为了提高瘤胃细菌多样性研究中变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE）方法的准确性,本研究对DGGE的最佳变性剂梯度范围、PCR扩增程序和PCR产物处理方法进行了优化。设计DGGE变性剂浓度梯度为35%;0%、40%;0%...
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为了提高瘤胃细菌多样性研究中变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE）方法的准确性,本研究对DGGE的最佳变性剂梯度范围、PCR扩增程序和PCR产物处理方法进行了优化。设计DGGE变性剂浓度梯度为35%;0%、40%;0%和55%;5%,分别利用一步PCR和修补PCR（reconditioning PCR）对瘤胃细菌16S r DNA进行扩增;PCR产物分别经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（denatured polyacrylamide gel electrophoresis,d-PAGE）和绿豆核酸酶纯化;之后对DGGE凝胶图谱聚类分析,并选取部分DGGE条带割胶测序。结果表明,DGGE的变性剂浓度为40%;0%时,DGGE图谱中条带分离效果较好。修补PCR结合d-PAGE纯化在一定程度上可减少PCR产物中的单链DNA（singlestranded DNA,ss DNA）。通过聚类和条带割胶测序分析发现,不同处理方法条件下DGGE图谱条带分布不同,DGGE凝胶图谱中的单一条带并不能代表是单一菌种。本研究在用DGGE对瘤胃细菌群落多样性分析时使用40%;0%凝胶变性剂浓度,并用修补PCR结合d-PAGE纯化样品DNA可获得最佳效果。研究结果为瘤胃微生物样品DGGE分析提供了参考资料。
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