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生物物理学报 2011年第2期27卷 145-153页

作者：罗亚黎高侃徐群渊首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室教育部神经变性病学重点实验室北京100069

在以微流体技术加工的聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)及层粘连蛋白(laminin,LN)混合物材料上,培养纹状体神经元图案式黏附、生长,为制备神经芯片打好基础。以微流体印刷方法在硅片上微加工四种不同的黏附底物:LN、带正电荷的多聚赖... 详细信息

在以微流体技术加工的聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)及层粘连蛋白(laminin,LN)混合物材料上,培养纹状体神经元图案式黏附、生长,为制备神经芯片打好基础。以微流体印刷方法在硅片上微加工四种不同的黏附底物:LN、带正电荷的多聚赖氨酸(poly-L-lysine,PLL)、PEI和PEI+LN混合物。体外分离培养新生乳鼠纹状体神经元,评价神经元在不同图案化黏附底物上的黏附存活、突起生长状态及形成流道图案的差异;在PEI+LN混合物图案中观察不同线间距对构建神经元流道图案的效果。结果表明,在PEI、PLL及PEI+LN图案表面生长的神经元数量明显大于LN组;神经元在PEI+LN混合底物上与单纯PEI、LN、PLL相比更能形成完整的流道图案,在流道间距处于150μm及200μm时更为清晰。研究证实,通过微流体微加工后,由PEI与LN混合形成的粘附底物经优化流道图案规格后,能有效地构建神经元流道图案,有利于制备神经芯片。

关键词：微流体技术聚乙烯亚胺细胞培养

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嗅球切除对成年大鼠侧脑室外侧壁新生细胞增殖和分化的影响

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解剖学报 2007年第6期38卷 631-635页

作者：孟艳刘丙方蔡青高尔静徐群渊首都医科大学宣武医院老年病研究中心中国教育部神经变性病重点实验室北京100053 首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室北京100069

目的研究嗅球切除后成年大鼠侧脑室外侧壁(SVZ)新生细胞增殖和分化的情况,进一步探讨嗅球对SVZ神经生发活动的影响。方法建立成年SD雄性大鼠右侧嗅球切除模型,并分别存活4周和12周,利用Nissl染色、多唾液酸神经细胞黏附分子(PSA-NCAM)和... 详细信息

目的研究嗅球切除后成年大鼠侧脑室外侧壁(SVZ)新生细胞增殖和分化的情况,进一步探讨嗅球对SVZ神经生发活动的影响。方法建立成年SD雄性大鼠右侧嗅球切除模型,并分别存活4周和12周,利用Nissl染色、多唾液酸神经细胞黏附分子(PSA-NCAM)和BrdU免疫组织化学染色的方法观察了成年SD大鼠嗅球切除后存活不同时间两侧吻侧迁移流(RMS)BrdU阳性细胞数占总细胞百分比的变化以及两侧RMSPSA-NCAM阳性细胞的形态学变化。结果1·嗅球切除后不同时间点,嗅球切除侧RMS的细胞数增加,BrdU免疫阳性细胞数增加,但BrdU免疫阳性细胞数占总细胞数的百分比随嗅球切除后大鼠存活时间的延长而下降,且以RMS的吻侧部分下降更明显;2·嗅球切除后,在切除侧断端吻侧颗粒层和RMS均出现较对照侧更多的具有较长突起的PSA-NCAM阳性细胞。结论嗅球切除后仍有新生神经元沿RMS向吻侧迁移,但其增殖率随时间延长下调;嗅球的切除似乎并没有影响成神经细胞的分化。

关键词：嗅球切除增殖分化免疫组织化学大鼠

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多巴胺合成相关酶基因联合治疗帕金森病大鼠模型的研究

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中国生物工程杂志 2009年第2期29卷 34-41页

作者：鲁玲玲赵焕英吴均杨慧首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生与修复研究重点实验室教育部神经变性病学重点实验室北京100069

目的:利用骨髓间充质干细胞(MSCs)作为运载细胞,携带DA合成代谢过程中3个重要相关酶的基因:酪氨酸羟化酶(TH)、芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)和三磷酸鸟苷酸环化水解酶-I(GCH-I)基因,治疗帕金森病(PD)模型大鼠。方法:首先用重组病毒AAV-TH、... 详细信息

