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Flt3配体增强HCV核心-包膜E2融合基因DNA疫苗诱导的细胞免疫应答

生物工程学报 2003年第2期19卷 158-162页

作者：柯金山赵平曹洁于嘉屏戚中田第二军医大学微生物学教研室上海200433 第二军医大学长征医院实验诊断科上海200003

建立一种可高效诱导细胞免疫应答 ,对丙型肝炎病毒 (HCV)感染可能起预防和治疗作用的DNA疫苗。将小鼠Flt3配体 (FL)信号肽和胞外段cDNA插入结构优化的HCV核心包膜E2融合抗原DNA疫苗pST CE2t,构建成pST CE2t FL。将pST CE2t FL转染COS7... 详细信息

建立一种可高效诱导细胞免疫应答 ,对丙型肝炎病毒 (HCV)感染可能起预防和治疗作用的DNA疫苗。将小鼠Flt3配体 (FL)信号肽和胞外段cDNA插入结构优化的HCV核心包膜E2融合抗原DNA疫苗pST CE2t,构建成pST CE2t FL。将pST CE2t FL转染COS7细胞 ,Westernblot和ELISA检测表明该重组质粒能表达HCV核心包膜E2融合抗原和可溶性小鼠FL。分别将pST CE2t、pST CE2t FL和空载体pCI neo肌肉注射接种BALB c小鼠 ,检测小鼠的体液和细胞免疫应答。结果表明两种DNA结构均能在小鼠体内诱生细胞和体液免疫应答 ,但pST CE2t诱导的体液免疫应答强于pST CE2t FL ,而后者诱导的细胞免疫应答明显强于前者。FL能明显增强HCV核心包膜E2融合抗原DNA疫苗诱导的细胞免疫应答 ,对于发展HCV预防和治疗性疫苗有潜在的应用价值。

关键词：丙型肝炎病毒 DNA疫苗 fms样酪氨酸激酶受体3配体细胞免疫应答

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HCV核心蛋白核酸疫苗转化的减毒鼠伤寒沙门菌在小鼠的免疫原性

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中国免疫学杂志 2003年第7期19卷 464-467页

作者：赵平柯金山曹洁戚中田第二军医大学微生物学教研室上海200433 第二军医大学长征医院实验诊断科上海200003

目的 :观察以减毒鼠伤寒沙门菌为载体的丙型肝炎病毒 (HCV)口服型核酸疫苗在BALB C小鼠的免疫原性 ,探讨用该免疫方法预防丙型肝炎的可行性。方法 :将HCV核心蛋白真核表达质粒pcDNA3 1core(核酸疫苗 )转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL72 0 7,... 详细信息

目的 :观察以减毒鼠伤寒沙门菌为载体的丙型肝炎病毒 (HCV)口服型核酸疫苗在BALB C小鼠的免疫原性 ,探讨用该免疫方法预防丙型肝炎的可行性。方法 :将HCV核心蛋白真核表达质粒pcDNA3 1core(核酸疫苗 )转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL72 0 7,将重组沙门菌和pcDNA3.1core分别口服或肌注接种BALB C小鼠 ,检测小鼠的体液和细胞免疫应答及观察其安全性。结果 :口服重组沙门菌或肌注接种核酸疫苗均在小鼠诱导相似水平的抗HCV核心蛋白IgG ,但口服重组沙门菌诱导的细胞免疫应答明显强于肌注接种核酸疫苗 ,未见小鼠出现明显毒副反应。结论 :减毒沙门菌作为HCV核酸疫苗的载体能增强其诱导的细胞免疫应答 ,这为研制高效免疫、成本低廉、接种方便的HCV疫苗提供了一个新的可行途径。

关键词： HCV 核心蛋白核酸疫苗转化减毒鼠伤寒沙门菌小鼠免疫原性

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人胚生殖嵴干细胞多能性调节基因Oct4的克隆及其在大肠杆菌中的表达(英文)

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第二军医大学学报 2003年第9期24卷 937-940页

作者：刘善荣王庆敏杨玲汤淑萍惠宁蒋正戚中田刘厚奇第二军医大学基础医学部组织胚胎学教研室上海200433 第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学长海医院妇产科第二军医大学基础医学部微生物学教研室

目的 :克隆人胚生殖系细胞多能性调节基因Oct4 ,并使其在大肠杆菌中表达。方法 :取 4～ 6周人胚胎分离生殖嵴和背侧肠系膜 ,利用RT PCR技术扩增编码Oct4的全长cDNA ,并插入到原核表达载体 pGEX5T中 ,构建成 pGEX5T Oct4重组质粒。β硫... 详细信息

