉金徐群渊首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经修复与再生重点实验室北京100054

目的建立温度敏感型永生化神经前体细胞系,鉴定其细胞生长特点及表达抗原的特性。方法利用逆转录病毒感染原代培养的胚胎13d SD大鼠中脑神经前体细胞,建立温度敏感型永生化神经前体细胞系RMN,利用免疫细胞化学、Western blot和流式细胞... 详细信息

目的建立温度敏感型永生化神经前体细胞系,鉴定其细胞生长特点及表达抗原的特性。方法利用逆转录病毒感染原代培养的胚胎13d SD大鼠中脑神经前体细胞,建立温度敏感型永生化神经前体细胞系RMN,利用免疫细胞化学、Western blot和流式细胞分析方法测定RMN细胞的特征。结果在33℃条件下,RMN细胞呈多边形,有较短突起;细胞增殖迅速,群体倍增时间为48 h,可连续传代和冷冻保存;细胞表达SV40大T抗原,nestin蛋白和Nurr1蛋白;RMN细胞中未发现染色体倍体的异常,裸鼠接种20周后未观察到肿瘤的形成。在39℃条件下,RMN细胞增殖速度减缓,细胞形成较长突起。在含1%胎牛血清的培养基中培养1周后,RMN细胞可表达-βIII-tubulin,GFAP和Gal C等抗原,但SV40抗原表达减弱。结论RMN细胞系是SV40/tsA58基因永生化的大鼠神经前体细胞系,是具有温度敏感性及多分化潜能的前体细胞系。

关键词： SV40温度敏感突变体神经前体细胞永生化体外培养免疫细胞化学大鼠

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人类白细胞抗原A表达沉默对大鼠脑内人细胞移植排斥反应的调节

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中国组织工程研究与临床康复 2008年第40期12卷 7801-7807页

作者：徐云智梁彩霞赵春礼郑德宇段德义首都医科大学神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室神经变性病教育部重点实验室北京市100069

背景:移植物主要组织相容性抗原复合物在移植排斥反应中起关键作用。用慢病毒介导的人类白细胞抗原RNA干扰技术可以降低T淋巴细胞的细胞毒作用和抗体介导的溶细胞作用,但尚未见相关体内研究报道。目的:拟用携带人类白细胞抗原A小分子干... 详细信息

背景:移植物主要组织相容性抗原复合物在移植排斥反应中起关键作用。用慢病毒介导的人类白细胞抗原RNA干扰技术可以降低T淋巴细胞的细胞毒作用和抗体介导的溶细胞作用,但尚未见相关体内研究报道。目的:拟用携带人类白细胞抗原A小分子干扰RNA序列的慢病毒感染人胚肺成纤维细胞,再将其移植到帕金森大鼠纹状体,观察人类白细胞抗原A表达沉默对移植排斥反应的调节。设计、时间及地点:细胞基因工程体内实验,于2005-09/2008-01在首都医科大学神经科学研究所完成。材料:清洁级12周龄雌性SD大鼠33只,用于建立帕金森动物模型。原代培养的人胚肺成纤维细胞取材于12周流产人胚胎,由北京京北医院提供。293T为贴壁依赖型成上皮样细胞。慢病毒载体系统由pSicoR,pCMV-VSV-G和psPAX2三质粒组成,为美国Addgene公司产品。携带HLA-A2 cDNA的pcDNA I/Amp-HLA质粒由比利时Ludwig肿瘤研究所Pierre van Bruggen教授惠赠。方法:以携带HLA-A2 cDNA的pcDNA I/Amp-HLA质粒为模板PCR扩增HLA-A2 cDNA编码区序列,构建人类白细胞抗原A融合蛋白表达载体pEGFP-Flag-HLA,转染293T细胞。用HLA-A2编码区序列设计小分子干扰RNA4个待选靶点序列,分别起始于编码区的第257,350,833,251位碱基,构建表达小分子干扰RNA慢病毒载体。用带有Flag标签的人类白细胞抗原AcDNA表达载体转染293T细胞后,再进行不同靶点病毒直接感染。33只帕金森模型大鼠随机分为2组,实验组大鼠纹状体植入人类白细胞抗原A小分子干扰RNA病毒感染的人胚肺成纤维细胞,对照组植入带有小分子干扰RNA对照序列和绿色荧光蛋白病毒感染的人胚肺成纤维细胞。主要观察指标:免疫组织化学染色检测脑内移植物人类白细胞抗原A、CD4和CD8的表达,用抗人细胞核的阳性表达评价移植细胞的存活情况。结果:与对照组比较,实验组移植后4d、2周时人类白细胞抗原A阳性细胞均较少(t=3.301,2.631,P<0.01,0.05),6周时无明显变化;CD4阳性细胞仅移植后6周明显减少(t=2.269,P<0.05);移植后4dCD8阳性细胞无明显变化,2周及6周时明显减少(t=2.333,P<0.05);抗人细胞核阳性细胞仅移植后2周明显减少(t=2.952,P<0.05)。结论:人类白细胞抗原A表达敲减可以抑制移植排斥反应,但并不能显著延长移植物的存活时间。