目的:利用骨髓间充质干细胞(MSCs)作为运载细胞,携带DA合成代谢过程中3个重要相关酶的基因:酪氨酸羟化酶(TH)、芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)和三磷酸鸟苷酸环化水解酶-I(GCH-I)基因,治疗帕金森病(PD)模型大鼠。方法:首先用重组病毒AAV-TH、AAV-AADC和AAVGCH-I的上清液对MSCs进行体外感染;将携带有TH、AADC和GCH-I基因的MSCs移植到PD模型大鼠纹状体内,检测纹状体及黑质内多巴胺及其代谢产物的变化,并观察其行为学的变化,以评估上述基因对PD大鼠的治疗作用。结果:重组假病毒颗粒感染MSCs后植入PD模型大鼠损伤侧纹状体内。通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和原位杂交的方法在移植后12周仍能检测到上述3种基因的表达。免疫荧光检测发现移植后12周MSCs在脑内存活良好;移植后4周、8周、12周行为学观察发现阿扑吗啡(APO)诱导旋转行为较对照组LacZ基因移植组有明显改善(p<0.01);移植后12w时三重基因移植组较双重基因移植组有明显改善(p<0.01)。移植后12周用高效液相色谱(HPLC)电化学法测定损伤侧纹状体和黑质内DA及其代谢产物3,4-二羟苯丙酸(DOPAC)的含量,三重基因移植组较hTH+hGCH-I基因移植组有明显增高(p<0.01);三重基因移植组较hTH+hAADC基因移植组有所增高,但两组之间没有显著性差异。结论:基因工程改造的MSCs在移植到PD模型大鼠脑内后可以很好地表达目的基因并在对动物行为学及生化方面改善的长期观察中发现三重基因联合脑内移植可能是比双重基因联合移植更佳的帕金森病基因治疗途径。

关键词：帕金森病基因治疗骨髓间充质干细胞

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人脐血干细胞定向分化为神经细胞的诱导方法

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中国临床康复 2006年第17期10卷 143-145页

作者：王屹季凤清杨慧首都医科大学北京神经科学研究所北京神经再生修复研究重点实验室北京市100069 首都医科大学组织学胚胎学教研室北京市100069

目的:分析人脐血干细胞在体外和体内向神经细胞分化的不同诱导条件。资料来源:应用计算机检索Medline数据库1990-01/2005-10相关脐带血干细胞向神经细胞分化文章,检索词为“umbilicalcordblood,mesenchymalstemcells,neuraldifferentiation”,分别组合进行检索,限定文章语言种类为English,同时计算机检索中文期刊数据库2000-01/2005-10相关脐带血间充质干细胞向神经分化文章,检索词为:“脐带血,间充质干细胞,神经分化”,分别组合进行检索,限定文章语言种类为中文。资料选择:初审资料,选取包括人脐血干细胞分化为神经细胞的文章。纳入标准:①脐带血间充质干细胞。②间充质干细胞向神经细胞分化。排除标准:①脐带血造血干细胞。②文献综述,重复研究,Meta分析类文章。资料提炼:共收集到68篇符合要求的文章,查找全文,选取其中近期相关文章19篇。将所有文章按照脐血干细胞诱导分化体外实验和体内实验进行分类综合。资料综合:脐带血干细胞来源丰富、采集方便、安全,且体外扩增迅速,在体外和体内一定条件下可以分化为神经细胞,然而不同的诱导条件对其分化的影响有不同,人们运用各种手段希望能找到诱导效率较高的诱导方法,包括几种化学诱导剂联合,生长因子之间配伍,化学诱导剂与生长因子联合,或应用接近生理状态的条件培养基等。在改进诱导条件的同时人们开始关注单一表型的细胞群作为实验对象是否能有效地提高诱导效率。研究者以期找到一种高效率而具有应用价值的诱导方法,为将脐带血干细胞应用于神经科学领域提供有力的证据。结论:人脐血干细胞在体外和体内一定条件下可以分化为神经细胞,应用于中枢神经系统疾病的细胞治疗具有广阔前景,然而寻找高效实用的诱导方法仍需要进一步研究。