目的 :克隆人胚生殖系细胞多能性调节基因Oct4 ,并使其在大肠杆菌中表达。方法 :取 4～ 6周人胚胎分离生殖嵴和背侧肠系膜 ,利用RT PCR技术扩增编码Oct4的全长cDNA ,并插入到原核表达载体 pGEX5T中 ,构建成 pGEX5T Oct4重组质粒。β硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导使该基因在k80 2菌中表达。结果 :用PCR方法扩增获得大小约 1 .1kb条带 ;全自动测序与GenBank中登录的序列 97%同源。获得了pGEX5T Oct4重组子并在k80 2菌中获得了表达 ,SDS PAGE分析有一特异性的 6 2 0 0 0条带。结论 :扩增和克隆了人胚生殖系细胞多能性调节蛋白Oct4全长cDNA并在大肠杆菌中获得表达。

关键词：人胚生殖嵴干细胞多能性调节基因 Oct4 克隆基因克隆基因表达

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人胚胎生殖系细胞分离与体外培养的初步研究

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第二军医大学学报 2003年第9期24卷 941-943页

作者：刘善荣刘厚奇汤淑萍惠宁冀凯宏熊俊蒋正戚中田第二军医大学基础医学部组织胚胎学教研室上海200433 长海医院妇产科基础医学部微生物学教研室

目的:初步探讨人胚胎生殖系细胞的分离与体外培养.方法:体外分离人胚胎生殖嵴和肠系膜组织,按单纯机械分离、酶消化分离、二者结合法及是否有饲养层将组织分为5种不同的方式培养后,用碱性磷酸酶标记,计数阳性克隆并进行比较.结果:酶消... 详细信息

目的:初步探讨人胚胎生殖系细胞的分离与体外培养.方法:体外分离人胚胎生殖嵴和肠系膜组织,按单纯机械分离、酶消化分离、二者结合法及是否有饲养层将组织分为5种不同的方式培养后,用碱性磷酸酶标记,计数阳性克隆并进行比较.结果:酶消化法培养所获得的克隆较单纯机械分离方法多,原代培养时种植到饲养层上效果较好.将分离到的组织用0.25%胰酶消化3 min,种植到丝裂霉素C处理过的小鼠胚胎成纤维细胞上培养3 d,挑取克隆传代,在第10天形成30.7 个阳性克隆,显著高于其他方法获得的阳性克隆数.用碱性磷酸酶标记的细胞(克隆)具有多样性,细胞胞体为圆形,分为有突起和无突起两种;阳性细胞克隆呈圆球形、条带形和块形,与周围细胞分界清楚.结论:人胚胎体内的微环境限制生殖系细胞的体外扩增培养,原代培养需要在饲养层上进行且宜用酶消化法尽早传代.

关键词：胚胎生殖系细胞细胞分离体外培养碱性磷酸酶

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不同发育阶段人胚胎原始生殖细胞的定位及体外培养

引用

第二军医大学学报 2003年第9期24卷 944-946页

作者：刘善荣刘厚奇汤淑萍惠宁冀凯宏蒋正戚中田冯根生第二军医大学基础医学部组织胚胎学教研室上海200433 长海医院妇产科基础医学部微生物学教研室 Burham InstituteSanDiegoCA92037USA

目的:对不同发育阶段的人胚胎原始生殖细胞(PGC)进行定位并比较其体外培养的差异.方法:取4～7周发育阶段的人胚胎,应用组织化学法检测PGC内碱性磷酸酶(AP)以对其定位.体外分离人胚胎生殖嵴和肠系膜组织进行培养,第1次传代后,用AP标记,... 详细信息

目的:对不同发育阶段的人胚胎原始生殖细胞(PGC)进行定位并比较其体外培养的差异.方法:取4～7周发育阶段的人胚胎,应用组织化学法检测PGC内碱性磷酸酶(AP)以对其定位.体外分离人胚胎生殖嵴和肠系膜组织进行培养,第1次传代后,用AP标记,计数不同发育阶段AP阳性的PGC和体外培养的阳性克隆并进行比较.结果:在卵黄囊、原肠、背侧肠系膜和生殖嵴处有AP强阳性细胞,阳性信号位于胞质内.阳性细胞散在分布,在生殖嵴处聚集成团.不同发育阶段的胚胎组织培养均有阳性克隆出现.统计学分析结果表明,4～7周人胚胎内AP阳性的PGC数目及细胞内信号强度无明显差异(P>0.05);由胚胎组织培养获得的AP阳性克隆数也无显著差异.结论:人PGC位于卵黄囊、原肠、背侧肠系膜和生殖嵴处.4～7周发育阶段,胚胎内PGC数目和体外培养的克隆数无明显变化.