关键词： RNA干扰人类白细胞抗原A2 移植排斥

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过表达PINK1抵抗鱼藤酮引起多巴胺神经元损伤的研究

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中国生物工程杂志 2012年第2期32卷 33-38页

作者：龚普盛张建亮付越姣贾焕珍段春礼鲁玲玲赵春礼杨慧首都医科大学神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室神经变性病教育部重点实验室北京100069

目的:明确在C57BL/6小鼠纹状体过表达野生型的人源帕金森相关蛋白PINK1能否减轻由侧脑室注射鱼藤酮引起多巴胺神经元损伤。方法:通过向C57BL/6小鼠(雄性,7周龄,18～20g)左侧纹状体中注射带有GFP人源野生型PINK1及突变体PINK1G309D的慢... 详细信息

目的:明确在C57BL/6小鼠纹状体过表达野生型的人源帕金森相关蛋白PINK1能否减轻由侧脑室注射鱼藤酮引起多巴胺神经元损伤。方法:通过向C57BL/6小鼠(雄性,7周龄,18～20g)左侧纹状体中注射带有GFP人源野生型PINK1及突变体PINK1G309D的慢病毒包装颗粒,两周后向小鼠左侧侧脑室中定位注射鱼藤酮,通过蛋白质印迹,免疫组化和行为学的方法检测PINK1对鱼藤酮引起多巴胺神经元损伤的影响。结果:蛋白质印迹和免疫组化的实验都证明了在C57BL/6小鼠纹状体过表达野生型的PINK1对于鱼藤酮引起多巴胺能神经元的减少有明显的抑制作用(P<0.01),但对鱼藤酮引起的行为学损伤没有明显的改善作用。

关键词： PINK1(PTEN-induced kinase 1) 鱼藤酮(Rotenone) 酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase)

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大鼠苍白球炎症反应后黑质铁代谢的改变

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中国组织工程研究与临床康复 2007年第8期11卷 1489-1492,1496,I0004页

作者：霍洁鲁强孙晓红徐群渊张进禄首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室教育部神经变性病学重点实验室北京市100069

目的:观察苍白球炎症对黑质铁代谢的影响及其对黑质多巴胺能神经元的毒性作用,探讨帕金森病与炎症反应的关系。方法:实验于2004-12/2006-05在首都医科大学北京神经科学研究所完成。选择健康SD雄性大鼠20只,随机数字表法分为生理盐水组... 详细信息

目的:观察苍白球炎症对黑质铁代谢的影响及其对黑质多巴胺能神经元的毒性作用,探讨帕金森病与炎症反应的关系。方法:实验于2004-12/2006-05在首都医科大学北京神经科学研究所完成。选择健康SD雄性大鼠20只,随机数字表法分为生理盐水组和脂多糖组,每组10只。①脑立体定位注射生理盐水或脂多糖入大鼠双侧苍白球,分别于术前、术后7,14,21,28d观察大鼠行为学改变,采用动物行为轨迹分析软件计算平均运动速度及30min内运动距离。②用药4周后麻醉后处死大鼠(n=10,每组各5只),用免疫组织化学染色、Perl’s铁染色观察黑质游离铁及铁蛋白表达以及酪氨酸羟化酶阳性神经元、小胶质细胞变化。③另10只大鼠于用药后4周断头提取蛋白,采用高效液相色谱法定量统计分析纹状体多巴胺含量变化。结果:纳入动物20只,均进入结果分析。①两组大鼠行为学观察:脂多糖组大鼠术后7,14,21,28d的平均运动速度、30min内运动距离较术前呈进行性减少,生理盐水组大鼠运动指标无明显变化。脂多糖组动物术后14,21,28d平均运动速度和30min内运动距离低于生理盐水组,差异均有显著性意义[分别为(0.95±0.1),(1.65±0.10)cm/min;(0.75±0.08),(1.60±0.09)cm/min;(0.45±0.07),(1.73±0.07)cm/min;(1710±180),(2970±180)cm;(1350±144),(2880±156)cm;(1170±126),(3314±140)cm,P<0.05,0.01]。②脂多糖组大鼠苍白球、黑质小胶质细胞增生且呈现异常激活状态。黑质酪氨酸羟化酶阳性神经元低于生理盐水组[分别为(3002.0±362.1),(6079.0±510.2)个,P<0.01]。③脂多糖组大鼠黑质内铁蛋白及游离铁水平较生理盐水组明显增加。④大鼠纹状体多巴胺含量:脂多糖组纹状体多巴胺含量低于生理盐水组,差异有显著性意义[分别为(16.49±1.79),(22.79±1.56)nmol/g,P<0.05]。结论:苍白球的炎症导致黑质多巴胺能神经元的变性,黑质中游离铁和铁代谢相关蛋白的改变可能在这一过程中发挥重要作用。

