检索结果-内蒙古大学图书馆

生物物理学报 2011年第5期27卷 417-423页

作者：李杰杨予涛马克乾闫竹青李晓晓赵春礼徐志卿首都医科大学神经生物学系北京神经科学研究所北京神经再生修复研究重点实验室北京100069 Department of Neuroscience Karolinska Institutet

人甘丙肽2型受体(GalR2)作为G蛋白偶联受体,其功能已被广泛研究,但GalR2基因的转录调控机制尚不明确。我们利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法扩增人GalR2基因上游1121 bp的片段,再通过PCR方法将其缺失成3段长度不... 详细信息

人甘丙肽2型受体(GalR2)作为G蛋白偶联受体,其功能已被广泛研究,但GalR2基因的转录调控机制尚不明确。我们利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法扩增人GalR2基因上游1121 bp的片段,再通过PCR方法将其缺失成3段长度不等的片段,然后分别将其克隆到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中,并将相应的质粒命名为pGL3-B-1121、pGL3-B-922、pGL3-B-521和pGL3-B-200;通过荧光素酶活性分析检测不同长度的GalR2基因启动子在人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)中的活性,发现GalR2基因上游1121 bp区段具有明显的转录活性,缺失-1121到-922 bp区域引起启动子活性的明显增高,暗示该区域存在负调控元件;利用TESS在线软件分析GalR2基因上游序列,发现该基因启动子含有Sp1、AP-1、AP-2、NF-1、YY1和ERα等多种顺式作用元件。因此,本实验初步确定了人GalR2基因启动子的转录调节区,为进一步研究该基因转录调控机制奠定了基础。

关键词： GalR2基因启动子转录调节

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甘丙肽2型受体在HEK293A细胞中的同源二聚化研究

引用

生物物理学报 2011年第5期27卷 410-416页

作者：闫竹青吕琼金艳燕李杰马克乾杨予涛徐志卿张进禄首都医科大学神经生物学系北京神经科学研究所北京神经再生修复研究重点实验室北京100069 Departments of Neuroscience Karolinska Institutet

G蛋白偶联受体二聚化在受体的转运和信号转导中起着重要的调节作用。为了验证甘丙肽2型受体(GalR2)是否形成同源二聚体,本实验分别构建了N端带FLAG和HA标签的GalR2融合蛋白,并转染到HEK293A细胞中。Western blot发现,除了相当于GalR2分... 详细信息

G蛋白偶联受体二聚化在受体的转运和信号转导中起着重要的调节作用。为了验证甘丙肽2型受体(GalR2)是否形成同源二聚体,本实验分别构建了N端带FLAG和HA标签的GalR2融合蛋白,并转染到HEK293A细胞中。Western blot发现,除了相当于GalR2分子量的位置有条带之外,在大约2倍于GalR2分子量的位置也有条带,提示GalR2可能是以二聚体的形式存在的。共转染HA-GalR2和FLAG-GalR2,通过免疫共沉淀方法,在抗HA的免疫片段中检测到了FLAG的免疫活性,且在相当于单倍分子量和二倍分子量上均有条带;反过来,在FLAG的免疫片段中检测HA的免疫活性,条带同样出现在单倍分子量和二倍分子量上。以上结果表明甘丙肽2型受体之间形成了同源二聚体。

关键词：甘丙肽2型受体 G蛋白偶联受体同源二聚体免疫共沉淀

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5-HT_(1A)受体蛋白在PC12细胞膜转运的动态变化

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基础医学与临床 2010年第5期30卷 487-491页

作者：金艳燕吕琼闫竹青高尔静赵春礼张进禄徐志卿首都医科大学神经生物学系北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室北京100069

目的在神经元样PC12活细胞上进行实时、可视和定量研究5-羟色胺1A受体的时空分布、膜转运和信号传导机制。方法运用RT-PCR方法获得小鼠5-HT1A基因,并插入到pEGFP-N1真核表达载体中。采用阳离子脂质体方法将质粒转染至PC12细胞和HEK293... 详细信息

目的在神经元样PC12活细胞上进行实时、可视和定量研究5-羟色胺1A受体的时空分布、膜转运和信号传导机制。方法运用RT-PCR方法获得小鼠5-HT1A基因,并插入到pEGFP-N1真核表达载体中。采用阳离子脂质体方法将质粒转染至PC12细胞和HEK293细胞中,通过G418筛选出稳定表达5-HT1A-EGFP的PC12细胞系。运用激光共聚焦成像系统观察活细胞中5-HT1A-EGFP的表达情况,利用光漂白荧光恢复(FRAP)技术在PC12细胞膜局部漂白后观察5-HT1A-EGFP荧光蛋白在细胞膜上转运的情况。结果克隆所获得的小鼠5-HT1A基因是准确的。5-HT1A-EGFP蛋白清晰的分布于PC12和HKE293细胞膜上。通过FRAP技术观察到漂白区域的细胞膜在100s内有部分恢复,说明受体在细胞膜上发生转运。结论建立了稳定表达5-HT1A-EGFP融合蛋白的PC12细胞系,并利用活细胞成像和FRAP技术观察分析并证实了5-HT1A受体在PC12细胞的膜表面的表达和转运的动态变化。