关键词：干细胞细胞分化综述文献神经细胞

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HLAA表达沉默和酪氨酸羟化酶过表达的人成纤维细胞脑内移植治疗帕金森病大鼠模型

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基础医学与临床 2009年第7期29卷 697-703页

作者：梁彩霞徐云智赵春礼郑德宇段德义首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室教育部神经变性病重点实验室北京100069

目的观察人白细胞抗原A(HLA A)敲减和酪氨酸羟化酶(TH)过表达的人胚肺成纤维细胞(HELFs)于脑内移植后帕金森病(PD)大鼠的旋转行为和脑内炎性反应。方法用TH反转录病毒和携带HLA A干扰序列的慢病毒(表达绿色荧光蛋白GFP)感染细胞后移植... 详细信息

目的观察人白细胞抗原A(HLA A)敲减和酪氨酸羟化酶(TH)过表达的人胚肺成纤维细胞(HELFs)于脑内移植后帕金森病(PD)大鼠的旋转行为和脑内炎性反应。方法用TH反转录病毒和携带HLA A干扰序列的慢病毒(表达绿色荧光蛋白GFP)感染细胞后移植于PD大鼠模型纹状体。移植后检测大鼠旋转行为,免疫组化染色观察TH、OX42、OX6和GFAP表达,GFP观察移植物存活。同时移植HELFs以及TH转导的HELFs和大鼠肺成纤维细胞作对照。结果移植后GFP荧光细胞数量逐渐减少,HLA A敲减组细胞的减少相对较轻,但对大鼠旋转行为的改善不明显;OX42阳性小胶质细胞改变不明显,但OX6表达逐渐增加,而GFAP阳性细胞激活逐渐下降但仍强于移植对侧。结论HLA A表达沉默细胞移植对大鼠运动症状改善不明显,细胞移植能激活小胶质细胞和星形胶质细胞。

关键词：帕金森病人白细胞抗原A 酪氨酸羟化酶异种移植 RNA干扰

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DJ-1保护大鼠中脑黑质多巴胺能神经元抵抗鱼藤酮损伤的研究

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中国生物工程杂志 2013年第5期33卷 7-12页

作者：隋雷鸣高华谷利杨巍巍杨慧首都医科大学医学实验与测试中心北京100069 北京市神经外科研究所北京100050 首都医科大学神经生物学系北京市神经再生修复研究重点实验室神经变性病教育部重点实验室北京100069

目的:探讨过表达DJ-1蛋白能否保护大鼠中脑黑质多巴胺能神经元抵抗鱼藤酮所致的急性损伤。方法:构建表达DJ-1基因的腺相关病毒载体(rAAV-DJ-1)并转染HEK-293细胞,进行腺相关假病毒颗粒包装,所得假病毒颗粒注射到大鼠脑内感染黑质神经细... 详细信息

目的:探讨过表达DJ-1蛋白能否保护大鼠中脑黑质多巴胺能神经元抵抗鱼藤酮所致的急性损伤。方法:构建表达DJ-1基因的腺相关病毒载体(rAAV-DJ-1)并转染HEK-293细胞,进行腺相关假病毒颗粒包装,所得假病毒颗粒注射到大鼠脑内感染黑质神经细胞;4周后,注射鱼藤酮于大鼠黑质相同脑区;通过免疫组织化学和免疫印迹试验鉴定TH蛋白表达情况,采用动物行为轨迹分析软件计算大鼠30 min内运动距离以及强迫游泳试验鉴定大鼠精神症状。结果:与对照组相比,过表达DJ-1组大鼠运动损伤症状较轻,精神症状改善明显;损伤侧黑质TH阳性神经元数目和TH蛋白表达水平显著高于对照组。结论:过表达DJ-1蛋白能保护大鼠黑质多巴胺能神经元抵抗鱼藤酮所致的急性损伤,延缓多巴胺能神经元的退行性变,提示DJ-1可能对帕金森病的治疗有较好的应用前景。

