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首都医科大学学报 2010年第3期31卷 343-347页

作者：李继胜李尧华李昕于顺王年强高华孙晓红杨慧首都医科大学北京神经科学研究所北京神经再生修复研究重点实验室教育部神经变性病学重点实验室首都医科大学宣武医院老年病研究所神经生物学研究室教育部神经变性病重点实验室

目的制备帕金森病相关蛋白PINK1抗血清并检测其在大鼠脑组织中的表达特征。方法制备人PINK1基因重组蛋白,免疫新西兰大耳白兔获得抗PINK1抗血清;通过盐析法初步纯化、Western blotting法鉴定抗血清的敏感性和特异性、免疫组化法检测PINK... 详细信息

目的制备帕金森病相关蛋白PINK1抗血清并检测其在大鼠脑组织中的表达特征。方法制备人PINK1基因重组蛋白,免疫新西兰大耳白兔获得抗PINK1抗血清;通过盐析法初步纯化、Western blotting法鉴定抗血清的敏感性和特异性、免疫组化法检测PINK1在大鼠脑中的分布。结果人PINK1基因重组蛋白以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达;纯化蛋白制备兔抗血清经盐析纯化后,兔抗人PINK1抗血清特异性识别人PINK1基因重组蛋白及大鼠脑匀浆中40000和66000的蛋白质,与预期结果一致;免疫组化染色显示PINK1广泛分布在嗅球、皮质、海马、纹状体、小脑、黑质和红核。结论制备了一种兔抗人PINK1多克隆抗血清;PINK1广泛分布于大鼠中枢神经系统;为以后深入研究PINK1表达的组织分布、细胞内定位及其生物学功能提供了有效地实验工具。

关键词： PINK1 抗血清大鼠重组蛋白

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基因重组型人SORL1蛋白质片段的原核表达和纯化

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首都医科大学学报 2011年第6期32卷 798-801页

作者：李爽李尧华叶懿文李昕于顺杨慧陈彪首都医科大学宣武医院老年病研究所神经生物学研究室教育部神经变性病重点实验室北京100053 首都医科大学北京神经科学研究所北京市神经再生修复研究重点实验室教育部神经变性病重点实验室北京100069

目的制备基因重组型人SORL1蛋白质片段,为探讨阿尔茨海默病的发病机制提供实验基础。方法采用PCR方法扩增人sorl1 cDNA编码区5 923～6 260 bp片段,克隆入原核表达载体pET-28a(+)中。用大肠杆菌BL21(DE3)plysS表达重组质粒,用液相色谱法... 详细信息

目的制备基因重组型人SORL1蛋白质片段,为探讨阿尔茨海默病的发病机制提供实验基础。方法采用PCR方法扩增人sorl1 cDNA编码区5 923～6 260 bp片段,克隆入原核表达载体pET-28a(+)中。用大肠杆菌BL21(DE3)plysS表达重组质粒,用液相色谱法纯化基因重组蛋白。结果 PCR扩增产物为358 bp,其ATG和TGA之间的结构与人sorl1 cDNA的5 923～6 260 bp区完全一致。基因重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中高效表达,其表达产物存在于包涵体组分中。纯化的基因重组蛋白在SDS-PAGE中表现为单一条带,表观分子量约为13 000。结论人sorl1 cDNA的5 923～6 260 bp片段在原核细胞中大量表达,纯化后的基因重组蛋白可尝试用于抗体的制备。

关键词：含L(DLR类)A重复分拣蛋白相关受体基因重组蛋白阿尔茨海默病

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甘丙肽2型受体受泛素化调控的初步探讨

甘丙肽2型受体受泛素化调控的初步探讨

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中国神经科学学会第九届全国学术会议暨第五次会员代表大会

作者：宫夏霓路雅静李天翊徐舒杨予涛徐志卿首都医科大学神经生物学系北京神经科学研究所北京神经再生修复研究重点实验室

甘丙肽(Galanin)是一个广泛分布于神经系统和外周组织中的神经肽。通过与其受体结合,Galanin参与调节认知、觉醒、摄食、生殖等生理过程。目前已克隆出甘丙肽受体的三种亚型,它们都属于G蛋白耦联受体(GPCR)。本研究在瞬时转染人甘丙肽2... 详细信息