关键词：胚胎原始生殖细胞体外培养定位碱性磷酸酶

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内皮抑素-血管内皮细胞抑制因子重组腺病毒对新生血管的抑制效应

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生物技术通讯 2003年第5期14卷 439-443页

作者：潘欣王泳张珉赵平潘卫戚中田第二军医大学微生物学教研室第二军医大学附属长海医院眼科上海200433

内皮抑素与血管内皮细胞抑制因子均为内源性新生血管抑制分子。为了探讨两分子融合后的生物学功能,以重组腺病毒为载体介导融合基因在体内外表达。体外实验表明重组腺病毒Ad-hENDO-VEGI151能够在ECV304、HepG2、L929等细胞中表达41000... 详细信息

内皮抑素与血管内皮细胞抑制因子均为内源性新生血管抑制分子。为了探讨两分子融合后的生物学功能,以重组腺病毒为载体介导融合基因在体内外表达。体外实验表明重组腺病毒Ad-hENDO-VEGI151能够在ECV304、HepG2、L929等细胞中表达41000大小的融合蛋白,对血管内皮细胞增殖有明显的特异性抑制作用,对HepG2和L929细胞无抑制作用(F=13112.13,P=0.0001)。体内实验表明Ad-hENDO-VEGI151重组腺病毒表达的融合蛋白可以显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管的生成;与AdLacZ对照组相比,Ad-hENDO-VEGI151对兔炎症性角膜新生血管的抑制明显(F=1413.11P=0.0001),免疫组化结果显示,融合蛋白主要在角膜上皮层表达;治疗荷肝癌裸鼠,注射Ad-hENDO-VEGI151的肿瘤体积(487.7±241.2mm3)与AdLacZ对照组(4075.9±1849.9mm3)差异显著(F=14.80P=0.0085),抑瘤率达到88.03%,免疫组化结果显示,胞膜染色阳性,Ad-hENDO-VEGI151组肿瘤的微血管密度30.75±3.31%与AdLacZ组50.25±8.65%差异明显F=17.72P=0.0056抑制率为39%。结果提示:重组腺病毒Ad-hENDO-VEGI151能够表达有生物学活性的融合蛋白,并发挥特异性的新生血管抑制作用。

关键词：内皮抑素-血管内皮细胞抑制因子重组腺病毒新生血管抑制效应生物活性

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内皮抑素-可溶性血管内皮细胞生长抑制因子融合基因重组腺病毒的包装与鉴定

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世界华人消化杂志 2003年第6期11卷 741-744页

作者：李喆潘欣潘卫曹贵松闻兆章方国恩戚中田毕建威华积德中国人民解放军第二军医大学附属长海医院普通外科上海市200433 中国人民解放军第二军医大学微生物学教研室上海市200433

目的:构建内皮抑素-可溶性血管内皮细胞生长抑制因子融合基因重组腺病毒载体并包装成重组腺病毒,为下一步基因治疗打下基础。方法:用PCR方法在hENDO基因的5’端引入IL_3信号肽、3’端引入弹性蛋白连接肽序列(linker),再与sVEGI基因连接... 详细信息

目的:构建内皮抑素-可溶性血管内皮细胞生长抑制因子融合基因重组腺病毒载体并包装成重组腺病毒,为下一步基因治疗打下基础。方法:用PCR方法在hENDO基因的5’端引入IL_3信号肽、3’端引入弹性蛋白连接肽序列(linker),再与sVEGI基因连接,插入到pCAl3腺病毒载体中,用脂质体介导包装出重组腺病毒,PCR法对重组腺病毒进行鉴定。结果:构建完成hENDO-sVEGI融合基因重组腺病毒载体,融合基因包括IL_3信号肽、hENDO全长基因、弹性蛋白连接肽序列和sVEGI基因,总长度约1114bp,经酶切鉴定、序列分析证实克隆序列、插入方向和读码框架均正确,可包装出携带融合基因的重组腺病毒,用TCID_(50)法测定粗制重组腺病毒滴度为2×10^(11) TCID_(50)/L。结论:成功构建了hENDO-sVEGI融合基因,连接肽序列使两蛋白空间构象不受影响,IL_3信号肽保证蛋白可被分泌至胞外,完成携带融合基因的重组腺病毒的包装与鉴定,为进一步开展肿瘤基因治疗研究奠定了基础。

关键词：内皮抑素可溶性血管内皮细胞生长抑制因子融合基因重组腺病毒包装鉴定基因治疗肿瘤

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乙型肝炎病毒表面—核心融合抗原和白细胞介素—12共表达DNA疫苗的免疫原性

