制备腐食酪螨过敏原第32组分(Tyr p 32)重组蛋白并鉴定其免疫反应性。从腐食酪螨总RNA扩增Tyr p 32的编码基因,插入pET-28a(+)载体中,将pET-28a(+)-Tyr p 32质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达后,用Ni柱进行层析纯化,用SDS...
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制备腐食酪螨过敏原第32组分(Tyr p 32)重组蛋白并鉴定其免疫反应性。从腐食酪螨总RNA扩增Tyr p 32的编码基因,插入pET-28a(+)载体中,将pET-28a(+)-Tyr p 32质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达后,用Ni柱进行层析纯化,用SDS-PAGE与Western blotting鉴定。收集过敏性哮喘和(或)鼻炎患儿血清,IgE-ELISA和IgE-Western blotting检测rTyr p 32与人腐食酪螨阳性血清结合率。将rTyr p 32与人支气管上皮细胞BEAS-2B共培养后,ELISA和qRT-PCR检测IL-6和IL-8细胞因子蛋白和mRNA表达水平,组间两两比较采用t检验。结果显示,获得Tyr p 32编码基因,全长为885 bp,Tyr p 32与Der p 32、Der f 32的氨基酸序列一致性分别为70.21%和68.03%。SDS-PAGE和Western blotting结果显示rTyr p 32相对分子质量约为35000 Da,与理论值一致。IgE-ELISA结果显示rTyr p 32与人腐食酪螨阳性血清的IgE结合率为41.38%(12/29)。当rTyr p 32与BEAS-2B细胞共培养后,rTyr p 32以浓度依赖性方式促进细胞上清中IL-6和IL-8的蛋白表达(t=-29.10,P=0.0012;t=-33.69,P=0.0009),并显著提高IL-6和IL-8 mRNA水平表达(t=-9.15,P=0.0117;t=-17.16,P=0.0034)。综上,成功制备具有免疫反应性的腐食酪螨过敏原重组蛋白rTyr p 32,为过敏性疾病组分诊断、特异性免疫治疗等提供了原料。
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