甘丙肽(Galanin)是一个广泛分布于神经系统和外周组织中的神经肽。通过与其受体结合,Galanin参与调节认知、觉醒、摄食、生殖等生理过程。目前已克隆出甘丙肽受体的三种亚型,它们都属于G蛋白耦联受体(GPCR)。本研究在瞬时转染人甘丙肽2型受体(GalR2)的HEK293细胞系中给予蛋白酶体抑制剂MG132共同培养,发现GalR2在细胞中发生积累。这提示GalR2在降解过程中可能涉及泛素-蛋白酶体途径。在前人对GPCR的研究中显示,泛素修饰的GPCR既可能经蛋白酶体途径降解,也有可能作为分选信号调控囊泡的转运。在酵母双杂交的工作中,我们用人GalR2的C端作为bait,人脑cDNA文库作为prey筛选与GalR2-C端相互作用的蛋白。在酵母双质粒转化验证成功的相互作用蛋白中,有部分是与催化泛素化相关的蛋白。这些蛋白中除了典型的蛋白-蛋白相互作用区域之外,还都存在一个具有E3泛素连接酶特征的结构域,如SOCS-box,F-box等。这从另一个侧面也提示GalR2可能受泛素化调控。

关键词：甘丙肽2型受体(GalR2) G蛋白耦联受体(GPCR) 泛素酵母双杂交

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甘丙肽2型受体在HEK293A细胞中的同源二聚化研究

甘丙肽2型受体在HEK293A细胞中的同源二聚化研究

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中国神经科学学会第九届全国学术会议暨第五次会员代表大会

作者：闫竹青初晓东吕琼金艳燕李杰马克乾杨予涛张进禄徐志卿首都医科大学神经生物学系北京神经科学研究所北京神经再生修复研究重点实验室

G蛋白偶联受体二聚化在受体的转运和信号转导中起着重要的调节作用。为了验证甘丙肽2型受体(GalR2)是否形成同源二聚体,本实验分别构建了N端带FLAG和HA标签的GalR2融合蛋白,转染到HEK293A细胞中。Western blot发现,除了相当于GalR2分子... 详细信息

G蛋白偶联受体二聚化在受体的转运和信号转导中起着重要的调节作用。为了验证甘丙肽2型受体(GalR2)是否形成同源二聚体,本实验分别构建了N端带FLAG和HA标签的GalR2融合蛋白,转染到HEK293A细胞中。Western blot发现,除了相当于GalR2分子量的位置有信号之外,在大约2倍于GalR2分子量的位置也有信号,提示GalR2可能是以二聚体的形式存在的。共转染HA-GalR2和FLAG-GalR2,通过免疫共沉淀的方法 ,在抗HA的免疫片段中检测到了FLAG的免疫活性,且在相当于单倍分子量和二倍分子量上均有条带;反过来,在FLAG的免疫片段中检测HA的免疫活性,条带同样出现在单倍分子量和二倍分子量上。以上结果表明甘丙肽2型受体之间形成了同源二聚体。

关键词：甘丙肽2型受体 G蛋白偶联受体同源二聚体免疫共沉淀

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甘丙肽与人垂体腺瘤侵袭性相关关系研究

甘丙肽与人垂体腺瘤侵袭性相关关系研究

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中国生理学会第23届全国会员代表大会暨生理学学术大会

作者：马克乾孙静鲁润春冉然杨予涛贾旺徐志卿首都医科大学神经生物学系北京神经科学研究所北京神经再生修复研究重点实验室

垂体腺瘤是颅内常见的良性肿瘤,占颅内肿瘤总数的15%。目前药物治疗效果欠佳,手术难以完全切除,术后内分泌缓解率低,复发率高。因此有必要对其侵袭生长方式机制进行研究,从而开发出新的诊治分子靶点。甘丙肽是脑内重要的神经肽之一,其... 详细信息

垂体腺瘤是颅内常见的良性肿瘤,占颅内肿瘤总数的15%。目前药物治疗效果欠佳,手术难以完全切除,术后内分泌缓解率低,复发率高。因此有必要对其侵袭生长方式机制进行研究,从而开发出新的诊治分子靶点。甘丙肽是脑内重要的神经肽之一,其受体有三个亚型,均属于G蛋白耦联受体家族,可参与许多大脑功能活动,包括情绪、学习和记忆、疼痛和镇痛、内分泌及摄食等过程,研究发现甘丙肽及其受体与下丘脑-垂体-肾上腺轴关系密切,且我们以往的工作也证明甘丙肽可以抑制肿瘤细胞的增殖。目的:探讨甘丙肽及其受体在垂体腺瘤侵袭性发生中的作用及其可能的机制,并进一步研究甘丙肽及其相关的调节因子是否可作为一种可能的治疗方法应用于临床。结果:通过实时定量PCR同时检测bFGF、甘丙肽及其三个受体亚型(甘丙肽受体1型、2型和3型)的表达,发现:(1)侵袭组中bFGF的表达高于非侵袭组,组间比较有显著性差异;(2)非侵袭组中甘丙肽的表达高于侵袭组,组间比较有显著性差异,而其三个受体亚型的表达组间的差别比较无显著性差异;(3)甘丙肽的表达与垂体腺瘤的侵袭性呈负相关。结论:甘丙肽可能可以作为评价垂体腺瘤侵袭性的生物学指标,且可能对垂体腺瘤侵袭性有抑制作用,有可能成为侵袭性垂体腺瘤临床诊治的新靶点。