关键词： 5-羟色胺1A受体(5-HT1A) G蛋白偶联受体(GPCRs) 绿色荧光蛋白(GFP) PC12细胞光漂白荧光恢复技术(FRAP)

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PINK1参与调节多巴胺的合成

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基础医学与临床 2012年第1期32卷 16-20页

作者：贾焕珍鲁玲玲龚普盛付越姣赵春礼段春礼杨慧首都医科大学神经生物学系北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室神经变性病教育部重点实验室北京100069

目的探讨PINK1基因对多巴胺合成的调节作用。方法用高压液相色(HPLC)电化学方法检测多巴胺(DA)含量,用Western blots和Real-Time PCR法检测DA合成限速酶酪氨酸羟化酶(TH)和多巴脱羧酶(DDC)的表达量,通过免疫共沉淀(Co-IP)和免疫组织化... 详细信息

目的探讨PINK1基因对多巴胺合成的调节作用。方法用高压液相色(HPLC)电化学方法检测多巴胺(DA)含量,用Western blots和Real-Time PCR法检测DA合成限速酶酪氨酸羟化酶(TH)和多巴脱羧酶(DDC)的表达量,通过免疫共沉淀(Co-IP)和免疫组织化学染色观察PINK1和TH之间是否存在相互作用。结果 PINK1基因敲减后,细胞内DA水平为5.356±0.536μg/L,显著低于对照组的11.630±1.559μg/L(P<0.05);TH mRNA和蛋白的表达分别为0.371±0.140和0.195±0.062,显著低于对照组的1.009±0.152和0.386±0.044(P<0.05);DDC mRNA和蛋白的表达分别为0.396±0.124和0.149±0.029,显著低于对照组的1.100±0.070和0.323±0.037(P<0.05);免疫荧光化学检测PINK1和TH存在共定位,Co-IP显示PINK1和TH存在相互作用。结论 PINK1可以通过调控DA的合成酶TH和DDC的表达影响DA的合成。

关键词： PINK1 RNA干扰酪氨酸羟化酶 MN9D细胞

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MicroRNA在建立DJ-1基因敲减细胞模型中的应用

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基础医学与临床 2011年第5期31卷 515-519页

作者：赵莎莎鲁玲玲高华吕瓅赵焕英杨慧首都医科大学神经生物学系北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室神经变性病教育部重点实验室北京100069

目的与传统的siRNA方法建立基因敲减模型不同,探讨合成microRNA（miRNA）在DJ-1基因敲减细胞模型中的应用。方法构建针对DJ-1基因的合成miRNA载体,合成DJ-1基因的siRNA干扰片段。在脂质体介导下,将上述两种小干扰RNA载体或片段分别转染M... 详细信息

目的与传统的siRNA方法建立基因敲减模型不同,探讨合成microRNA（miRNA）在DJ-1基因敲减细胞模型中的应用。方法构建针对DJ-1基因的合成miRNA载体,合成DJ-1基因的siRNA干扰片段。在脂质体介导下,将上述两种小干扰RNA载体或片段分别转染MN9D细胞系,应用real-time PCR和Western blot检测目的基因DJ-1的mRNA和蛋白表达。结果与对照组相比,转染合成microRNA的MN9D细胞中,DJ-1的mRNA水平下调90%（P〈0.05）,蛋白水平下调70%~85%（P〈0.05）;而转染siRNA的MN9D细胞中,DJ-1的mRNA水平下调50%~70%（P〈0.05）,蛋白水平下调20%~50%（P〈0.05）。结论 microRNA与siRNA均可作为基因敲减的重要研究手段。与传统的siRNA相比,合成microRNA对目的DJ-1的干扰效率更为显著。

关键词： DJ-1 microRNA siRNA RNA干扰

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甘丙肽2型受体在HEK293细胞中的表达及内化过程

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生物物理学报 2010年第5期26卷 373-379页

作者：吕琼金艳燕吴波路雅静李晓晓赵春礼徐志卿首都医科大学神经生物学系北京神经科学研究所北京神经再生修复研究重点实验室北京100069 首都医科大学组胚教研室北京100069 Departments of Neuroscience Karolinska Institutet