关键词： DJ-1 鱼藤酮酪氨酸羟化酶帕金森病

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人脐血非造血干细胞的基本特性

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中国临床康复 2006年第29期10卷 50-52,i0002页

作者：王屹季凤清孙海梅赵春礼曾晓蓓杨慧首都医科大学北京神经科学研究所北京神经再生修复研究重点实验室北京市100069 首都医科大学组织学胚胎学教研室北京市100069

目的:通过对体外培养人脐血来源非造血干细胞生长特性的观察和对细胞免疫表型的检测,探讨人脐血来源非造血干细胞的一般特性,为进一步研究人脐血来源非造血干细胞提供依据。方法:实验于2005-01/10在首都医科大学北京神经科学研究所和首... 详细信息

目的:通过对体外培养人脐血来源非造血干细胞生长特性的观察和对细胞免疫表型的检测,探讨人脐血来源非造血干细胞的一般特性,为进一步研究人脐血来源非造血干细胞提供依据。方法:实验于2005-01/10在首都医科大学北京神经科学研究所和首都医科大学组织学胚胎学教研室实验室完成。脐带血由首都医科大学附属天坛医院提供,经密度梯度离心法分离新鲜脐带血,获取的单个核细胞进行培养。①倒置显微镜下观察细胞形态。②培养基中加入白血病抑制因子或用Mescencult间充质干细胞培养基进行培养,记录细胞生长状况。③流式细胞术分析脐血单个核细胞的免疫表型。结果:①人脐血非造血干细胞形态观察:较低密度接种细胞并不能形成大量贴壁细胞,而以5×106细胞密度接种则在48～72h后出现贴壁的梭形细胞,培养过程中细胞形态逐渐形成均一梭形。②生长特性:人脐血非造血干细胞接种5d后增殖速度加快,随后的几天内保持较快的增殖速度,15d后进入平台期。高糖DMEM培养基+胎牛血清和高糖DMEM培养基+胎牛血清+白血病抑制因子,两种培养体系在细胞增殖上未显示差异,白血病抑制因子并没有显著改善人脐血非造血干细胞生长增殖速度。③免疫表型:新鲜脐血经分离得到的单个核细胞中有少量CD34阳性细胞,CD90,CD166阳性细胞比例分别为(24.18±5.46)%和(36.44±6.26)%;人脐血非造血干细胞体外培养10d左右无CD34阳性细胞,CD166阳性细胞的比例达(76.48±4.54)%,较单个核细胞中CD166阳性细胞比例明显增高,并且表达HLA-ABC,而少量表达HLA-DR。结论:合适的细胞接种密度有利于人脐血非造血干细胞贴壁生长。白血病抑制因子并不能增加体外培养的人脐血非造血干细胞的生长增殖速度。人脐血非造血干细胞体外培养10d左右可以获得纯度较高的CD166阳性细胞。

关键词：脐带胎血流式细胞术

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Nrf3通路参与星形胶质细胞对抗鱼藤酮毒性的保护作用

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中国生物工程杂志 2010年第1期30卷 19-24页

作者：苏玉金曹倩鲁玲玲孙晓红高华赵莎莎杨慧首都医科大学北京市神经外科研究所北京100069 首都医科大学北京神经科学研究所北京神经再生修复研究重点实验室教育部神经变性病学重点实验室北京100069

目的:寻找星形胶质细胞在对抗由鱼藤酮导致的氧化应激中发挥保护作用的相关分子并探讨其作用机制。方法:小鼠多巴胺能MN9D细胞分别在星形胶质细胞条件培养液(ACM)与星形胶质细胞用新鲜培养基中培养24小时后加入鱼藤酮作用48小时。细胞计... 详细信息