关键词：垂体腺瘤侵袭性甘丙肽相关关系研究

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甘丙肽受体:表达,膜转运、分捡与信号传导

甘丙肽受体:表达,膜转运、分捡与信号传导

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中国生理学会第23届全国会员代表大会暨生理学学术大会

作者：徐志卿首都医科大学神经生物学系北京神经科学研究所北京神经再生修复研究重点实验室

甘丙肽是一种广泛分布于中枢神经系统和外周组织中的神经肽,目前甘丙肽受体有三个亚型已被克隆,即甘丙肽1型受体(GalR1)、甘丙肽2型受体(GalR2)和甘丙肽3型受体(GalR3),均为G蛋白偶联受体。大量的研究工作已证明,甘丙肽通过与其受体结... 详细信息

甘丙肽是一种广泛分布于中枢神经系统和外周组织中的神经肽,目前甘丙肽受体有三个亚型已被克隆,即甘丙肽1型受体(GalR1)、甘丙肽2型受体(GalR2)和甘丙肽3型受体(GalR3),均为G蛋白偶联受体。大量的研究工作已证明,甘丙肽通过与其受体结合参与许多生理和病理过程,例如我们以往的工作提示甘丙肽受体可以作为抗忧郁治疗的新药物靶点,因此对其深入研究将有助于阐述在抑郁症发生和治疗过程中的甘丙肽作用机制。我们发现GalR1和GalR2与甘丙肽结合后都会迅速发生笼型蛋白介导内化,但GalR1内化后在其C端的YXX(?)基序导引下,被转运到溶酶体降解。而GalR2内化后大部分会通过再循环回到细胞膜上复敏。此外,我们发现GalR2还存在配体非依赖性的固有内化。利用siRNA技术我们发现GalR2的信号传导除了通过G蛋白依赖性通路,还可以通过G蛋白非依赖性-视紫红质抑制蛋白依赖性通路。我们还发现,甘丙肽通过GalR2激活PI3 kinase信号通路而抑制PC12细胞的分化并引发细胞凋亡。用GalR2的C端作为bait进行酵母双杂交实验,我们筛选到以下九类与GalR2-C端相互作用的蛋白:(1)与受体内在化和转运相关;(2)参与磷酸化修饰;(3)氧化还原及能量代谢相关;(4)调控细胞凋亡;(5)与mRNA结合调控其剪接、编辑和翻译;(6)与DNA结合调控基因转录;(7)参与细胞粘附作用;(8)分子伴侣;(9)调控化学基团转移。提示GalR2在细胞内存在复杂的调控机制。

关键词：甘丙肽受体信号传导细胞凋亡

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癫痫的甘丙肽机制研究

癫痫的甘丙肽机制研究

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中国神经科学学会第九届全国学术会议暨第五次会员代表大会

作者：徐志卿首都医科大学神经生物学系北京神经科学研究所北京神经再生修复研究重点实验室

癫痫是常见的严重危害人类健康的慢性脑部疾病之一,约60%～80%的癫痫病人经过常规抗癫痫药物治疗发作可得到控制和缓解,但是,有一部分病人对药物治疗的效果较差,从新的角度开发寻找治疗的思路和靶点成为非常迫切的问题。甘丙肽（Galani...