关键词：帕金森病苍白球炎症铁铁蛋白酪氨酸羟化酶

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AAV介导的α-synuclein基因过表达致多巴胺能神经元损伤——一种制作轻度帕金森病大鼠模型的新方法

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中国生物工程杂志 2009年第1期29卷 1-6页

作者：鲁玲玲周爱霞杨慧首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室教育部神经变性病学重点实验室北京100069

目的:研究过表达α-synuclein基因是否导致大鼠黑质纹状体选择性损伤,为帕金森病(parkinson’s disease,PD)大鼠模型的制备提供一种新的方法。方法:用腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)做载体,将人野生型α突触核蛋白(α-synuclei... 详细信息

目的:研究过表达α-synuclein基因是否导致大鼠黑质纹状体选择性损伤,为帕金森病(parkinson’s disease,PD)大鼠模型的制备提供一种新的方法。方法:用腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)做载体,将人野生型α突触核蛋白(α-synuclein,NACP)引入大鼠脑内,观察大鼠行为学的改变,通过免疫组织化学染色观察其对黑质多巴胺能神经元细胞的影响,高效液相色谱(HPLC)检测纹状体多巴胺(DA)的含量。结果:α-synuclein基因过表达后大鼠出现自发性活动减少、爬行活动减慢、暂时性躯干震颤、竖毛等类似PD初期的症状和体征;大鼠脑黑质TH阳性神经元细胞随时间的延长出现数目减少,并且纹状体DA含量也出现减少,并且出现α-synuclein的积聚。结论:上述结果表明α-synuclein基因的过表达引起黑质多巴胺能神经元细胞的死亡,对大鼠的运动行为有一定的影响,产生类似于PD早期的症状与体征,与化学毒素(如6-OHDA,MPTP)诱导的动物模型相比,此法制作的动物模型可模拟PD缓慢发展的进程,为研究PD的病程进展及发病机制提供一个理想的动物模型。

关键词：帕金森病 α-突触核蛋白动物模型

来源：评论

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反义HLA-A2 cDNA抑制人成纤维细胞于大鼠脑内移植后的免疫排斥反应

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神经解剖学杂志 2005年第2期21卷 113-118页

作者：李颖杨慧徐群渊姬曼张耀芬段德义首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室北京100054

为了探讨人类白细胞抗原(HLA)反义RNA在抑制异种移植免疫排斥反应中的作用,用HLA A2反义cDNA和GDNF共表达的逆转录病毒转导人胚肺成纤维细胞,再移植到Parkinson病大鼠模型纹状体(实验组);同时移植到未感染病毒的人成纤维细胞作对照。移... 详细信息

为了探讨人类白细胞抗原(HLA)反义RNA在抑制异种移植免疫排斥反应中的作用,用HLA A2反义cDNA和GDNF共表达的逆转录病毒转导人胚肺成纤维细胞,再移植到Parkinson病大鼠模型纹状体(实验组);同时移植到未感染病毒的人成纤维细胞作对照。移植后每周检测大鼠旋转行为的变化;并于4d、2周、6周灌杀大鼠,进行HLA A、CD4、CD8以及人核糖核蛋白颗粒(RNP)免疫组化染色等以观察宿主的免疫排斥反应和移植物在脑内的存活情况。结果发现:两组间动物的旋转行为变化不明显。实验组HLA A阳性细胞数在移植后的各时间点均明显少于对照组(P<0.05)。移植后4d两组的CD4和CD8阳性细胞数量变化均不明显(P>0.05),CD8细胞较多。2周和6周时实验组的CD4阳性细胞均明显少于对照组(P<0.01),且随时间逐渐下降。2周后实验组的CD8细胞基本消失,而对照组的CD8水平在2周时仍较高, 6周时也可见到。实验组RNP阳性细胞数量在各个时间点都明显多于对照组(P<0.01),到6周时明显下降, 12周时完全消失。反义HLA A2cDNA可以降低异种移植引起的免疫排斥反应程度,延长移植物存活时间,但抑制长期免疫排斥反应方面仍需寻找更好的方法。

关键词：反义cDNA HLA—A2 大鼠脑内移植免疫排斥反应基因治疗异种移植人成纤维细胞 Parkinson病

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