构建了在甘丙肽2型受体(GalR2)N端带myc表位标签的真核表达载体,并将其转染到HEK293细胞,进而应用免疫荧光细胞化学方法结合激光扫描共聚焦显微技术观察GalR2蛋白的亚细胞分布和膜转运过程。Western blot结果发现转染组myc-GalR2蛋白水... 详细信息

构建了在甘丙肽2型受体(GalR2)N端带myc表位标签的真核表达载体,并将其转染到HEK293细胞,进而应用免疫荧光细胞化学方法结合激光扫描共聚焦显微技术观察GalR2蛋白的亚细胞分布和膜转运过程。Western blot结果发现转染组myc-GalR2蛋白水平呈高表达。myc-GalR2主要分布在细胞膜上,少量分布于胞浆中。当给予甘丙肽(10-7mol/L)刺激后,5min时可见细胞膜上myc-GalR2明显减少,胞浆内myc-GalR2增多,15min时膜上myc-GalR2几乎全部消失。表明GalR2受体与配体结合后发生内化,且受体蛋白内化为时间依赖性的转运过程,证实在HEK293细胞GalR2会出现配体依赖性内化。同时,以已知膜蛋白5-HT1AR的内化作为对照,可见在给予甘丙肽刺激以后,5-HT1AR没有发生内化,受体蛋白仍然表达在膜上。此外,通过测定胞内钙水平激活情况来检测其信号通路激活情况,表明myc对GalR2功能没有明显影响。

关键词：表位标签甘丙肽2型受体(GalR2) G蛋白耦联受体(GPCRs) HEK293细胞膜转运

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甘丙肽抑制大鼠垂体腺瘤细胞体外侵袭性

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基础医学与临床 2011年第6期31卷 656-660页

作者：马克乾孙静李杰闫竹青鲁润春贾旺徐志卿首都医科大学神经生物学系北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室北京100069 北京市神经外科研究所北京100050

目的探讨甘丙肽对大鼠垂体腺瘤细胞侵袭性的作用及其受体机制。方法提取大鼠垂体腺瘤GH3细胞RNA,反转录后测定甘丙肽及其3个受体亚型的表达情况;将大鼠垂体腺瘤GH3细胞分为对照组、甘丙肽药物处理组和选择性甘丙肽2型受体激动剂AR-M1896... 详细信息

目的探讨甘丙肽对大鼠垂体腺瘤细胞侵袭性的作用及其受体机制。方法提取大鼠垂体腺瘤GH3细胞RNA,反转录后测定甘丙肽及其3个受体亚型的表达情况;将大鼠垂体腺瘤GH3细胞分为对照组、甘丙肽药物处理组和选择性甘丙肽2型受体激动剂AR-M1896组,利用MTT方法检测对照组和实验组在给药后12、24和36 h各分组细胞活力,观察其增殖情况;应用Transwell侵袭模型观察各组腺瘤细胞侵袭能力。结果甘丙肽与其3个受体亚型在大鼠垂体腺瘤GH3细胞中均有表达,其中以受体2表达量较高;各组细胞在药物处理12、24和36 h时细胞增殖无显著差异;GH3细胞Transwell侵袭实验中甘丙肽药物组侵袭细胞数量明显少于对照组(P<0.01);甘丙肽受体激动剂AR-M1896组与对照组相比腺瘤细胞侵袭性明显降低(P<0.05);AR-M1896与甘丙肽对GH3细胞的抑制效果差异无显著性。结论甘丙肽能明显抑制大鼠垂体腺瘤细胞的侵袭性,且此作用可能主要由甘丙肽2型受体介导。

关键词：脑垂体腺瘤侵袭性甘丙肽 GH3细胞 Transwell模型

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小鼠甘丙肽1型受体在HEK293A细胞中的表达和内化

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生物技术 2011年第5期21卷 30-34页

作者：李晓晓徐舒李慧宫夏霓徐志卿首都医科大学神经生物学系北京神经科学研究所北京神经再生修复研究重点实验室北京100069 Departments of Neuroscience Karolinska Institutet

目的:克隆小鼠甘丙肽1型受体(mGalR1)基因,构建其真核表达载体,并观察该基因在HEK293A细胞中的表达和内化。方法:应用RT-PCR方法,以小鼠下丘脑RNA为模板,扩增获得甘丙肽I型受体(mGalR1)基因并定向克隆到pEGFP-N1真核表达载体;mGalR1-pE... 详细信息