癫痫是常见的严重危害人类健康的慢性脑部疾病之一,约60%～80%的癫痫病人经过常规抗癫痫药物治疗发作可得到控制和缓解,但是,有一部分病人对药物治疗的效果较差,从新的角度开发寻找治疗的思路和靶点成为非常迫切的问题。甘丙肽（Galanin）是脑内重要的神经肽之一,甘丙肽及其受体在中枢神经系统内有较广泛的分布,参与许多大脑功能活动,包括情绪、学习和记忆、疼痛、内分泌及摄食等生理过程。此外,越来越多的研究报道证明甘丙肽及其受体在癫痫的发病机制中可能起重要作用。如癫痫点燃动物模型可见导致齿状回甘丙肽源性神经支配纤维的缺失,海马内注入甘丙肽受体激动剂可终止惊厥的发作。甘丙肽基因缺失小鼠比野生型小鼠具有更高的惊厥发作易感性,更短的时间即可诱导惊厥的发作及导致更严重的惊厥发作症状。而过表达甘丙肽基因小鼠可通过抑制海马CA3区的谷氨酸释放和提高海马的后放电阈值以抑制惊厥发作的进展。应用Real-time PCR技术我们发现pilocarpine癫痫大鼠持续状态（status epilepticus,SE）后24小时,甘丙肽、GalR1、GalR3在背侧和腹侧海马表达增高;SE后7天,GalR1在背侧海马的表达增高,而galanin腹侧海马的表达增高;SE后8周,背侧海马GalR1表达增高,腹侧海马没有明显变化。提示在癫痫发作的急性期galanin、GalR1和GalR3变化较为明显,而在癫痫的潜伏期和慢性期以GalR1在背侧海马变化较为明显。同时,我们发现癫痫大鼠SE后24小时,背侧海马、腹侧海马、丘脑室旁核和丘脑前背侧核可看见甘丙肽阳性神经元,提示甘丙肽可能在颞叶癫痫活动扩布的脑核团内起重要的作用。以上结果提示,甘丙肽及其受体在癫痫发生的不同时相及不同部位可能发挥着不同的作用。

关键词：

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酵母双杂交筛选甘丙肽2型受体C端相互作用蛋白

酵母双杂交筛选甘丙肽2型受体C端相互作用蛋白

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中国生理学会第23届全国会员代表大会暨生理学学术大会

作者：宫夏霓路雅静杨予涛徐志卿首都医科大学神经生物学系北京神经科学研究所北京神经再生修复研究重点实验室

甘丙肽(Galanin)是一个广泛分布于神经系统和外周组织中的神经肽。通过与其受体结合,Galanin参与调节认知、觉醒、摄食、生殖等生理过程。过去的研究表明,甘丙肽2型受体(GalR2)具有抗抑郁的作用,因此我们对于GalR2进行了重点的研究。Ga... 详细信息

甘丙肽(Galanin)是一个广泛分布于神经系统和外周组织中的神经肽。通过与其受体结合,Galanin参与调节认知、觉醒、摄食、生殖等生理过程。过去的研究表明,甘丙肽2型受体(GalR2)具有抗抑郁的作用,因此我们对于GalR2进行了重点的研究。GalR2属于G蛋白耦联受体家族(GPCRs),其C端胞内区对激活下游通路和调控受体转运都起着重要作用。我们用人GalR2的C端作为bait,人脑cDNA文库作为prey进行酵母双杂交实验,筛选与GalR2-C端相互作用的蛋白。实验结果显示,与GalR2-C端相互作用的蛋白大致分为如下几类:1.与受体内在化和转运相关,如clathrin;2.参与磷酸化修饰;3.氧化还原及能量代谢相关;4.调控细胞凋亡;5.与mRNA结合调控其剪接、编辑和翻译,如含有RRM结构域的蛋白可参与mRNA前体的剪接;6.与DNA结合调控基因转录,如一些含有锌指结构的蛋白可以与DNA结合而调控转录;7.参与细胞粘附作用;8.分子伴侣;9.调控化学基团转移。这提示我们GalR2在细胞内存在复杂的调控机制。筛选和鉴定与GalR2-C端相互作用蛋白,可以为进一步研究GalR2分选、转运和调节的分子和细胞机制提供重要的实验依据和思路。

关键词：甘丙肽2型受体(GalR2) G蛋白耦联受体(GPCR) 酵母双杂交

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甘丙肽及其受体在抑郁症模型中的表达及相关性研究

甘丙肽及其受体在抑郁症模型中的表达及相关性研究

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中国生理学会第23届全国会员代表大会暨生理学学术大会

作者：王鹏孙静徐志卿首都医科大学神经生物学系北京神经科学研究所北京神经再生修复研究重点实验室

目的:抑郁症是常见的情感障碍之一。抑郁症的病因学机制涉及脑中单胺递质5-羟色胺(5-HT)和/或去甲肾上腺素(NA)系统的功能紊乱。5-HT和NE分别主要起源于脑干中缝核团和蓝斑(LC)并投射到海马和大脑皮层,甘丙肽在中缝背核与5-HT共存,在LC... 详细信息