目的:寻找星形胶质细胞在对抗由鱼藤酮导致的氧化应激中发挥保护作用的相关分子并探讨其作用机制。方法:小鼠多巴胺能MN9D细胞分别在星形胶质细胞条件培养液(ACM)与星形胶质细胞用新鲜培养基中培养24小时后加入鱼藤酮作用48小时。细胞计数,评价星形胶质细胞条件培养液对MN9D细胞的保护作用。利用基因芯片技术寻找MN9D细胞在ACM处理后发生表达上调或下调基因,并对这些基因进行分析,找出有意义基因。结果:在不同作用时间和鱼藤酮浓度梯度下,经过ACM处理的MN9D细胞活性显著高于在普通培养基中培养的细胞。初步得到104个差异表达基因,其中62个表达上调基因,42个表达下调基因。这些基因主要与凋亡、肿瘤、细胞周期、代谢、信号转导、转录调节、翻译调节和传递蛋白等相关。对其中的Atp5a1,Nrf3基因进行分析,发现Nrf3通路参与了ACM的保护作用。结论:ACM能保护MN9D细胞抵抗鱼藤酮所致的细胞毒性,Atp5a1,Nrf3,GCL,NQO1等基因经ACM处理后发生差异表达,可能是星形胶质细胞保护作用的部分下游信号通路。

关键词：帕金森病星形胶质细胞基因芯片

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PINK1与α-synuclein相互作用结构域鉴定

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中国生物工程杂志 2011年第12期31卷 10-14页

作者：付越姣段春礼龚普盛贾焕珍张建亮赵春礼鲁玲玲赵焕英袁星星杨慧首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室神经变性病教育部重点实验室北京100069

目的:确定PINK1与α-synuclein相互作用的结构域。方法:将PINK1不同结构域质粒(pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1WT,pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(G309D),pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(ΔN35),pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(ΔC145),pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(156～509),pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(Δ156～581),pcDNA3.1-3xFlag-vector)分别和pCMV-Myc-α-synuclein质粒共转染人胚肾HEK293T细胞,通过免疫共沉淀(Co-IP)技术验证PINK1与α-synuclein相互作用的结构域;同时进行免疫细胞化学染色,利用激光扫描共聚焦显微镜观察两种蛋白的共定位关系。结果:Co-IP实验结果表明PINK1与α-synuclein相互作用的结构域为PINK1的激酶结构域。免疫细胞化学实验也证实α-synuclein只与含激酶结构域的PINK1蛋白在细胞中存在共定位关系。结论:PINK1与α-synuclein相互作用的结构域位于其激酶结构域。

关键词： PINK1 α-synuclein 激酶结构域免疫共沉淀

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α-突触核蛋白磷酸化参与小鼠多巴胺能神经元的保护作用

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基础医学与临床 2009年第6期29卷 561-565页

作者：刘琦段春礼吴波范春香张韬赵焕英赵春礼杨慧首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室神经变性病教育部重点实验室北京100069

目的研究α-突触核蛋白(α-SYN)129位点磷酸化修饰是否具有神经元保护作用。方法应用反转录病毒感染小鼠多巴胺能神经元细胞MN9D,通过实时定量PCR检测各组细胞内α-SYN过表达情况,并通过免疫细胞化学方法检测野生型α-SYN(WT/α-SYN)及... 详细信息

目的研究α-突触核蛋白(α-SYN)129位点磷酸化修饰是否具有神经元保护作用。方法应用反转录病毒感染小鼠多巴胺能神经元细胞MN9D,通过实时定量PCR检测各组细胞内α-SYN过表达情况,并通过免疫细胞化学方法检测野生型α-SYN(WT/α-SYN)及129位点磷酸化α-SYN(S129D/α-SYN)过表达后α-SYN在细胞内聚集情况,应用CCK-8检测细胞活力,观察WT/α-SYN及S129D/α-SYN对MN9D的细胞毒性,从而明确S129D/α-SYN对多巴胺能神经元的影响。结果实时定量PCR结果显示,WT/α-SYN及S129D/α-SYN在MN9D细胞内均过表达(P<0.01)。WT/α-SYN过表达组细胞活力明显下降(P<0.01),共聚焦显微镜观察未见明显的α-SYN聚集;S129D/α-SYN过表达组细胞内可观察到明显的α-SYN聚集体,同WT/α-SYN组相比细胞活力有明显提高(P<0.01)。结论129位点丝氨酸的磷酸化修饰在一定程度上减轻了WT/α-SYN过表达所引起的细胞毒性。

关键词： α-突触核蛋白磷酸化α-突触核蛋白神经元保护多巴胺神经元

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