目的:利用成簇规律性间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)相关蛋白9(CRISP associated protein 9,Cas9)技术构建微小核糖核酸-551b(miR-551b)基因敲除小鼠模型。方法:选择健康C57BL/6...
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目的:利用成簇规律性间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)相关蛋白9(CRISP associated protein 9,Cas9)技术构建微小核糖核酸-551b(miR-551b)基因敲除小鼠模型。方法:选择健康C57BL/6J小鼠,针对miR-551b外显子1区域,设计导向RNA(guide RNA,gRNA),构建Cas9载体质粒,将体外转录的Cas9 RNA及gRNA显微注射入小鼠的受精卵并体外培养。将培养合格的胚胎移植到代孕小鼠的输卵管中,待小鼠生育后得到F0代小鼠,使用基因测序确定基因敲除情况,与野生型小鼠繁育后,得到F1代杂合小鼠,F1代小鼠经自交繁育获得F2代小鼠,F3代小鼠由F2代纯合小鼠自交获得,采用电泳鉴定小鼠基因型,RT-PCR检测F3代小鼠组织miR-551b的表达。结果:利用CRISPR/Cas9技术构建模型小鼠得到F0代小鼠,通过测序筛选出缺失目标序列的F0代杂合子小鼠。与WT小鼠繁育后,琼脂糖凝胶电泳及测序筛选出F1代杂合小鼠,同样的方法鉴定并获得F2、F3代基因敲除小鼠,获取F3代纯合小鼠的心脏及下腔静脉样本,RT-PCR结果证实F3代纯合小鼠miR551b表达明显低于WT小鼠(P<0.05),成功敲除miR-551b基因。结论:通过CRISPR-Cas9技术成功构建miR⁃155基因敲除小鼠模型并稳定遗传,为进一步研究提供了有利条件。
目的通过标准的化学定义和基于小分子诱导方案(CDM3)促进人诱导多能干细胞心肌向分化,初步制备心肌补片,为进一步通过其他体外实验研究心肌补片成熟度以及体内动物实验研究其安全性提供实验数据和理论依据。方法复苏、培养和鉴定人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)后,将hiPSCs接种到覆有基质胶的聚己内酯(polycaprolactone,PCL)上,24 h后在荧光显微镜下通过DAPI荧光观察细胞生长情况,并通过OCT4荧光进行hiPSCs干性鉴定,固定后进行电镜扫描观察补片表面细胞形态。培养的第1 d、3 d、5 d、7 d分别通过CCK-8法测定细胞活力,绘制生长曲线观察细胞生长增殖情况。hiPSCs与PCL共培养24 h后,分为对照组、CDM3组,继续培养6 d,第8 d在荧光显微镜下通过DAPI荧光观察细胞生长情况,并通过OCT4荧光进行hiPSCs干性鉴定,通过cTnT和α-actin进行心肌细胞标志物鉴定。结果hiPSCs与PCL共培养24 h免疫荧光显示:OCT4发出绿色荧光,hiPSCs在PCL支架上保持干性。DAPI发出蓝色荧光,细胞呈克隆生长,细胞形态均一。扫描电镜显示,hiPSCs在覆有基质胶的PCL上黏附生长,细胞轮廓清晰可见,形态正常。CCK-8法细胞活力测定绘制生长曲线显示:hiPSCs在覆有基质胶的PCL支架上增殖生长。对照组与CDM3组继续培养6 d后,免疫荧光显示:对照组hiPSCs高表达干细胞干性标志物OCT4,不表达心肌标志物c T nT和α-a c t i n;C D M 3组明显表达心肌标志物c T nT和α-a c t i n,不表达干细胞干性标志物O C T 4。结论hiPSCs可以在覆有基质胶的PCL支架上增殖生长,在CDM3作用下,促进hiPSCs分化为心肌样细胞,初步制成心肌补片,为进一步临床治疗心肌梗死提供一种更好的治疗方法。
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