目的:抑郁症是常见的情感障碍之一。抑郁症的病因学机制涉及脑中单胺递质5-羟色胺(5-HT)和/或去甲肾上腺素(NA)系统的功能紊乱。5-HT和NE分别主要起源于脑干中缝核团和蓝斑(LC)并投射到海马和大脑皮层,甘丙肽在中缝背核与5-HT共存,在LC与NE共存,并对这些神经元有调节作用。因此,探讨甘丙肽及其受体在抑郁症动物模型中的表达变化将有助于阐明抑郁症发病机理。方法:本实验构建慢性温和应激抑郁症动物模型(CMS),用激光捕获显微切割(LMD)的方法精确定位核团,检测甘丙肽及其受体在相关脑区的定位定量分析,以期进一步揭示甘丙肽及其受体在抑郁症中的作用机理。结果:(1)在Open Field实验中,CMS模型组大鼠表现为水平和垂直运动得分均较对照组显著减低。在强迫游泳实验(FST)中,CMS模型组表现出更多的行为绝望,与对照组相比不动时间增多,爬行时间减少。在体重增加量的测量结果为CMS模型组显著减低。在糖水偏好实验中,CMS模型组糖水引用百分比较对照组明显减低。因此,行为学实验均证明我们很好的复制了慢应激抑郁症模型。(2)我们利用LMD技术精确定位核团,结果发现在CMS模型中,海马结构齿状回和LC中的甘丙肽2型受体的mRNA出现上调,中缝背核内侧和中缝背核外侧中的甘丙肽1型受体的mRNA出现上调,而在所有脑区中Gal的mRNA水平均没有出现显著性变化。(3)在相关性研究中表明,LC中甘丙肽2型受体的mRNA表达水平与FST中爬行时间呈负相关。结论:甘丙肽可能是通过其受体参与了抑郁症发病过程,并且不同的受体在不同脑区在抑郁症的发病过程中发挥不同的作用。

关键词：抑郁症模型 CMS 甘丙肽中缝背核模型组相关性研究

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甘丙肽受体2型受体与β-arrestin在内化转运中的相互作用

甘丙肽受体2型受体与β-arrestin在内化转运中的相互作用

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中国生理学会第23届全国会员代表大会暨生理学学术大会

作者：闫竹青金艳燕吕琼杨予涛张进禄徐志卿首都医科大学神经生物学系北京神经科学研究所北京神经再生修复研究重点实验室

甘丙肽是一种含有二十九个氨基酸的神经肽,广泛分布于中枢神经系统和外周组织中,参与多种重要的生理和病理功能。目前已经克隆出三种甘丙肽受体,甘丙肽1型受体（GalR1）、甘丙肽2型受体（GalR2）和甘丙肽3型受体（GalR3）,均为G蛋白偶... 详细信息

甘丙肽是一种含有二十九个氨基酸的神经肽,广泛分布于中枢神经系统和外周组织中,参与多种重要的生理和病理功能。目前已经克隆出三种甘丙肽受体,甘丙肽1型受体（GalR1）、甘丙肽2型受体（GalR2）和甘丙肽3型受体（GalR3）,均为G蛋白偶联受体。本实验构建了带mRFP标签的β-arrestin真核表达载体,并将其转染到HEK293细胞上,进而应用免疫荧光细胞化学方法结合激光扫描共聚焦显微技术观察GalR2蛋白的亚细胞分布和膜转运过程。GalR2-EGFP主要分布在细胞膜上,少量分布于胞浆中,而β-arrestin-mRFP则只见于胞浆中。给予甘丙肽(10mol/L)刺激后,原本在胞浆中分布的β-arrestin在近膜处聚积,与GalR2-EGFP有共定位,随着时间的延长,受体内在化,并仍与β-arrestin共定位。用免疫荧光组化标记内源性β-arrestin,在稳定表达EGFP标记的GalR2融合蛋白的PC12细胞上,共聚焦显微镜下可以看到同样的现象。那么受体入胞后是否进入早期内涵体呢?将特异性定位于早期内涵体的蛋白EEA1进行免疫荧光标记,可以看到,受体入胞后与EEA1存在明显的共定位。然后选择较特异性定位于晚期内涵体的rab7进行标记,可以看到,给予刺激后,受体在胞内与rab7存在明显的共定位,且随着时间的延长共定位更加明显。本实验得出如下结论:配体激活后的GalR2与β-arrestin相互作用,共同内在化;内化后的GalR2转运到早期和晚期内涵体中。

关键词：甘丙肽受体 arrestin

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