目的:克隆小鼠甘丙肽1型受体(mGalR1)基因,构建其真核表达载体,并观察该基因在HEK293A细胞中的表达和内化。方法:应用RT-PCR方法,以小鼠下丘脑RNA为模板,扩增获得甘丙肽I型受体(mGalR1)基因并定向克隆到pEGFP-N1真核表达载体;mGalR1-pEGFP表达载体瞬时转染HEK293A细胞,利用激光共聚焦显微技术观察mGalR1在给予甘丙肽(10-7mol/L)0、5、10、15min刺激时的内化情况。结果:克隆得到正确的mGalR1基因全长序列,其cDNA为1 047bp,共编码348个氨基酸;共聚焦显微镜结果表明mGalR1主要在膜上表达,经甘丙肽刺激5～15min后受体下膜进入胞浆。结论:成功构建真核表达载体mGalR1-pEGFP并在HEK293A中表达;在甘丙肽刺激下小鼠甘丙肽1型受体存在内化现象。

关键词：小鼠甘丙肽1型受体(mGalR1) 基因克隆真核表达载体 HEK293A细胞内在化

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Forskolin上调MN9D细胞Nurr1的表达及Nurr1过表达对酪氨酸羟化酶的影响

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解剖学报 2005年第4期36卷 342-345页

作者：赵咏梅张海燕刘扬赵春礼苏玉金李俊发徐群渊首都医科大学宣武医院北京100053 首都医科大学细胞生物学系北京100054 首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室北京100054

目的寻找能激活MN9D细胞内源性孤儿核受体(Nurrl)表达的信号分子,研究Nurrl表达增高对酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响,探讨激活Nurrl表达的信号机制。方法用蛋白激酶A激动剂Forskolin或蛋白激酶C激动剂PMA作用于MN9D细胞,用免疫荧光细胞化... 详细信息

目的寻找能激活MN9D细胞内源性孤儿核受体(Nurrl)表达的信号分子,研究Nurrl表达增高对酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响,探讨激活Nurrl表达的信号机制。方法用蛋白激酶A激动剂Forskolin或蛋白激酶C激动剂PMA作用于MN9D细胞,用免疫荧光细胞化学及Westernblot方法检测MN9D细胞内源性Nurrl表达的变化,以及Nurrl表达增加对TH表达的影响。利用PKA信号转导通路的特异性抑制剂H89探讨激活Nurrl表达的信号机制。结果1·从加入Forskolin1h起,直至6h,MN9D细胞Nurrl表达比未加Forskolin组明显增加(P<0·05);Forskolin主要增加MN9D细胞核内Nurrl含量,而细胞浆内Nurrl含量变化不明显;Forskolin作用后MN9D细胞TH表达无明显变化。2·用蛋白激酶A的特异性抑制剂H89预处理后,Forskolin仍具有增加Nurrl表达的作用。结论Forskolin可增加MN9D细胞内源性Nurrl表达及核转位,单纯Nurrl表达及核转位增加不影响MN9D细胞TH的表达,TH表达的激活可能还需要其他特殊的细胞(或神经元)环境或共激活因子的共同作用。Forskolin增加MN9D细胞内源性Nurrl表达及核转位的作用不是主要通过激活PKA信号转导通路完成的。

关键词：内源性孤儿核受体酪氨酸羟化酶蛋白激酶A 信号机制 MN9D细胞

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骨髓干细胞来源的星形胶质细胞参与脑损伤后胶质界膜的形成

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南方医科大学学报 2009年第12期29卷 2391-2393页

作者：邹西峰朱军李建民张海燕赵春礼徐群渊华北煤炭医学院附属医院神经外科河北唐山063000 首都医科大学北京神经科学研究所/北京市神经再生修复研究重点实验室/教育部神经变性疾病学重点实验室北京100069 首都医科大学细胞生物学系北京100069

目的探讨骨髓干细胞来源的星形胶质细胞是否参与脑损伤后胶质界膜的形成。方法将制作好的雌性Sprague-Dawley大鼠脑损伤模型24h后经尾静脉植入GFP标记的雄性Sprague-Dawley大鼠的骨髓源干细胞。在植入后2、4和8周取脑,用GFAP荧光免疫组... 详细信息

目的探讨骨髓干细胞来源的星形胶质细胞是否参与脑损伤后胶质界膜的形成。方法将制作好的雌性Sprague-Dawley大鼠脑损伤模型24h后经尾静脉植入GFP标记的雄性Sprague-Dawley大鼠的骨髓源干细胞。在植入后2、4和8周取脑,用GFAP荧光免疫组织化学方法显示星形胶质细胞,GFP显示骨髓来源细胞,观察损伤组织边缘的胶质界膜中是否存在GFP/GFAP双阳性细胞。结果在损伤组织边缘可见骨髓干细胞来源的星形胶质细胞。结论骨髓干细胞来源星形胶质细胞参与脑损伤后胶质界膜的形成。这对脑外伤的恢复和组织工程材料的植入有重要的意义。

关键词：骨髓源干细胞星形胶质细胞胶质界膜脑损伤绿色荧光蛋白

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