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中华肝脏病杂志 2003年第7期11卷 443-443页

作者：柯金山赵平吴淑梅戚中田第二军医大学微生物学教研室上海200433 第二军医大学长海医院实验诊断科

乙型肝炎病毒(HBV)特异性细胞免疫应答对急性HBV感染的恢复起关键作用,其中HBV表面抗原和核心抗原均是重要的靶抗原.曾构建HBV表面-核心融合抗原DNA疫苗,可有效诱导小鼠细胞和体液免疫应答,为进一步增强该DNA疫苗诱导细胞免疫应答,在该... 详细信息

乙型肝炎病毒(HBV)特异性细胞免疫应答对急性HBV感染的恢复起关键作用,其中HBV表面抗原和核心抗原均是重要的靶抗原.曾构建HBV表面-核心融合抗原DNA疫苗,可有效诱导小鼠细胞和体液免疫应答,为进一步增强该DNA疫苗诱导细胞免疫应答,在该疫苗分子中增加了小鼠白细胞介素-12(IL-12)基因,观察IL-12对其免疫应答的影响.

关键词：乙型肝炎病毒 HBV 表面-核心融合抗原白细胞介素-12 DNA疫苗免疫原性基因表达

来源：评论

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内皮抑素-血管内皮细胞抑制因子重组腺病毒对荷胃癌裸鼠的治疗

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世界华人消化杂志 2003年第9期11卷 1282-1285页

作者：潘欣李喆张珉王泳潘卫戚中田中国人民解放军第二军医大学微生物学教研室上海市200433 中国人民解放军第二军医大学附属长海医院普通外科上海市200433 中国人民解放军第二军医大学附属长海医院眼科上海市200433

目的:研究重组腺病毒携带hENDO-VEGI_(151)融合基因治疗胃癌的可行性。方法:分别用 500 μL滴度为 1×10^(12)TCID_(50)/L的粗制重组腺病毒AdCA13—hENDO—VEGI_(151)或AdLacZ皮下注射治疗荷胃癌裸鼠,隔天1次,共注射10次。最后一次... 详细信息

目的:研究重组腺病毒携带hENDO-VEGI_(151)融合基因治疗胃癌的可行性。方法:分别用 500 μL滴度为 1×10^(12)TCID_(50)/L的粗制重组腺病毒AdCA13—hENDO—VEGI_(151)或AdLacZ皮下注射治疗荷胃癌裸鼠,隔天1次,共注射10次。最后一次注射24h后处死动物,检测肿瘤体积、抑瘤率、目的基因的表达、增生细胞核抗原指数(PCNA LI)、肿瘤细胞凋亡指数(AI)、肿瘤微血管密度(MVD)。结果:注射AdCA13-hENDO-VEGI_(151)的治疗组肿瘤体积为328±156mm^3,注射AdLacZ的对照组肿瘤体积为2356±1 140 mm^3,差异显著(F=12.42,P=0.0125),抑瘤率为86.1％;重组腺病毒携带的目的基因均能在荷胃癌裸鼠肿瘤组织中表达;治疗组PCNA LI为 0.13± 0.09％,对照组为 1.40 ± 0.53％,差异显著(F=22.30,P=0.0033);治疗组AI为5.09 ± 0.25％,对照组AI为0.61±0.67％,差异显著(F=155.13,P=0.0 001);治疗组MVD为0.06±0.03％,对照组MVD为 1.09 ± 0.76％,差异明显(F=7.38,P=0.0348)。结论:重组腺病毒携带的融合基因能在荷胃癌裸鼠体内表达出有生物学活性的融合蛋白,并表现出一定的抑瘤效果。

关键词：胃癌基因治疗动物实验 hENDO—VEGI151 重组腺病毒内皮抑素血管内皮细胞抑制因子新生血管

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内皮抑素-血管内皮细胞抑制因子重组腺病毒对新生血管的抑制效应

内皮抑素-血管内皮细胞抑制因子重组腺病毒对新生血管的抑制效应

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第五次全国医学分子微生物学学术研讨会

作者：潘欣王泳张珉赵平潘卫戚中田第二军医大学微生物学教研室上海200433 第二军医大学附属长海医院眼科上海200433

本文为了探讨两分子融合后的生物学功能,以重组腺病毒为载体介导融合基因在体内外表达。结果提示:重组腺病毒Ad-hENDO-VEGI151能够表达有生物学活性的融合蛋白,并发挥特异性的新生血管抑制作用。

关键词：内皮抑素重组腺病毒新生血管抑制效应

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